劉晉琿

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

20世紀70年代初，鈦及其合金因其高比強度、耐蝕性和生物相容性，開始取代不銹鋼作為醫(yī)用植入材料。然而鈦及其合金本身是惰性的，無法實現(xiàn)有效的抗菌和促進成骨，這可能導致植入物失敗，給患者帶來極大的痛苦和沉重的經(jīng)濟負擔。通過對鈦及其合金表面進行表面改性可以解決以上難題。

目前，鈦及其合金的表面改性包括多種技術：離子注入、等離子體噴涂、物理氣相沉積和微弧氧化等。其中，微弧氧化是在鈦基基底上制備多孔TiO2陶瓷涂層的一種有效且相對方便的方法。通過在氧化過程中將促進抗菌和成骨的元素添加到電解液中，可以將抗菌元素摻雜到生物醫(yī)學應用的氧化物涂層中。

本文對國內(nèi)外鈦及鈦合金載銅微弧氧化涂層在抗菌性和成骨活性方面的研究進展進行調(diào)研和綜述。

1 銅的抗菌性和成骨活性

銅（Cu）及其離子是公認的廣譜抗菌劑，能夠克服細菌耐藥性。早在公元前2000多年的艾德溫·史密斯紙草文稿就詳細描述了古埃及人如何使用銅來消毒水和直接治療傷口。而且銅是人體必需的微量元素之一，主要以含銅蛋白的形式存在，對維持人體正常造血功能、促進結締組織生成及維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康等有重要作用，銅還具有多種生物功能，如刺激血管生成和成骨。因此，具有抗菌和成骨活性的銅元素在醫(yī)療領域受到廣泛的關注和研究。

1.1 銅的抗菌活性

Kalaivani等人研究了摻銅硅酸鈣（CaSiO3）涂層，并評估了其對大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）的抗菌性能。結果表明，純粉末沒有表現(xiàn)出抗菌性能，而隨著摻雜涂層中銅含量的增加，抗菌活性逐漸增強[1]。Akhtar等人用銅/殼聚糖復合物涂覆不銹鋼316L，并評估其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果。發(fā)現(xiàn)銅/殼聚糖復合物對這兩種菌株在3h后都有很強的抑制作用,沒有細菌生長，24h后仍有這種作用[2]。Ren等人使用317L銅不銹鋼對抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其材料在2h后顯示出一定的抗菌效果：對金黃色葡萄球菌的生長抑制率為20%，對大腸桿菌的生長抑制率為40%，12h后這一比例分別增加到80%和90%。24小時后，這種材料殺死了99%的細菌[3]。

1.2 銅成骨活性

體外研究表明，銅可以促進成骨分化。在細胞培養(yǎng)基中加入銅可以減少骨髓間充質干細胞的增殖，盡管它可以增加成骨分化的能力，誘導堿性磷酸酶（ALP）的早期表達和礦化[4]。Ren等人證明，含銅鋼釋放的微量銅具有明顯的降低支架內(nèi)再狹窄（ISR）、抗菌感染、抑制炎癥細胞甚至促進早期成骨的生物學功能。與未摻雜的317L鋼相比，317L銅鋼在培養(yǎng)3天后，成骨細胞的ALP活性和成骨基因的表達，如I型膠原（COL-1）、骨橋蛋白（OPN）和Runt相關轉錄因子2（RUNX2）顯著增加[5]。Burghardt等人在鈦合金上制備了一種含銅鍍層的復合材料。當Cu2+濃度為0.1mM時，MSC增殖受到刺激，ALP活性增加，大腸桿菌、骨保護素、骨橋蛋白表達增加，細胞礦化[6]。Wu等人制備了含銅的介孔生物活性玻璃支架，并在骨髓間充質干細胞（hBMSC）上測試了這些材料及其提取物。發(fā)現(xiàn)細胞中骨相關基因ALP、OPN和骨鈣素的表達顯著增加[7]。

2 微弧氧化

微弧氧化（Micro arc oxidation，MAO）也稱為等離子體電解氧化（Plasma Electrolytic Oxidation，PEO），是一種電化學表面處理工藝，可在某些金屬上產(chǎn)生保護性氧化物涂層。微弧氧化設備主要由電解槽和氧化電源組成。以閥金屬（鈦、鋯、鉭等）及其合金作為陽極放入電解槽中，通電后在低電壓下金屬表面生成很薄一層氧化物絕緣層，當施加的電壓超過某一臨界值，電壓從陽極氧化的法拉第區(qū)域進入高壓放電區(qū)，這時絕緣膜上某些薄弱部位被擊穿，浸在溶液里的金屬表面可以看到無數(shù)個游動的弧光或火花，每個弧點存在時間很短，但等離子體放電區(qū)域瞬間溫度很高，一般認為在2000℃以上。在此區(qū)域內(nèi)金屬及其氧化物發(fā)生不斷的熔融凝固形成以基體金屬氧化物為主、電解液成分為輔的改性陶瓷涂層。影響微弧氧化涂層屬性的電參數(shù)主要有電流密度、電壓強度、脈沖振蕩和正負占空比等。通過改變這些電參數(shù)，影響微弧氧化工藝過程，如發(fā)生的電壓擊穿、基底的局部熔化和氧化、淬火和再結晶過程，進而顯著影響涂層的微觀結構和性能。形成的微弧氧化膜層與基體結合牢固，具有良好的耐腐蝕和電絕緣等特性。該技術具有操作簡單和易于實現(xiàn)膜層功能調(diào)節(jié)的特點，而且工藝不復雜，不造成環(huán)境污染，是一項全新的綠色環(huán)保型材料表面處理技術，在航空航天、汽車、醫(yī)療器械等領域具有廣闊的應用前景。

通過向電解液中添加金屬納米顆粒或金屬化合物，并利用微弧氧化技術可以將無機抗菌金屬元素（如銀、銅、鋅）引入植入物表面。亦可以通過物理氣相沉積、濺射、電沉積等手段結合微弧氧化技術，將無機抗菌金屬元素引入植入物表面。把銀、銅、鋅等金屬元素摻入微弧氧化涂層中，從而改善鈦及其合金植入物抗菌性和成骨活性，現(xiàn)已成為植入物表面改性研究的熱點領域。

3 載銅微弧氧化涂層研究進展

利用微弧氧化技術，通過向電解液中添加銅離子，可以獲得載銅微弧氧化涂層。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，涂層顯示出良好的抗菌性能和成骨活性。Zhu等人研究了通過在微弧氧化電解液中添加Cu(CH3COO)2·H2O制備的含銅TiO2層的抗菌和生物行為。含銅的TiO2涂層可以顯著抑制金黃色葡萄球菌的粘附。體外生物學評價顯示，與無銅涂層和鈦板相比，含銅涂層上MG63細胞的粘附、增殖和分化能力增強[8]。Zhang等人同樣通過在電解液添加Cu(CH3COO)2制備了不同銅含量的TiO2層。Cu摻雜TiO2涂層對金黃色葡萄球菌具有良好的接觸殺滅和釋放殺滅作用，抗菌活性與涂層中Cu2+的用量呈正相關。Cu2+可增加細胞內(nèi)特異性蛋白質（如CTGF、a-SMA和Col I）的合成，表明對成纖維細胞轉變?yōu)榧±w維化表型和分化為肌成纖維細胞有積極作用。在低濃度的銅（0.67 wt%）下，生成的TiO2層顯示出成纖維細胞的粘附和增殖，而在高濃度下，由于細胞毒性，其顯著降低[9]。Liang等通過含乙二胺四乙酸銅鈉的電解液向微弧氧化層中摻雜1.92 wt%的銅，涂層沒有細胞毒性。MAO樣品在Hanks'S溶液中浸泡14天后，對金黃色葡萄球菌的抗菌率仍保持在100%，而對大腸桿菌的抗菌率在浸泡8天后下降到92%，浸泡14天后下降到12%，顯示出長期的抗菌能力[10]。Shimabukuro等在含有氯化銅的電解液中，通過MAO處理，在鈦表面成功地制備含銅的多孔氧化涂層。從氧化涂層釋放的銅離子量小于ICP-AES的檢測限，對成骨樣細胞的增殖和鈣化沒有有害影響。使用革蘭氏陽性和革蘭氏陰性兼性厭氧菌評估抗菌性能，證實了含銅氧化涂層抗菌性能。在生理鹽水中浸泡28天后，仍存在抗菌性能[11]。Rokosz等在四種含有Cu(NO3)2·3H2O的電解質中進行微弧氧化。發(fā)現(xiàn)電解液中Cu(NO3)2·3H2O濃度越高，涂層的粗糙度越高。涂層中的銅導致所制備的涂層具有抗菌和殺菌性能，可用于生物相容性應用[12]。

部分研究是通過在電解液加入含銅納米粒子（CuNPs），制備載銅微弧氧化涂層。Yao等通過在含有CuNPs的電解液中對鈦進行微弧氧化，制備了摻銅抗菌TiO2涂層。結果表明，CuNPs不僅分布在涂層表面和孔隙內(nèi)部，而且還嵌入到涂層中。Cu主要以Cu2+狀態(tài)存在于TiO2涂層中。Cu摻雜涂層對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有優(yōu)異的抗菌活性[13]。同樣的，Zhang等人通過微弧氧化在鈦表面沉積了摻有不同量CuNPs（指定為0Cu、0.3 Cu和3.0 Cu）的多孔涂層。CuNPs涂層樣品對金黃色葡萄球菌具有優(yōu)異的抗菌活性。體外細胞相容性評價顯示，銅和0.3Cu對成骨細胞沒有毒性，但3.0Cu具有細胞毒性。0.3Cu促進成骨細胞增殖和粘附，增強細胞外基質礦化，但對堿性磷酸酶活性（ALP）和膠原分泌影響不大。0.3Cu和3.0Cu對內(nèi)皮細胞均無細胞毒性，促進細胞增殖。從CuNPs摻雜的TiO2涂層中觀察到內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）和分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[14]。

通過結合其他表面改性技術，也可將銅摻雜進微弧氧化涂層里。Huang等人通過將微弧氧化和水熱處理相結合來制備摻銅TiO2涂層，研究其對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用。Cu2+釋放和材料表面可激活巨噬細胞內(nèi)不同的信號通路。涂層表面Cu2+的釋放可通過銅轉運信號激活促炎性M1巨噬細胞。體內(nèi)實驗結果證實了銅誘導的炎癥反應與增強成骨之間的正相關關系[15]。Durdu將微弧氧化和物理氣相沉積-熱蒸發(fā)技術結合起來，在純鈦表面制備了一種新型的銅基TiO2涂層。研究了涂層的體外生物活性和體外抗菌性能。在模擬體液（SBF）中浸泡28天后，與MAO表面相比，含銅MAO涂層的體外生物活性增加。分別對革蘭氏陽性（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性（大腸桿菌）細菌進行28天的細菌粘附試驗。結果表面，與MAO表面相比，含銅MAO涂層的抗菌性能顯著提高[16]。Burghardt等人通過電鍍銅到微弧氧化層上，并通過噴砂減薄涂層到合適厚度。發(fā)現(xiàn)釋放銅離子的鈦植入物在植入物表面附近較高濃度的銅可以有效地對抗細菌感染，并且當銅離子濃度因擴散而降低時，可以促進骨再生。銅在0.1mM左右的窄濃度范圍內(nèi)刺激間充質干細胞（MSC）的增殖。當細胞在成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，相似的銅濃度可促進MSC的成骨分化。我們觀察到堿性磷酸酶（ALP）活性增加，I型膠原、骨保護素、骨橋蛋白表達增加，最終細胞礦化[17]。Wu等人采用微弧氧化法在預濺射的CuTi薄膜上制備了不同銅濃度的抗菌TiO2涂層。研究了CuTi膜中Cu濃度對微弧氧化過程的影響。Cu主要以CuO的形式存在于TiO2涂層中。Cu-TiO2涂層表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，并且隨著MAO涂層中Cu濃度的增加，抗菌率逐漸上升。微弧氧化涂層的耐蝕性也略有提高[18]。

4 總結

微弧氧化技術應用廣泛的一個重要原因是能夠通過該技術開發(fā)出具有多種化學成分的多孔涂層。微弧氧化技術將銅有效地引入到植入物表面，成功地解決了鈦及其合金植入物存在的感染和成骨活性差的問題。大部分研究是有關載銅微弧氧化涂層的體外抗菌性能和成骨活性。

雖然在體外實驗中取得一些成果，但相關動物體內(nèi)實驗和臨床試驗研究相對較少。未來應該對載銅微弧氧化涂層的短期及長期抗菌活性、成骨活性進行有效評價，并通過大量的動物和臨床實驗去證實，只有這樣載銅微弧氧化涂層才能進入臨床應用，具備實用價值?？傮w上，目前載銅微弧氧化涂層研究仍處于初級階段，許多技術上的難題還需進一步研究解決。