楊興華 韓曉艷 李俊福 劉敏

家蠶絲素蛋白(silk fibroin protein， SF)因具有致孔性、可吸收性、良好生物相容性，而應(yīng)用于骨組織工程支架的研究[1]。但SF缺乏細(xì)胞活性因子、低抗壓性,難以滿足臨床需要。牙本質(zhì)硬度高，脫礦后暴露的牙本質(zhì)基質(zhì)(demineralized dentin matrix, DDM)含有大量對細(xì)胞調(diào)控的活性因子[2-3]。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)無免疫原性、毒性、保護(hù)藥物活性，可用作載體和交聯(lián)劑[4-5]。本研究嘗試以PEG為交聯(lián)劑結(jié)合SF、DDM材料優(yōu)點，構(gòu)建具有多孔、生物活性和抗壓的可吸收骨替代材料，以期應(yīng)用于臨床牙槽骨、頜骨骨量不足的治療。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

CCK-8試劑盒(CCK-8 kit, 廣州奕源生物科技)； 傅立葉紅外光譜儀(Tensor II 布魯克， 德國)； 掃描電鏡(JSM 6610LV JEOL， 日本)； BCA試劑盒 (北京PC0020 Solarbio)； ALP一抗(ab108337)、BMP-2一抗(ab14933)、RUNX2抗 (ab23981 )、I型膠原一抗(ab21286 )﹑OCN一抗 (ab13420)(abcam， 英國)；SD 大鼠(山東大學(xué)試驗動物中心)，動物試驗經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 SF溶液的制備 蠶絲洗凈、干燥后0.02 mol/L碳酸鈉溶液中脫膠、涼干，得到絲素；絲素在LiBr(摩爾濃度9.3 M)溶液中溶解、透析得到SF溶液；SF經(jīng)稀釋或者濃縮得到工作濃度。

1.2.2 DDM顆粒的制作 正畸拔除的健康年輕恒牙，經(jīng)拔髓、脫鈣、脫脂、清洗、晾干、冷凍后制成粒徑為100～500 μm的顆粒， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SF及SF-DDM膜的制備 6% SF溶液-20 ℃預(yù)冷12 h， -60 ℃真空冷凍干燥， 80%冷乙醇浸泡，去離子水沖洗、凍干，得到SF膜。SF膜粉碎為100～500 μm的顆粒濕潤后與DDM以體積比9∶1(10%)、 7∶3(30%)、 5∶5(50%)混合加入試件模具，滴加含1% PEG6000的6% SF溶液至液平，經(jīng)預(yù)冷凍、冷干、異構(gòu)、沖洗、干燥得到DDM-SF生物膜。

DDM-SF生物膜性能測定：支架孔徑采用電競下根據(jù)標(biāo)尺測量10 個不同位點的孔徑取均值。孔隙率的測量：室溫下制作的材料浸入正己烷5 min，浸入前體積V1，浸入后體積V2和材料取出后體積V3，采用公式致孔率&%=(V1-V3)/(V2-V3)得出。壓縮強(qiáng)度測定：萬用電子力學(xué)測試機(jī)測得的材料力學(xué)數(shù)值取均數(shù)(n=3)。

1.2.4 紅外光譜儀測定 將生物膜各成份加工成粉末,KBr 壓片制樣，傅立葉紅外光譜儀測試， 4500～400 cm-1吸光度掃描，得到紅外吸收光譜。

1.2.5 X-Ray Diffraction(XRD)檢測生物材料的空間結(jié)構(gòu) 樣品表面研磨拋光，制樣、X射線衍射儀上架、設(shè)置參數(shù)、測試、檢索。

1.2.6 大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow stem cells rBMSCs)的體外培養(yǎng)、鑒定 2 周齡大鼠截取股骨沖洗髓腔、全血貼壁培養(yǎng)。貼壁第二代細(xì)胞經(jīng)CD11b、CD29、CD44、CD45、CD90流式細(xì)胞儀檢測；細(xì)胞以5×105個/mL鋪板進(jìn)行成脂、成骨、成神經(jīng)元樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)。

1.2.7 CCK-8對生物膜表面干細(xì)胞活性檢測 無菌條件下生物膜剪成小片覆蓋96 孔板底部, SF為對照組、含DDM膜為試驗組， 5×105個/mL rBMSCs接種于膜,進(jìn)行1～7 d的CCK-8檢測。檢測時取酶標(biāo)儀450 nm處培養(yǎng)基的吸光光度值(A值)。

1.2.8 生物膜對干細(xì)胞分化檢測 1×106個/mL rBMSC接種DDM-SF膜上。SF為對照組和含DDM為試驗組。1、 3、 5 周時，采用研磨法提取細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行ALP、RUNX2、COL-1、BMP-2的蛋白印染檢測(Western blot)、掃描電鏡(SEM)檢測1 周時生物膜上的細(xì)胞。

1.2.9 大鼠顱骨極限缺失模型的建立和修復(fù) SD雄性成年大鼠麻醉后，顱骨制備直徑5 mm極限骨缺損區(qū)。含1×106個 /mL細(xì)胞的30% DDM-SF膜(試驗組)、SF膜(對照組)分別放置入5 mm顱骨缺損中，術(shù)后2、 4、 12、 24 周取出膜，進(jìn)行HE染色和RUNX2、COL-1、 OCN組化免疫染色檢測。

2 結(jié) 果

2.1 制備的DDM-SF膜特性

生物膜呈白色、多孔、有彈性，孔徑(圖 1)隨DDM比例的增加而逐漸縮小，比較各組間孔徑(Newman-Keuls多重比較測試，P<0.05)有差異。生物支架壓縮強(qiáng)度(圖 1)，生物支架壓縮強(qiáng)度隨牙本質(zhì)比例的增加逐漸增大，各組間壓縮強(qiáng)度(單因素方差分析P<0.000 1，P<0.05 )有差異。30% DDM-SF孔隙率82.99%±0.3433%。DDM-SF生物膜與SF膜的孔徑、壓縮強(qiáng)度對比如下(圖 1)

圖 1 DDM-SF膜的孔徑和壓縮強(qiáng)度

2.2 DDM-SF生物膜傅立葉紅外光譜檢測

測得的SF(圖 2A)特征吸收峰出現(xiàn)在3 500 cm-1的酰胺基；牙本質(zhì)的吸收特征波長(圖 2B)為1 033 cm-1處磷酸根、 1 385 cm-1處碳酸根、 3 442.20 cm-1、 1 631.92 cm-1氮氫鍵。PEG特征吸收峰(圖 2C)體現(xiàn)在2 886 cm-1為O-H鍵。在DDM-SF生物支架(圖 2D)中SF 1 631 cm-1和3 442 cm-1處譜峰為酰胺鍵中-CN伸縮振動和-NH面內(nèi)變形振動，PEG在峰值2 886 cm-1C=O鍵伸縮振動，-CO-NH形成。紅外光譜圖如下(圖 2)。

圖 2 DDM-SF膜傅里葉紅外光譜圖

2.3 XRD檢測數(shù)據(jù)分析

經(jīng)軟件Jade5.0分析：DDM-SF材料的結(jié)晶度好，存在無機(jī)鹽衍射峰，材料具有三維有序結(jié)構(gòu)。

2.4 rBMSCs的細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定

培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞呈多角形、短梭形。第二代干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測:CD29、CD44、CD90呈陽性,CD11b、CD45呈陰性。誘導(dǎo)后的rBMSC茜素紅染色

為陽性、油紅O染色呈粟狀紅色、NSE免疫熒光染色呈陽性。

2.5 在DDM-SF膜上rBMSC的cck-8檢測結(jié)果

DDM-SF膜、SF膜在1～7 d的時間內(nèi)培養(yǎng)基A值(圖 3 )1～3 d均緩慢下降， 4 d之后DDM-SF膜A值提升快于SF膜。對照組與試驗組 A way ANOVA 檢驗, 具有差異顯著性(P<0.05)。30% DDM-SF對細(xì)胞生長促進(jìn)效果最佳。酶標(biāo)儀 450 nm(n=6)處測CCK-8培養(yǎng)基吸光度A值如下：

圖 3 BMSCs的增殖曲線(CCK-8實驗)

2.6 SEM對DDM-SF結(jié)構(gòu)及rBMSC的觀測

DDM與SF結(jié)合緊密，生物膜呈多孔狀(圖 4A)，DDM散在分布。隨著DDM比例的增加，支架孔隙率在減少。rBMSC在生物膜表面3 d時貼壁欠佳， 1 周時與DDM-SF貼壁，細(xì)胞舒展(圖 4B)。

圖 4 DDM-SF結(jié)構(gòu)與貼壁細(xì)胞(SEM)

2.7 接種rBMSC的DDM-SF不同時間段提取蛋白Westernblot檢測結(jié)果

RUNX2表達(dá)較晚且隨時間逐漸增強(qiáng)。ALP、Col-1有較早表達(dá)，ALP在第三周時表達(dá)最為充分，30% DDM-SF對成骨分化促進(jìn)最佳(圖 5)。

圖 5 Western blot檢測BMSCs-DDM-SF隨時間蛋白生成變化

2.8 生物膜在植入大鼠顱骨缺損區(qū)組織化學(xué)免疫染色結(jié)果(圖 6)

COL-1第2 周時局部有弱的表達(dá)(圖 6A)， 4、 12 周時在牙本質(zhì)凹陷內(nèi)表達(dá)顯著， 24 周COL-1最顯著(圖 6B)。RUNX22 周時表達(dá)陰性(圖 6C)， 4 周在DDM凹陷處出現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)(圖 6D)， 24 周時RUNX2表達(dá)廣泛但強(qiáng)度下降。OCN出現(xiàn)最晚， 12 周開始出現(xiàn)表達(dá)( 圖 6E)， 24 周時有較強(qiáng)表達(dá)(圖 6F)。免疫組化顯示： COL-1、RUNX2、OCN隨時間延長依次表達(dá)。

圖 6 DDM-SF在植入動物體內(nèi)的免疫組化染色(×200)

2.9 SF、 30% DDMSF在動物體內(nèi)的HE染色結(jié)果

HE染色顯示6%SF膜結(jié)構(gòu)呈連續(xù)性孔的結(jié)構(gòu)。SF膜體內(nèi)修復(fù)骨缺損2 周時細(xì)胞散在支架空隙中，在4 周時(圖 7A)細(xì)胞增殖明顯， 12 周時高倍鏡下細(xì)胞在膜局部區(qū)域密集，增殖較快，充滿整個通道；孔隙較大的區(qū)域細(xì)胞稀疏(圖 7B)。 24 周時絲素蛋白大部吸收。試驗組30% DDM-SF與SF膜比較組織形成分散均勻， 4 周時(圖 7C)類成骨細(xì)胞和類骨質(zhì)在牙本質(zhì)表面附近出現(xiàn)； 12 周時細(xì)胞、類骨質(zhì)和成骨細(xì)胞更加豐富； 24 周時類骨質(zhì)在DDM吸收的凹陷處形成明顯(圖 7D)。

圖 7 SF膜、DDM-SF膜植入動物體內(nèi)不同時間段HE染色(×100)

3 討 論

3.1 孔徑對生物膜及組織工程支架承載細(xì)胞功能的影響

骨組織工程中支架的孔狀結(jié)構(gòu)為種子細(xì)胞提供附著、代謝、遷移的空間，理想的空隙直徑在100～300 μm之間[6-9]。30% DDM-SF制作的生物膜孔隙直徑為(106.637 0±25.445 4) μm、孔隙率為82.99%，適合細(xì)胞進(jìn)行正常的生理活動。當(dāng)DDM比例增加至50%時，孔徑<100 μm，不適合再作為骨組織工程支架。XRD顯示生物膜為DDM散布其間的多孔立體結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞的生長。在HE染色的局部剖面中顯示膜適宜孔徑通道對細(xì)胞增殖遷移較佳，局部過大或過小的孔徑不利于細(xì)胞的遷移、增殖。

支架孔的制備方法中冷凍干燥法工藝相對簡單,為常采用的孔隙制備方法[10]，但膜的孔徑、孔隙率與濃度呈反比,孔隙率隨冷凍溫度的降低而升高。DDM-SF經(jīng)-20 ℃預(yù)冷凍保留了孔的較大直徑,再經(jīng)-60 ℃凍干增加了材料的致孔率，與有關(guān)研究一致[11]。

3.2 DDM和PEG在絲素蛋白支架生物材料中的作用

成骨材料需要承受生理壓力，來維持正常的功能，壓縮強(qiáng)度是一個重要指標(biāo)。研究資料顯示SF支架的壓縮強(qiáng)度與濃度呈正相關(guān)，同等條件下凍干制備的材料強(qiáng)度更佳[5,12]。目前SF支架的研究濃度多集中在1%～15%之間，不能承受骨在功能狀態(tài)下的壓縮，需生物羥基磷灰石、殼聚糖以及加入交聯(lián)劑等方法提高材料力學(xué)性能[13]。本研究中以PEG為交聯(lián)劑[14]，PEG與DDM、SF可形成共價鍵，使DDM-SF壓縮強(qiáng)度顯著提高，同時PEG增加了生物膜的柔韌性[15]。但PEG具有一定的溶解性，易致細(xì)胞培養(yǎng)基變渾濁，使用濃度不宜過高。

在DDM-SF膜中DDM另外一個重要功能是作為細(xì)胞調(diào)控因子使用，也可以為成骨提供原材料[16]；100～1 000 μm粒度的DDM被認(rèn)為更有利于新骨形成[17]，生物活性因子主要存在于有機(jī)基質(zhì)內(nèi)[18]。rBMSC接種到DDM-SF生物膜經(jīng)體內(nèi)、外培養(yǎng)，經(jīng)WB檢測RUNX2、BMP-2、ALP、Col-1等成骨蛋白有顯著性表達(dá)；HE染色、組織化學(xué)免疫染色顯示有類成骨細(xì)胞廣泛分布及類骨質(zhì)樣組織形成，驗證了DDM對成骨的誘導(dǎo)性。牙本質(zhì)及DDM在牙髓病治療和牙種植骨量不足臨床患者中使用具有Bio-Oss同樣的成骨效果[3,19]。

3.3 DDM-SF支架膜的生物相容性和應(yīng)用展望

絲素在多項研究中認(rèn)為是無細(xì)胞毒性的可吸收材料[20], 在模擬體內(nèi)骨細(xì)胞生長環(huán)境中多孔絲素支架承載的細(xì)胞生長正常并有羥基磷灰石的沉淀以及類骨小梁細(xì)胞的出現(xiàn)[21]。SEM和CCK-8檢測到細(xì)胞初期抑制，考慮與SF、DDM的材料處理試劑殘留有關(guān)。生物膜在動物體內(nèi)經(jīng)HE染色、組織化學(xué)免疫染色切片中未見炎性細(xì)胞浸潤,也驗證了生物膜沒有排斥反應(yīng)；生物膜24 周時組織切片中細(xì)胞成分占據(jù)大部分,SF、DDM也大部吸收，說明DDM-SF具有良好的生物相容性、可吸收性。

綜上， 由于SF、牙本質(zhì)取材廣泛、還可利用自體牙進(jìn)行個性化的骨替代材料的制作，克服了倫理問題和免疫反應(yīng)。隨著新技術(shù)、新材料的發(fā)明如靜電紡絲和石墨烯等，可以進(jìn)一步提高DDM-SF材料性能，逐步解決細(xì)胞貼壁速率、材料孔徑的均質(zhì)性控制，材料的體內(nèi)降解速度等。DDM-SF有望廣泛應(yīng)用于牙種植牙槽骨骨量不足的骨替代、下頜骨局部或大部喪失后的重建、面部美容等治療。