張睿，張學(xué)堯，趙小明，馬恩波，張建珍?

1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009

0 引言

【研究意義】飛蝗（Locusta migratoria）是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要危害禾本科作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。表皮是昆蟲重要的組織結(jié)構(gòu)，呈層狀排列，具有保護(hù)蟲體免受機(jī)械損傷等功能。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮的重要組成成分之一，在昆蟲發(fā)育過程中，表皮不停地蛻去并再次形成，以適應(yīng)不斷成長(zhǎng)的蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)。在此過程中伴隨著幾丁質(zhì)不斷地合成、降解及組裝[2-4]。由于人類以及高等哺乳動(dòng)物均缺乏昆蟲所特有的表皮及幾丁質(zhì)，因此研究昆蟲表皮發(fā)育相關(guān)基因功能有助于害蟲防治新靶標(biāo)的挖掘。【前人研究進(jìn)展】幾丁質(zhì)的有序排列對(duì)昆蟲表皮層狀結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。首先幾丁質(zhì)需要形成有序排列的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，然后表皮蛋白與幾丁質(zhì)和醌類物質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)，才能形成層狀表皮，上述過程需要多個(gè)表皮蛋白參與。Knickkopf（Knk）是昆蟲蛻皮發(fā)育過程中的重要表皮蛋白[5]，可分為Knk、Knk2和Knk3 3類[6]。在果蠅（Drosophila melanogaster）中有3類Knk，其中理論上預(yù)測(cè)果蠅DmKnk3基因Skeletor有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本[7]。赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中，TcKnk、TcKnk2均只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，而TcKnk3的轉(zhuǎn)錄本卻有多個(gè)，TcKnk3除包括2個(gè)編碼全長(zhǎng)蛋白的轉(zhuǎn)錄本TcKnk3-FL-1和TcKnk3-FL-2外，還包括3個(gè)編碼縮短蛋白的轉(zhuǎn)錄本 TcKnk3-5′、TcKnk3-3′-1 和 TcKnk3-3′-2[6]。目前有關(guān)Knk家族蛋白功能的研究?jī)H在果蠅、赤擬谷盜中有報(bào)道。2002年，OSTROWSKI等[8]利用果蠅突變體首次鑒定Knk，并推測(cè)其可能參與表皮幾丁質(zhì)排列。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Knk是一個(gè)膜結(jié)合蛋白，通過糖基磷酯酰肌醇（GPI）錨定于質(zhì)膜上。DmKnk參與果蠅氣管、胚胎、翅盤原表皮幾丁質(zhì)纖維的裝配[9-10]。目前果蠅中尚無Knk其他家族蛋白的功能研究。免疫組化試驗(yàn)證明，TcKnk在赤擬谷盜新表皮中與幾丁質(zhì)共定位，負(fù)責(zé)保護(hù)新表皮不被幾丁質(zhì)酶降解。TcKnk缺失導(dǎo)致赤擬谷盜表皮幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)無法正常形成[11]。CHAUDHARI等[6]采用RNAi結(jié)合表型及透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)TcKnk家族基因出現(xiàn)了功能分化，TcKnk影響赤擬谷盜每一次蛻皮發(fā)育過程，而TcKnk2和TcKnk3-3′只影響其預(yù)成蟲期蛻皮發(fā)育。筆者課題組前期以飛蝗為試驗(yàn)材料，克隆獲得3個(gè)LmKnk（LmKnk、LmKnk2和 LmKnk3）基因，其中 LmKnk3擁有LmKnk3-FL和LmKnk3-5′兩個(gè)不同的選擇性剪切子，并采用RNAi的方法對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究，證明LmKnk和LmKnk3-5′與飛蝗發(fā)育及表皮形成有關(guān)[12-13]。LmKnk主要定位于飛蝗新表皮中[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】上述有關(guān)TcKnk和LmKnk的定位工作均是使用 DmKnk特異性抗體完成的[11,13]，尚缺乏源自飛蝗Knk蛋白家族的抗體，特別是飛蝗Knk3的特異抗體。制備LmKnk3-5′抗體，有利于從蛋白層面闡明LmKnk3-5′在飛蝗表皮形成及發(fā)育中的作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】經(jīng)氨基酸序列比對(duì)選取LmKnk3-5′特異抗原序列，進(jìn)行重組融合蛋白的表達(dá)純化及多克隆抗體制備，檢測(cè)抗體效價(jià)和特異性，明確LmKnk3-5′在飛蝗體壁組織的定位。為進(jìn)一步研究 LmKnk蛋白家族在飛蝗表皮形成中的功能分化及其與其他表皮蛋白的協(xié)同作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2018—2019年在山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 材料

供試?yán)ハx：飛蝗卵購于河北滄州飛蝗養(yǎng)殖基地，飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲室。控制室內(nèi)溫度為（30±2）℃、相對(duì)濕度為（40±10）%、光照14 h∶黑暗10 h。孵化后，以新鮮小麥幼苗飼養(yǎng)若蟲至3齡后，添加麥麩飼養(yǎng)。

主要試劑：pET-32a質(zhì)粒；限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III（New England Biolabs）；Taq酶、T4連接酶、RNAiso Plus、Recombinant RNase Inhibitor、Reverse Transcriptase M-MLV（TaKaRa）；SYBR Green（TOYOBO）；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA）；Goat serum（生工生物工程（上海）有限公司）；IPTG（索萊寶）；Bicinchoninic acid（BCA）（Sigma）；IRDye 680 LT goat anti-mouse IgM（LI-COR Biotechnology，Lincoln，NE）；Cy3標(biāo)記驢抗小鼠IgG（Servicebio）；蛋白Marker、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、DAPI染液（碧云天）；Ni-NTA柱（Promega）。

1.2 LmKnk3-5′特異抗原序列選擇

為找到制備 LmKnk3-5′抗體的特異性抗原序列，采用 GeneDoc軟件比對(duì) LmKnk家族成員 LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和 LmKnk3-5′的氨基酸序列，找出 3段特異序列，之后運(yùn)用 ExPASy在線軟件（http://web.expasy.org/compute_pi/）分別預(yù)測(cè)3段特異序列分子量大小以及等電點(diǎn)等基本信息。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)所選的特異性抗原序列 R1、R2和 R3及pET-32a原核表達(dá)載體的序列特性，分別設(shè)計(jì)引物，并在引物5′-末端添加BamH I或Hind III酶切位點(diǎn)，引物序列信息如表 1。以課題組前期測(cè)序驗(yàn)證的LmKnk3-5′全長(zhǎng) cDNA 序列作為模板，采用上述引物及2×Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后即為特異的抗原基因片段。將回收的抗原基因片段及pET-32a分別用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收后，再采用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1細(xì)胞，挑斑至液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，菌體PCR后凝膠電泳檢測(cè)，挑選陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證。

表1 LmKnk3-5′特異抗原序列擴(kuò)增所需引物Table 1 Primers for specific antigen sequences of LmKnk3-5′

1.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

1.4.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè) 將上述測(cè)序正確的重組質(zhì)粒 pET-32a-R1、pET-32a-R2和pET-32a-R3分別轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。接種單克隆至5 mL LB培養(yǎng)基中（氨芐抗性），恒溫?fù)u床培養(yǎng)（37℃，200 r/min）約5 h，直到OD600值升至 0.6—1.0，加入 IPTG（溶液中終濃度為 0.5 mmol·L-1），16℃低溫條件下過夜誘導(dǎo)表達(dá)約20 h。之后12 000×g離心5 min收集菌體，加入PBS緩沖液重懸菌體，反復(fù)凍融3次，再加入PMSF（蛋白酶抑制劑）進(jìn)行超聲破碎約15 min（工作2 s，間歇3 s，功率30%），直至溶液透亮。將上述超聲破碎產(chǎn)物在4℃低溫條件下12 000×g離心10 min，分離上清和沉淀。最后經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。

1.4.2 重組融合蛋白的純化 將重組蛋白以可溶形式表達(dá)的菌株接種至1 L氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，按照上述優(yōu)化條件搖菌，誘導(dǎo)菌株表達(dá)產(chǎn)生大量的重組蛋白。離心（4℃，8 000×g，20 min）收集菌體，加入 20 mL 上清提取試劑（20 mmol·L-1pH 8.0 Tris-HCl，5%甘油，100 mmol·L-1NaCl）使菌體懸浮，凍融3次后，加入PMSF蛋白酶抑制劑，超聲破碎（工作2 s，間歇3 s，功率40%）50 min至菌液透亮，4℃，12 000×g離心 20 min得上清用于純化。使用 Ni-NTA Agarose純化上述上清溶液以獲得目的蛋白，依次用ddH2O、8 mol·L-1尿素、ddH2O、上清提取試劑清洗和平衡Ni-柱，再將上清液緩慢上樣至Ni-柱中，使目的蛋白與 Ni-柱充分結(jié)合，收集流出的液體（FB），再用上清提取液洗脫，收集流出液（BB），之后依次用咪唑梯度液（10、20、50、100、200、500和 1 000 mmol·L-1）洗脫目的蛋白，收集洗脫液。采用 12%SDS-PAGE檢測(cè)各洗脫液中目的蛋白的純化情況，并用Image J軟件對(duì)掃描條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白純度。

1.5 LmKnk3-5′特異抗體制備以及效價(jià)檢測(cè)

1.5.1 抗體制備 SDS-PAGE檢測(cè)后，重組蛋白送至生工生物工程（上海）有限公司制備多克隆抗體。方法如下：純化后的目的蛋白與等體積的弗氏佐劑混合，第1天選取健康的4—6周齡BALB/c小鼠5只進(jìn)行初免，初免劑量為目的蛋白100 μg/只，第35天及第42天，弗氏不完全佐劑與目的蛋白混合進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，免疫量每次均為 50 μg/只，第 49天，尾部采血10 μL，ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)。第56天，弗氏不完全佐劑+蛋白抗原混合后再次進(jìn)行免疫，劑量仍為 50 μg/只，第 63天，眼球摘除采血，離心，收血清即為多克隆抗體。

1.5.2 抗體效價(jià)檢測(cè) 采用ELISA方法檢測(cè)抗血清效價(jià)是否達(dá)到要求。將重組蛋白抗原用pH 9.6，0.05 mol·L-1Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋至終濃度為 2 μg·mL-1，陽性血清從1 000倍開始用PBS緩沖液梯度稀釋，空白對(duì)照為PBS，陰性對(duì)照為1 000倍PBS稀釋的陰性血清，二抗為HRP-山羊抗小鼠（1∶8 000），加入底物溶液（TMB）反應(yīng) 15 min后再加 100 μL H2SO4（2 mol·L-1）終止反應(yīng)；450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。陰性血清與陽性血清OD值分別記為N和P，P/N≥2.1為陽性[14-15]。

1.6 LmKnk3-5′抗體特異性檢測(cè)

1.6.1 dsLmKnk3-5′的合成及注射 參照課題組已有的方法完成 dsLmKnk3-5′和 dsGFP（對(duì)照）的合成及注射[12,16-17]。選取飛蝗5齡第1天若蟲進(jìn)行dsRNA注射，20 μg/頭。

1.6.2 dsLmKnk3-5′注射后飛蝗體壁 LmKnk3-5′相對(duì)表達(dá)量 于飛蝗5齡第8天分別選取dsLmKnk3-5′和dsGFP組若蟲。解剖取飛蝗腹部第2—3腹節(jié)體壁，共設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3頭試蟲/重復(fù)。參照劉曉健等[18]的方法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR檢測(cè)注射 dsLmKnk3-5′后，LmKnk3-5′在飛蝗體壁中的mRNA相對(duì)表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參[19-20]。

1.6.3 Western blot檢測(cè)抗體特異性 于飛蝗5齡第 8天選取 dsLmKnk3-5′組蛻皮困難致死表型的個(gè)體和dsGFP組正在蛻皮的個(gè)體。共設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3頭試蟲/重復(fù)。根據(jù)于榮榮等[21]的方法抽提蛋白，即解剖取飛蝗腹部體壁，液氮中研磨后，置于離心管（1.5 mL）中，加入 500 μL 蛋白裂解液及 5 μL 100 mmol·L-1PMSF，超聲破碎后，冰上放置30 min，之后4℃ 12 000×g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，BCA法測(cè)定其蛋白濃度。

上述蛋白樣品（含 1 000 μg蛋白）經(jīng) 12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離；然后將其濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上[22]；再用TBST緩沖液（5% BSA，20 mmol·L-1pH 7.4 的 Tris-HCl， 150 mmol·L-1NaCl， 0.05%Tween-20）25℃封閉2 h；接著分別與 LmKnk3-5′多抗及β-actin單抗在4℃條件下孵育約12 h，用TBST洗膜3次，10 min/次；于37℃條件下將膜與IRDye 680 LT goat anti-mouse IgM（1∶5 000稀釋）孵育2 h后，再用TBST洗膜3次，10 min/次，采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey clx）對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行掃描。采用Image J軟件對(duì)掃描條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 免疫組化檢測(cè)LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁中的定位

為明確LmKnk3-5′在飛蝗體壁中的位置，取飛蝗5齡第1天若蟲，分別注射dsLmKnk3-5′和dsGFP，于5齡第8天選取dsLmKnk3-5′組蛻皮困難致死表型的個(gè)體和dsGFP組正在蛻皮的個(gè)體。解剖取飛蝗腹部第三腹節(jié)體壁，制備5 μm厚石蠟切片[23]，切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟處理后，浸入37℃ 3%雙氧水中10 min，然后浸泡在EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）中，微波爐加熱至沸騰后室溫自然冷卻，再用PBS（pH 7.4，含0.025% Triton X-100）洗3次，每次5 min。用10%羊血清室溫封閉 2 h，滴加 1∶1 000稀釋的自制LmKnk3-5′抗體，4℃過夜孵育。PBS洗滌后滴加1 000倍稀釋的Cy3標(biāo)記驢抗小鼠IgG，避光孵育（37℃，2 h），PBS洗3次，方法同上。使用1 000倍稀釋的DAPI染液，黑暗孵育（37℃，10 min），PBS清洗，方法同上。最后滴加抗熒光淬滅劑封片后，在正置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 LmKnk3-5′抗原序列的選擇

采用 GeneDoc軟件將 LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和 LmKnk3-5′的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，GenBank登錄號(hào)分別為 KR537807、MT080984、MT080985和MT080986。結(jié)果如圖1所示。圖中藍(lán)色實(shí)線框、橘色實(shí)線及綠色實(shí)線分別為選取的LmKnk3-5′的3段抗原序列區(qū)R1、R2和R3，三者所含的氨基酸殘基數(shù)分別為208、147和131。ExPASy等電點(diǎn)及分子量在線預(yù)測(cè)軟件分析結(jié)果表明，三者的理論分子量分別為24.0、17.0和14.8 kD，理論等電點(diǎn)分別為9.29、9.75和6.31。

圖1 GeneDoc比對(duì)獲得LmKnk3-5′特異性抗原序列Fig.1 LmKnk3-5′ specific antigen sequences obtained from GeneDoc alignment

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pET-32a-R1、pET-32a-R2和pET-32a-R3構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌中誘導(dǎo)表達(dá)后，采用SDS-PAGE法檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，IPTG誘導(dǎo)后pET-32a-R1、pET-32a-R3重組融合蛋白（即LmKnk3-5′的R1、R3的抗原肽段）在菌體裂解液的上清及沉淀中均未表達(dá)，只有 pET-32a-R2重組融合蛋白（即LmKnk3-5′的R2的抗原肽段）在菌體裂解液的上清中大量表達(dá)（紅色箭頭所示），且產(chǎn)物分子量大小接近預(yù)測(cè)的pET-32a-R2蛋白分子量，約33 kD。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)3個(gè)重組質(zhì)粒在BL21（DE3）中的表達(dá)Fig.2 Expression of three recombinant plasmids in BL21(DE3) detected by SDS-PAGE

2.3 重組蛋白純化

含重組質(zhì)粒pET-32a-R2的菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、親和純化后，SDS-PAGE法對(duì)收集到的各種洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，重組目的蛋白在200 mmol·L-1咪唑洗脫液中被大量洗脫下來，將掃描結(jié)果圖導(dǎo)入 Image J軟件，對(duì)掃描條帶進(jìn)行灰度分析。得到目標(biāo)蛋白純度大于85%，蛋白純度較高，洗脫蛋白總量達(dá)21 mg，可進(jìn)一步用于抗體制備。

圖3 pET-32a-R2純化后的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE detection after pET-32a-R2 purification

2.4 抗體效價(jià)及特異性檢測(cè)

將上述200 mmol·L-1咪唑洗脫液送上海生工生物工程有限公司制備 anti-LmKnk3-5′多克隆抗體后，用ELISA法檢測(cè)其效價(jià)，如表2，抗體稀釋倍數(shù)達(dá)512 000時(shí)，P/N值仍為陽性，效價(jià)高達(dá) 1∶512 000，說明anti-LmKnk3-5′多克隆抗體效果較好，可用于Western blot試驗(yàn)。

表2 LmKnk3-5′多克隆抗體效價(jià)測(cè)定Table 2 Titer determination of LmKnk3-5′ polyclonal antibody

使用RNAi結(jié)合RT-qPCR及Western blot的方法對(duì)抗體特異性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4，dsLmKnk3-5′注射后，飛蝗體壁LmKnk3-5′的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低（圖4-A）。Western blot結(jié)果表明，飛蝗體壁β-actin蛋白在dsGFP組與dsLmKnk3-5′組中表達(dá)量基本相同，而飛蝗體壁LmKnk3-5′蛋白在dsGFP組中條帶明顯，在dsLmKnk3-5′組中條帶明顯減弱（圖4-B），將Western blot掃描結(jié)果圖導(dǎo)入Image J軟件，對(duì)掃描條帶進(jìn)行灰度分析（圖4-C），結(jié)果表明dsLmKnk3-5′注射后，飛蝗LmKnk3-5′在蛋白水平的表達(dá)顯著降低，即anti-LmKnk3-5′多克隆抗體可以識(shí)別LmKnk3-5′，特異性良好。

圖4 Anti-LmKnk3-5′多克隆抗體特異性檢測(cè)Fig.4 The detection of anti-LmKnk3-5′ polyclonal antibody specificity

2.5 LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁中的定位

利用免疫組化方法分析LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁中的定位，結(jié)果如圖5，LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁皮細(xì)胞及新表皮中均有分布，在新合成的外表皮頂端信號(hào)更強(qiáng)。dsLmKnk3-5′處理后，LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁皮細(xì)胞及新表皮中的表達(dá)顯著下降。

圖5 LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁中的定位Fig.5 Localization of LmKnk3-5′ in the integument of abdomen in L.migratoria

3 討論

3.1 表皮蛋白LmKnk3-5′抗體制備的意義

昆蟲表皮由皮細(xì)胞分泌，沉積在皮細(xì)胞膜表面，呈層狀排列，具有彈性。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮組成成分之一，其有序排列是昆蟲表皮層狀結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)。昆蟲表皮幾丁質(zhì)有序排列通常是多個(gè)基因協(xié)同作用的結(jié)果[24]。在果蠅胚胎期氣管形成中發(fā)現(xiàn)Knk和Rtv形成膜復(fù)合體參與幾丁質(zhì)的排布[9]，對(duì)赤擬谷盜的研究發(fā)現(xiàn)Rtv特異性轉(zhuǎn)運(yùn)Knk到原表皮[25]，Knk與幾丁質(zhì)酶在新表皮中共定位，保護(hù)新表皮幾丁質(zhì)不被降解[11]。在果蠅氣管形成中已報(bào)道Obst-A與Serp和Knk形成復(fù)合體決定幾丁質(zhì)的排列[26]。因此，在通過基因功能解析鑒定了表皮幾丁質(zhì)排列的關(guān)鍵基因后，進(jìn)一步闡明這些關(guān)鍵基因在表皮發(fā)育中的協(xié)同作用關(guān)系，對(duì)于揭示表皮幾丁質(zhì)組裝的分子機(jī)制具有重要的意義，而這種互作關(guān)系的研究亟需制備相關(guān)蛋白抗體。

筆者課題組以世界重要農(nóng)業(yè)害蟲飛蝗為研究對(duì)象，從飛蝗整蟲及前胸腺等轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[27-28]獲得并驗(yàn)證了多個(gè)參與飛蝗表皮幾丁質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵基因，利用 RNAi方法對(duì)其功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明這些基因表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致飛蝗表皮發(fā)育障礙最終引起飛蝗死亡[12,29-30]。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)飛蝗 Knickkopf（Knk）家族成員 LmKnk、LmKnk2和LmKnk3（包括LmKnk3-FL及LmKnk3-5′兩種剪切體）均具有信號(hào)肽，都屬于分泌型蛋白。進(jìn)而采用RNAi技術(shù)沉默上述基因，結(jié)果表明只有沉默 LmKnk、LmKnk3-5′可影響飛蝗正常生長(zhǎng)發(fā)育及表皮形成，因此推測(cè)飛蝗Knk家族基因存在功能分化[12-13]。為進(jìn)一步從蛋白水平研究飛蝗Knk家族的功能分化，深入探究該家族蛋白與其他表皮蛋白在飛蝗表皮發(fā)育過程中的協(xié)同作用，亟需制備Knk家族蛋白的抗體。目前，僅有果蠅DmKnk完成抗體制備[9,11]，尚未報(bào)道其他昆蟲Knk家族蛋白的抗體。

3.2 LmKnk3-5′抗體制備條件優(yōu)化

由于抗體制備本身存在一定的難度及風(fēng)險(xiǎn)，為增加可以獲得特異性較高的鼠抗的概率，經(jīng)過序列比對(duì)，本文同時(shí)設(shè)計(jì)了 3段 LmKnk3-5′的特異性抗原區(qū)段R1、R2和R3，以期獲得可在菌體裂解液的上清液表達(dá)的重組融合蛋白，結(jié)果證明，只有 R2獲得了可在菌體裂解液的上清表達(dá)的重組融合蛋白，分析 R1和R3的失敗可能與抗原肽段的選擇、誘導(dǎo)表達(dá)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間及原核表達(dá)載體種類等多種因素有關(guān)。本研究為獲得可在菌體裂解液的上清表達(dá)的 LmKnk3-5′抗原蛋白，選擇較低濃度的 IPTG（0.5 mmol·L-1）、較低溫度（16℃）條件下進(jìn)行誘導(dǎo)。而低濃度IPTG、低溫、較短時(shí)間利于誘導(dǎo)可溶性蛋白的表達(dá)[31-32]。成功制備鼠源 anti-LmKnk3-5′多抗后，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，高達(dá) 1∶512 000，說明anti-LmKnk3-5′多抗效果良好。進(jìn)而通過 RNAi結(jié)合RT-qPCR及Western blot證明anti-LmKnk3-5′多抗特異性較好。

3.3 LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁的組織定位

課題組前期圍繞飛蝗Knk基因家族分子特性和生物學(xué)功能方面的研究結(jié)果表明，LmKnk3-5′在蛻皮前表達(dá)較高，且在飛蝗體壁組織中表達(dá)最高，參與飛蝗表皮發(fā)育[12]。因而本文最后利用 anti-LmKnk3-5′多抗，采用免疫組化試驗(yàn)對(duì)LmKnk3-5′進(jìn)行腹部體壁組織定位，發(fā)現(xiàn)飛蝗5齡若蟲蛻皮前LmKnk3-5′主要定位于新合成的外表皮頂端，這與 LmKnk的表皮分布模式明顯不同，LmKnk在飛蝗新表皮各部位均勻分布[13]。上述結(jié)果從蛋白水平為 LmKnk和 LmKnk3-5′的功能分化研究提供了新證據(jù)。

4 結(jié)論

成功制備了飛蝗 LmKnk3-5′的特異性抗體，可用于Western blot和免疫組化試驗(yàn)分析。LmKnk3-5′在飛蝗腹部體壁皮細(xì)胞及新表皮中均有表達(dá)，在新合成的外表皮頂端信號(hào)更強(qiáng)。注射 dsLmKnk3-5′可抑制LmKnk3-5′蛋白表達(dá)，減少飛蝗腹部體壁皮細(xì)胞和新表皮中LmKnk3-5′的蛋白含量。