盧宏博，夏 寧，魏海峰

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023；2.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連116023；3.遼寧省近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

0 引言

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的含氮化合物排入水體，造成氮素的積累，使生物圈氮素循環(huán)失衡。常規(guī)的廢水脫氮工藝(硝化和異養(yǎng)反硝化脫氮工藝)存在耗能高、工藝流程長(zhǎng)和抗沖擊負(fù)荷能力弱等缺點(diǎn)[1]。近年來(lái)，隨著生物脫氮理論的出現(xiàn)[2]和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展[3-4]，以厭氧氨氧化工藝和短程硝化工藝為代表的新型生物脫氮技術(shù)已成為廢水脫氮領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題[5-7]。該工藝無(wú)需外加碳源和曝氣供氧，與傳統(tǒng)常規(guī)脫氮工藝相比，運(yùn)行費(fèi)用節(jié)省近40%，產(chǎn)泥量減少了90%[8]，是低耗高效的新型生物脫氮技術(shù)，也是水污染治理的新發(fā)展方向。

綜上，我國(guó)研究者主要從厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)、對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)器的影響因素、微生物特征及菌種的功能三個(gè)方向進(jìn)行了理論層次的大量實(shí)驗(yàn)室研究[16]，但對(duì)反應(yīng)器啟動(dòng)階段各環(huán)境指標(biāo)的變化特征和在實(shí)際工程中的應(yīng)用研究報(bào)道較少。同時(shí)在廢水生物處理系統(tǒng)中，厭氧氨氧化菌豐度較低，獲取足夠量且活性高的接種物是目前厭氧氧化工藝工程應(yīng)用所面臨的重大挑戰(zhàn)。本文以城市污水處理廠活性污泥為接種污泥，旨在從機(jī)理上探究并解釋厭氧氨氧化反應(yīng)在啟動(dòng)過(guò)程中水質(zhì)的pH變化、脫氮速率的變化和氮素相互的轉(zhuǎn)化等現(xiàn)象，并借助熒光原位雜交技術(shù)(FISH)鑒定分析活性污泥菌群的組成，為厭氧氨氧化工藝的工程應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行

采用如圖1所示的固定床反應(yīng)器模擬厭氧氨氧化反應(yīng)器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。固定床反應(yīng)器由有機(jī)玻璃柱制成，上端加蓋，反應(yīng)器分為上、中、下三個(gè)區(qū)域。上層區(qū)域設(shè)有進(jìn)水口和出水口，中層區(qū)域內(nèi)填有無(wú)紡布，下層區(qū)域內(nèi)填有懸浮顆粒生物填料。加入填料是為便于活性污泥中微生物的附著及增加微生物與水的接觸表面積。通過(guò)外置超級(jí)恒溫水浴箱，使水溫控制在(30±1)℃。反應(yīng)器外包裹一層黑布，為微生物營(yíng)造適宜的生殖環(huán)境。

圖1 ANAMMOX反應(yīng)器及工藝流程示意圖

1.2 人工廢水

1.3 化學(xué)分析

活性污泥菌群的組成鑒定分析采用熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization,FISH)進(jìn)行，F(xiàn)ISH基本原理是：如被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。FISH實(shí)驗(yàn)中使用的探針具體組成及雜交條件[10]如表1所示，探針由大連寶生物工程有限公司合成。

表1 FISH實(shí)驗(yàn)中所用探針及雜交條件

其中探針Eub338plus為真細(xì)菌的通用探針，采用Cy3熒光染料5’末端標(biāo)記，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為543nm、570nm，呈紅色，作為FISH實(shí)驗(yàn)中雜交的陽(yáng)性對(duì)照；Pla46是浮霉?fàn)罹?Planctomycetes)的通用探針，采用Cy5熒光染料5’末端標(biāo)記，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為630nm、670nm，呈紫色；異硫氰酸熒光素(FITC)是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素，主要用于熒光抗體技術(shù)中，能和各種抗體蛋白結(jié)合，且結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性[17]，本文以FITC為熒光染料在5’末端標(biāo)記，設(shè)計(jì)命名探針1102，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488nm、528nm，呈綠色，實(shí)驗(yàn)中采用共聚焦熒光顯微鏡觀察雜交結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 出水pH的變化

圖2 ANAMMOX反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中出水pH值隨時(shí)間變化情況

2.2 啟動(dòng)階段氮的變化情況

圖3 ANAMMOX啟動(dòng)過(guò)程中進(jìn)出水濃度及去除率變化

2.2.2 啟動(dòng)ANAMMOX反應(yīng)器階段亞硝酸氮的變化情況

圖4 ANAMMOX啟動(dòng)過(guò)程中進(jìn)出水濃度及去除率變化

2.2.3 啟動(dòng)ANAMMOX階段氮素的轉(zhuǎn)化

圖5 ANAMMOX啟動(dòng)過(guò)程中出水中及濃度的變化

2.3 反應(yīng)器填料及污泥顆粒度

2.3.1 反應(yīng)器填料

大量研究[32-33]表明，以無(wú)紡濾布作為填料，在反應(yīng)器運(yùn)行的1a中，厭氧氨氧化反應(yīng)出現(xiàn)在運(yùn)行的第50d后，第247d時(shí)總氮去除率達(dá)到 26.0kg/(m3·d)，這是目前報(bào)道中最高的氮去除負(fù)荷。本試驗(yàn)中在反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)，反應(yīng)器中間區(qū)域先填入無(wú)紡布，在第34d時(shí)，再向反應(yīng)器最下層填入懸浮顆粒生物填料。

圖6為附著AAOB菌群的無(wú)紡布聚酯纖維絲的掃描電鏡照片，由于無(wú)紡布聚酯纖維絲的孔隙率很大，纖維絲間互相纏繞交疊特點(diǎn)，使此材料的表面附著能力增強(qiáng)，可使得AAOB有效地附著在其表面，加快AAOB的培養(yǎng)速度。同時(shí)此填料還有抗沖擊力強(qiáng)、提高了系統(tǒng)的傳質(zhì)效率等優(yōu)點(diǎn)，此外無(wú)紡布有巨大的比表面積和恰當(dāng)?shù)谋戎兀粌H為異養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)提供了空間，而且最大限度地降低能耗，為自養(yǎng)型細(xì)菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件，為生物脫氨氮奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.3.2 ANAMMOX反應(yīng)器污泥顆粒度

通過(guò)測(cè)量可以觀察到實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)污泥顆粒的變化情況，所測(cè)污泥粒徑的比表面積為0.081m2/g，表面積平均粒徑為70.544μm，體積平均粒徑為155.805μm。污泥顆粒的形成有利于增加污泥的比表面積、代謝基質(zhì)的傳遞，調(diào)高反應(yīng)器的氨去除負(fù)荷和抗沖擊能力，同時(shí)污泥顆粒的出現(xiàn)使反應(yīng)器具備構(gòu)件混合菌種協(xié)作能力的潛力，混合菌種協(xié)作能力是有助于消除AnAOB敏感的不利因素，可降低AnAOB的繁殖環(huán)境條件要求。

2.4 FISH技術(shù)對(duì)反應(yīng)器菌群的鑒定

利用FISH技術(shù)將反應(yīng)器的活性污泥菌群組成進(jìn)行鑒定，并在共聚焦熒光顯微鏡下觀察反應(yīng)器中的菌群并進(jìn)行鑒定。圖7中紅色表示全菌，藍(lán)色代表浮霉菌，綠色代表AAOB，因水體中含有其他的能量源，供微生物繁殖和能量的轉(zhuǎn)化[34-35]，從右下角的三色疊加圖，可看出綠色斑點(diǎn)的數(shù)量較少，但是浮酶菌的數(shù)量相對(duì)較多[36]。圖中呈現(xiàn)的AAOB數(shù)量較少，有大量其他細(xì)菌存在，可以得出反應(yīng)器中已存在AAOB，反應(yīng)器啟動(dòng)取得一定的成效，但AAOB數(shù)量極少，仍需繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

圖6 附著ANAMMOX菌群的無(wú)紡布填料載體掃描電鏡照片

圖7 ANAMMOX反應(yīng)器中活性污泥的FISH圖像

3 結(jié)論

(2)反應(yīng)器中填充的兩種填料懸浮顆粒生物填料和無(wú)紡濾布，均能夠使AnAOB附著，增加活性污泥與基質(zhì)的接觸面積，加快了反應(yīng)器的啟動(dòng)速度。使用顆粒污泥的ANAMMOX具有較高的氨氮去除負(fù)荷和抗沖擊能力。

(3)本實(shí)驗(yàn)歷經(jīng)80多d，對(duì)反應(yīng)器的啟動(dòng)進(jìn)行了研究，在實(shí)驗(yàn)期間ANAMMOX系統(tǒng)負(fù)荷仍比較低，氨氮的去除率并不高，外界實(shí)驗(yàn)條件控制還需進(jìn)一步合理化，下一階段在反應(yīng)器中投加蒙脫石以期加速污泥顆粒的形成，進(jìn)而可能會(huì)加速反應(yīng)器的啟動(dòng)速度。