羅文莉， 劉賽虎， 金莉莉

(延邊大學(xué) 藥學(xué)院， 吉林 延吉 133002)

0 引言

松花粉是馬尾松(PinusmassonianaLamb)、油松(PinustabuliformisCarr)、赤松(PinusdensifloraSiebet Zucc)、黑松(PinusthunbergiiParl)等松科植物的花粉[1].松花粉含有油脂、多糖、黃酮類、膽堿、甾醇等多種成分[2-5]，其中多糖是松花粉的主要活性物質(zhì)之一.研究表明，松花粉具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等作用[6-9].目前，對松花粉的提取及相關(guān)研究仍停留在初級階段[10].2016年，袁桂香等利用正交試驗對馬尾松松花粉中的多糖進(jìn)行了工藝優(yōu)化篩選，但該方法僅僅能對已有的試驗水平進(jìn)行篩選[11]，并不能對工藝范圍內(nèi)的最優(yōu)工藝進(jìn)行全局求解.機(jī)器學(xué)習(xí)方法因能夠有效解決非線性問題以及進(jìn)行全局尋優(yōu)，因此近年來被應(yīng)用于提取工藝的優(yōu)化中，并取得了良好效果[12].基于此，本文利用正交試驗和機(jī)器學(xué)習(xí)兩種方法，以松花粉浸膏、多糖提取率和綜合評分為指標(biāo)，對松花粉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化和對比，以期為松花粉提取工藝的擇優(yōu)選取提供參考.

1 試驗材料與儀器

1.1 材料

馬尾松松花粉(產(chǎn)于長白山)，經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院安仁波教授鑒定；無水乙醇、葡萄糖、苯酚均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；濃硫酸(吉林省遼源市西安區(qū)化學(xué)試劑廠).

1.2 儀器

分析天平，上海精天電子儀器有限公司；多功能超純水系統(tǒng)(Unique -R20)，廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司； WZ -180SP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司； HH-W型恒溫水浴箱，江蘇省常州市金壇區(qū)恒豐儀器廠；紫外分光光度儀(UV -2450型)，島津公司；鼓風(fēng)干燥箱，金壇市恒豐儀器廠； L -500臺式低速自動平衡離心機(jī)，上海四科儀器設(shè)備有限公司.

2 試驗方法

2.1 松花粉浸膏的制備

將180 g干燥馬尾松松花粉等質(zhì)量地分為9份后，分別置于9個燒瓶中.采用乙醇回流方法提取馬尾松松花粉，并將得到的提取液趁熱過濾后再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮.濃縮后所得的膏體即為浸膏.

2.2 松花粉多糖的提取率測定

2.2.1對照溶液的配置

稱取20 mg干燥的葡萄糖置于250 mL容量瓶中，加入超純水將其定容.取葡萄糖對照溶液2 mL置于試管中，加入2 mL苯酚溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%)和5 mL濃硫酸(體積分?jǐn)?shù)為98%)后將試管置于40 ℃的恒溫水浴鍋中.40 min后取出試管，室溫下保存?zhèn)溆?

2.2.2供試溶液的配置

取500 mg松花粉浸膏置于500 mL容量瓶中，加入超純水定容后超聲、離心(3 000 r/min，15 min).將上清液減壓濃縮至5 mL后加入15 mL無水乙醇，放置24 h(4 ℃)后離心15 min (3 000 r/min).在離心得到的沉淀中加入少量蒸餾水，沉淀溶解后加入無水乙醇(加入量為溶液體積的3倍)使溶液再次出現(xiàn)沉淀.試驗平行3次，并將沉淀物置于干燥箱中烘干(60 ℃，60 min).取5 mg烘干品，研磨后加少量水溶解后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容.取2 mL樣品液置于試管中，加入1 mL的苯酚 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%) 和5 mL濃硫酸 (體積分?jǐn)?shù)為98%)，靜置20 min后搖勻.將上述試管放入恒溫水浴鍋中水浴15 min (40 ℃)，取出后即得馬尾松松花粉的多糖供試液[13].

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在250 mL容量瓶中，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和超純水分別配制8.0、12.0、16.0、20.0、24.0、28.0、32.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液[14].取1 mL苯酚溶液 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%) 置于7個試管中，然后加入2 mL配制的不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；充分混勻后加入5 mL濃硫酸 (體積分?jǐn)?shù)為98%)，靜置10 min后搖勻；在恒溫水浴鍋(40 ℃) 中繼續(xù)靜置15 min， 然后在490 nm處測定7組試管的吸光度值[15].測定平行3次，取平均值.利用Origin軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，以該濃度下測定的葡萄糖吸光度為縱坐標(biāo))，如圖1所示.由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(X)和吸光度(Y)之間存在良好的線性關(guān)系：Y= 0.014 9X-0.065 6，R2=0.996 2.

圖1 苯酚 -硫酸法測定葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4松花粉多糖的含量測定

2.2.5加樣回收率測定

取3份馬尾松松花粉浸膏各50 mg置于試管中，并在浸膏中分別加入不同量的對照品(供試品已知量的80%、100%、120%)，然后在490 nm處測定溶液的吸光度和計算其RSD值.經(jīng)計算，松花粉多糖的平均加樣回收率為98.41%，RSD=0.949%.

2.3 工藝數(shù)據(jù)的處理

本文根據(jù)文獻(xiàn)[16]中的方法對松花粉的多目標(biāo)提取工藝進(jìn)行綜合評分，評分公式為S=γ×D+(1-γ)×P， 其中γ為松花粉浸膏的提取權(quán)重系數(shù)(取0.4)， 1-γ為松花粉多糖提取率的權(quán)重系數(shù)(取0.6).

2.4 正交試驗的設(shè)計

基于文獻(xiàn)[17]，本文選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間作為影響因素，每個因素均選取3個水平(如表1所示).正交試驗L9(33)利用Minitab軟件設(shè)計.

表1 正交試驗的各因素水平

2.5 機(jī)器學(xué)習(xí)的優(yōu)化算法

圖2為利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法對松花粉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化的流程圖.優(yōu)化時，將正交試驗所得的數(shù)據(jù)作為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network，ANN)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，并對訓(xùn)練后的數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析(Pearson correlation analysis)，以此得到各個工藝參數(shù)的影響權(quán)重.為使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型能夠快速收斂，對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，并在訓(xùn)練過程中采用K折交叉驗證(K-fold cross validation)的方式對模型進(jìn)行評估，以此確保模型的泛化能力.

圖2 利用機(jī)器學(xué)習(xí)的松花粉提取工藝優(yōu)化流程

利用Python語言中的Pytorch框架構(gòu)建BP(back propagation)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[18]，并利用該網(wǎng)絡(luò)對馬尾松松花粉正交試驗提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練和預(yù)測.訓(xùn)練時，交叉驗證的K折數(shù)設(shè)定為6， 遍歷次數(shù)取2 000， 優(yōu)化器選用Adam， 學(xué)習(xí)率設(shè)定為0.01.在不同目標(biāo)下對松花粉浸膏提取、多糖提取和綜合評分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析,所得的結(jié)果見表2.

表2 不同目標(biāo)下的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

由于遺傳算法在優(yōu)化數(shù)據(jù)時需給定目標(biāo)函數(shù)和約束條件，因此本文根據(jù)浸膏提取、多糖提取及綜合評分的正交試驗結(jié)果給出如下約束條件： 60% ≤ 乙醇體積分?jǐn)?shù) ≤ 90%， 40 ℃ ≤ 提取溫度 ≤ 90 ℃， 0.75 h ≤ 提取時間 ≤ 3.2 h.迭代數(shù)據(jù)，并將種群規(guī)模設(shè)置為1 000， 最大進(jìn)化代數(shù)設(shè)置為500， 重組概率設(shè)置為0.7.

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗方法的相關(guān)性分析

正交試驗結(jié)果如表3所示.由表3可以看出，影響浸膏提取、多糖提取及綜合評分的因素其大小順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度.

圖3為浸膏、多糖提取率及綜合評分的主效應(yīng)圖.由圖3可知：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、提取溫度為85 ℃，提取時間為3 h時，松花粉浸膏的提取率最高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、提取溫度為75 ℃，提取時間為3 h時，松花粉多糖的提取率最高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、提取溫度為85 ℃，提取時間為3 h時，綜合評分最高.

表3 正交試驗結(jié)果

注：R為正交試驗的極差值(由Minitab軟件計算得出).

圖3 浸膏、多糖提取率及綜合評分的主效應(yīng)圖

3.2 機(jī)器學(xué)習(xí)方法的預(yù)測結(jié)果

圖4為松花粉提取工藝的皮爾遜相關(guān)性分析圖.由圖4可知，影響兩種方法(正交試驗法和機(jī)器學(xué)習(xí)方法)的權(quán)重(浸膏提取率、多糖提取率和綜合評分的權(quán)重)其順序均相同，即由大到小的順序均為乙醇濃度、提取時間、提取溫度.

圖5為基于BP網(wǎng)絡(luò)的馬尾松松花粉浸膏、多糖提取率和綜合評分的響應(yīng)圖.由圖5(a)和圖5(b)可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，浸膏提取率隨提取溫度或提取時間的增加而增加；由圖5(c) 可以看出，當(dāng)提取溫度為75 ℃時，浸膏提取率隨提取時間的增加呈先上升后下降的趨勢；由圖5(d)和圖5(e) 可以看出，提取溫度為75 ℃或提取時間為2.5 h時，多糖提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢；由圖5(f) 可以看出，提取溫度為75 ℃時，多糖提取率隨提取時間的增加而增加；由圖5(g)和圖5(h)可以看出，提取溫度為75 ℃或提取時間為2.5 h時，多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢；由圖5(i)可以看出，提取溫度為75 ℃時，綜合評分隨提取時間的增加而增加.

圖4 松花粉提取工藝的皮爾遜相關(guān)性分析圖

圖5 基于BP網(wǎng)絡(luò)的馬尾松松花粉浸膏、多糖提取率和綜合評分的響應(yīng)圖

3.3 試驗工藝驗證

圖6為種群個體目標(biāo)函數(shù)值隨代數(shù)變化的曲線.由圖6可知，經(jīng)過20次迭代后，遺傳算法已找到最優(yōu)工藝值.表4為正交試驗和機(jī)器學(xué)習(xí)的優(yōu)化結(jié)果及驗證值.由表4可知，以松花粉浸膏為指標(biāo)時，機(jī)器學(xué)習(xí)方法獲得的松花粉浸膏的優(yōu)化驗證值為21.06% (提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取溫度65 ℃、提取時間3.2 h) ，正交試驗的驗證值為20.98%；以松花粉多糖為指標(biāo)時，機(jī)器學(xué)習(xí)方法獲得的多糖提取率的優(yōu)化驗證值為2.74%(提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)81%、提取溫度89 ℃、提取時間3.2 h)，正交試驗的驗證值為2.61%；以松花粉綜合評分為指標(biāo)時，機(jī)器學(xué)習(xí)方法獲得的綜合評分優(yōu)化驗證值為92.01% (提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)83%、提取溫度89 ℃、提取時間3.2 h)，正交試驗的驗證值為89.78%.上述結(jié)果表明，機(jī)器學(xué)習(xí)法的提取率顯著優(yōu)于正交試驗法，且所得的提取率相對穩(wěn)定.

圖6 種群個體目標(biāo)函數(shù)值隨代數(shù)變化的曲線

表4 正交試驗和機(jī)器學(xué)習(xí)的優(yōu)化結(jié)果及驗證值

4 結(jié)論

本文利用正交試驗設(shè)計和機(jī)器學(xué)習(xí)兩種方法，對馬尾松松花粉提取工藝進(jìn)行對比研究顯示：以松花粉的浸膏、多糖提取率及綜合評分為評價指標(biāo)時，采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法獲得的松花粉浸膏、多糖提取率和綜合評分顯著優(yōu)于正交試驗設(shè)計方法，這表明機(jī)器學(xué)習(xí)可用于非線性的復(fù)雜問題的擬合，且使用該方法求解得到的極值通常為工藝的最優(yōu)解.該方法同時具有良好的穩(wěn)定性，并可降低試驗費(fèi)成本和時間，因此可為松花粉的工業(yè)化提取提供參考.在今后的研究中，我們將對馬尾松松花粉多糖的生物活性進(jìn)行研究，以促進(jìn)馬尾松松花粉的開發(fā)和利用.