吳 昱，張占峰，郝書(shū)航，汪國(guó)基，底 妍，湯龍信

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率第三、病死率第四的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例達(dá)1200萬(wàn)，死亡60萬(wàn)，是目前威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，近年來(lái)結(jié)直腸癌患者逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，手術(shù)是其重要的治療手段[1-4]。阿片類藥物是常用的麻醉用藥，可以通過(guò)作用于免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞上的μ和Toll樣受體發(fā)揮作用[5]。芬太尼是一種常用的阿片類藥物，能夠與屬于G蛋白偶聯(lián)受體的μ受體結(jié)合，使其活化[6-7]，關(guān)閉電壓門控鈣離子通道，持續(xù)抑制腺苷酸環(huán)化酶從而減少cAMP的生成[8]，通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路來(lái)控制包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[9-11]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)，進(jìn)而為腫瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)提供血液和營(yíng)養(yǎng)支持[12]。同時(shí)，VEGF還能夠促進(jìn)血管通透性和纖維蛋白原外滲，給新生的腫瘤組織和血管提供良好的生長(zhǎng)條件[13]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，其中HIF-1α是功能性亞基決定著HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性，HIF-1α可以提供能量，促進(jìn)腫瘤組織的生長(zhǎng)和遷移[14]。VEGF-A是最主要的VEGF。本研究通過(guò)探討芬太尼對(duì)結(jié)直腸癌小鼠瘤體大小以及VEGF-A和HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性的影響，分析以芬太尼為代表的阿片類藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 6～8周齡SPF級(jí)雄性BALB/C小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物合格證號(hào)：冀醫(yī)動(dòng)管字703058號(hào))；枸櫞酸芬太尼注射液購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)：81D10011)；VEGF-A(E-MSEL-M0005)、HIF-1α(E-EL-M0687c)試劑盒購(gòu)自Elabscience公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；VEGF-A(ab46154)和HIF-1α(H1alpha67)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2動(dòng)物模型的建立及分組 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26(河北醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng))在37 ℃、5% CO2條件下，使用含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用0.25%胰酶消化，待其成為單細(xì)胞懸液后，使用10%胎牛血清中和殘余胰酶，然后離心，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并收集細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液備用。選取15只6～8周齡SPF級(jí)雄性BALB/C小鼠在室溫下飼養(yǎng)1周，在每只小鼠右前肢腋窩中部皮下注射CT26細(xì)胞1×106個(gè)，然后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。待腫瘤直徑>1 cm后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將15只小鼠隨機(jī)分為A、B、C組，每組5只。B組和C組分別給予枸櫞酸芬太尼注射液10和50 μg/(kg·d)腹腔注射，A組給予等量生理鹽水腹腔注射；連續(xù)給藥1周后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，收集小鼠心臟血液，同時(shí)分離小鼠的瘤體組織，觀察瘤體大小并用標(biāo)尺測(cè)量記錄。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1血清VEGF-A和HIF-1α水平：處死小鼠后獲取血液，然后離心取上層血清，參照VEGF-A和HIF-1α試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)各組血清VEGF-A和HIF-1α水平。

1.3.2瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA表達(dá)：應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA的表達(dá)水平，以B2M為內(nèi)參基因。VEGF-A[15]上游引物：5'-TCACCCCACTAATGGCACC-3'，下游引物：5'-TCCACTTCCCACCAACAGAC-3'，長(zhǎng)度為312 bp。HIF-1α[16]上游引物：5'-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-3'，下游引物：5'-CCCRGCAGTAGGTTTCTGCT-3'，長(zhǎng)度為90 bp。B2M[17]上游引物：5'-CGGCCTGTATGCTATCCAGA-3'，下游引物：5'-GGGTGAATTCAGTGTGAGCC-3'。取各組瘤體組織1 g剪碎，置于2 ml離心管，加入Trizol裂解液500 μl后置于冰上，使用電動(dòng)勻漿器勻漿至無(wú)肉眼可見(jiàn)團(tuán)塊。將100 μl氯仿加入含瘤體組織勻漿液的離心管中，充分混勻后于冰上靜置15 min，在4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min。吸取上層的澄清透明液體200 μl置于新的1.5 ml離心管中，并加入異丙醇200 μl震蕩混勻后在冰上靜置15 min，在4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min，棄上清，并加入75%乙醇500 μl，洗滌提取的mRNA。在4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min，后加入200 μl DEPC水，混勻后得到總mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)其說(shuō)明書(shū)配置10 μl反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ forever，得到cDNA。根據(jù)RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，用于PCR擴(kuò)增。設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以B2M為內(nèi)參照，記錄Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)各目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.3.3瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達(dá)：采用Western blot法檢測(cè)瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達(dá)水平。取各組瘤體組織1 g，按300∶1的比例加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，裂解組織并提取瘤體組織的總蛋白，用BCA定量的方法測(cè)定蛋白含量并計(jì)算，使每個(gè)樣本中總蛋白含量相同。然后加入蛋白上樣緩沖液混勻后水浴變性10 min。配置并使用10%的SDS-PAGE凝膠電泳，于60 V電壓下電泳90 min后轉(zhuǎn)至PVDF膜80 min，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加入VEGF-A和HIF-1α一抗常溫孵育2 h后，在4 ℃條件下過(guò)夜。用TBST清洗后加入二抗常溫孵育2 h。最后，通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce, Rockford, IL, USA)進(jìn)行顯影。使用Image J 1.47v(Rawak Software, Inc. Germany)軟件分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1腫瘤直徑和體積比較 B組和C組腫瘤直徑和體積均明顯小于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但B組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同劑量芬太尼處理結(jié)直腸癌小鼠3組腫瘤直徑和體積比較

2.2血清VEGF-A和HIF-1α水平比較 B組和C組血清VEGF-A和HIF-1α水平均明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但B組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同劑量芬太尼處理結(jié)直腸癌小鼠3組血清VEGF-A和HIF-1α水平比較

2.3瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA表達(dá)情況比較 B組和C組瘤體組織VEGF-A和HIF-1 α mRNA表達(dá)水平均明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但B組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同劑量芬太尼處理結(jié)直腸癌小鼠3組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA表達(dá)情況比較

2.4瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達(dá)情況比較 B組和C組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達(dá)水平均明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組瘤體組織VEGF-A蛋白表達(dá)水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但C組HIF-1α蛋白表達(dá)水平與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4和圖1。

表4 不同劑量芬太尼處理結(jié)直腸癌小鼠3組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達(dá)情況比較

圖1 不同劑量芬太尼處理結(jié)直腸癌小鼠3組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達(dá)情況

3 討論

本研究采用間斷腹腔注射芬太尼的方法，觀察不同劑量芬太尼對(duì)結(jié)直腸癌模型小鼠瘤體大小及VEGF-A、HIF-1α的影響，更為接近晚期結(jié)直腸癌患者的臨床情況，有比較好的臨床參考價(jià)值。

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26常用于建立小鼠結(jié)直腸癌的動(dòng)物腫瘤模型[18]。在臨床實(shí)踐中，芬太尼的常用劑量是2～8 μg/(kg·d)，小鼠的用藥量為人類的25～50倍[19]，故本研究用藥劑量為10和50 μg/(kg·d)。HIF-1α、VEGF-A能夠促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管的新生，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。有研究顯示，當(dāng)沉默HIF-1α后，直腸癌SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱[20]。HIF-1α過(guò)度表達(dá)后結(jié)腸癌HCTT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，而敲減HIF-1α后觀察到HCTT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱[21]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中VEGF表達(dá)明顯增高，VEGF的高表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤大小和Duke分期有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物[22]。

阿片類藥物可以通過(guò)阿片受體活化和Toll樣受體4通路激活MAPK(ERK 1/2)信號(hào)通路，Toll樣受體4通路已經(jīng)被證實(shí)具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[23]。有研究表明，嗎啡的代謝物3-葡萄糖醛酸嗎啡能激活Toll樣受體4，因此阿片類藥物被證明具有抗腫瘤生長(zhǎng)特性[24]。阿片類藥物可以通過(guò)c-Jun N末端激酶(JNK)來(lái)激活MAPK/ERK/JNK信號(hào)通路，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路從而下調(diào)HIF-1α[25]。VEGF能夠通過(guò)激活RhoA/Rho，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，而阿片類藥物通過(guò)作用于MAPK/ERK/JNK信號(hào)通路，從而抑制RhoA/Rho，降低腫瘤細(xì)胞的遷移能力[26-27]。另外，嗎啡也能抑制VEGF的合成[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，芬太尼也可以通過(guò)調(diào)控MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)，從而抑制胃癌的進(jìn)展[29]。

本研究結(jié)果顯示，10或50 μg/(kg·d)芬太尼均能夠明顯抑制結(jié)直腸癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，降低血清VEGF-A、HIF-1α水平以及瘤體組織VEGF-A、HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平，且50 μg/(kg·d)芬太尼對(duì)瘤體組織VEGF-A蛋白表達(dá)的抑制作用更好，但是對(duì)于其他檢測(cè)指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)10 μg/(kg·d)與50 μg/(kg·d)芬太尼比較具有差異。本文推測(cè)芬太尼可能是通過(guò)VEGF-A和HIF-1α抑制瘤體內(nèi)新生血管的生成，從而間接抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而這種抑制作用可能與芬太尼劑量相關(guān)。

本研究還存在一些不足，如芬太尼對(duì)VEGF-A和HIF-1α上下游相關(guān)通路的作用沒(méi)有進(jìn)行驗(yàn)證，未用阿片受體的特異性拮抗劑來(lái)進(jìn)行反向驗(yàn)證，也未使用VEGF-A和HIF-1α基因敲除鼠進(jìn)行對(duì)照，故還需要更多的證據(jù)來(lái)證明芬太尼與VEGF-A和HIF-1α之間的作用機(jī)制。

綜上所述，芬太尼能夠抑制結(jié)直腸癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，這種抑制作用可能是通過(guò)下調(diào)VEGF-A和HIF-1 α實(shí)現(xiàn)的，而且該作用可能與芬太尼的劑量相關(guān)。