王林春 歐陽博慧 吳春龍 吳凱樂 謝晴晴 唐建

鼻咽癌是一種源于鼻咽上皮細胞的原發(fā)性惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移是其主要生物學特性[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是腫瘤細胞獲得間充質(zhì)表型和增強侵襲能力的關(guān)鍵步驟。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤進展過程的關(guān)鍵因子[2]，參與調(diào)控EMT過程。大量研究表明，miR-454-3p在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，例如：miR-454-3p可通過靶向活化T細胞核因子c2（NFATc2）抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖并增加細胞凋亡[3]，通過靶向鈣結(jié)合蛋白1（CALB1）抑制非小細胞肺癌細胞增殖[4]，通過靶向B細胞易位基因 1（BTG1）增強腎癌細胞對 X線的敏感性[5]等，表明miR-454-3p可通過調(diào)控靶基因參與多種惡性腫瘤的發(fā)展進程，但目前關(guān)于miR-454-3p在鼻咽癌中的調(diào)控機制尚不清楚。因此，本研究選取鼻咽癌細胞系CNE-2為研究對象，探究miR-454-3p調(diào)控CNE-2細胞EMT的機制，為鼻咽癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機制研究提供更多的實驗室依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017年1月至2018年12月于柳州市中醫(yī)醫(yī)院就診的95例鼻咽癌患者，男71例，女24 例，年齡 27～70（46.12±9.53）歲，臨床分期Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期54例。納入標準：所有鼻咽癌患者均未接受放化療治療，無肝腎功能不全、神經(jīng)疾病以及其他腫瘤等合并癥，無家族病或特殊病史。排除標準：合并糖尿病、其他腫瘤或嚴重凝血功能障礙或心、肺功能不全者；患者病史資料不全，年齡＞80歲，不積極配合本研究或中途退出者。收集30例本院同期健康體檢者，男 21 例，女 9 例，年齡 29～63（45.77±8.94）歲。兩組對象性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 材料 鼻咽癌細胞系CNE-2購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、FBS和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶盒試劑及SYBR Green定量PCR試劑盒購自北京TaKaRa公司；pmirGLO載體、E-盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2）野生型序列（WT）及ZEB2突變型序列（MUT）、miR-454-3p mimic和對照序列（Mimic-NC）、過表達 ZEB2質(zhì)粒（ZEB2 plasmid）及對照載體（vector）由上海生工生物公司合成；Trizol試劑購自索萊寶公司產(chǎn)品；Transwell小室購自美國Corning公司；anti-E-cadherin antibody、anti-N-cadherin antibody、anti-ZEB2 antibody、β-actin購自英國Abcam公司；anti-Vimentin antibody、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠二抗、HRP標記羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Binder公司；倒置熒光相差顯微鏡購自日本Olympus公司（型號：CKX53）；實時熒光定量 PCR系統(tǒng)購自美國Agilen公司（型號：AriaMx）；垂直電泳儀（PowerPac Basic）和蛋白轉(zhuǎn)印模塊（Mini Trans-Blot Cell）購自美國Bio-Rad公司；酶標儀購自美國MD公司（型號：FilterMax F3）；雙熒光素酶報告基因發(fā)光檢測儀購自美國Promega公司（型號：GloMax 20/20）；低溫離心機購自德國Eppendorf公司（型號：5418R）；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司（型號：Tanon 5200）。

1.3 miR-454-3p、ZEB2 mRNA的表達檢測 采用RT-qPCR檢測。收集鼻咽癌患者及健康體檢者清晨空腹靜脈血各3 ml，檢測miR-454-3p水平；收集臨床病理學確診的鼻咽癌患者活檢組織標本，檢測miR-454-3p、ZEB2 mRNA的表達；收集經(jīng)細胞裂解液處理的細胞樣品，檢測miR-454-3p、ZEB2 mRNA的表達。實驗步驟：將上述檢測樣本使用Trizol法進行RNA提取，取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA單鏈，以此作為模板進行qPCR檢測，miR-454-3p的內(nèi)參為U6，ZEB2的內(nèi)參為β-actin，擴增參數(shù)為：95℃30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 34 s，共 40 個循環(huán)，每個樣品設置3個平行反應孔，實驗重復3次，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 細胞分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)增殖期的CNE-2細胞，以每孔2×106個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達70%～90%。隨機分為Control組、miR-454-3p mimic組、Mimic-NC 組、miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid組和miR-454-3p mimic+vector組。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書要求，將miR-454-3p mimic和Mimic-NC轉(zhuǎn)染至CNE-2細胞中，miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid組和miR-454-3p mimic+vector組則需額外轉(zhuǎn)染ZEB2過表達質(zhì)粒及對照載體，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組樣品。Control組不進行任何處理。

1.5 細胞侵襲能力的測定 采用Transwell侵襲實驗。將Matrigel膠鋪于Transwel小室上室，置37℃培養(yǎng)箱24 h使Matrigel聚合成凝膠。將各組細胞消化制備單細胞懸液，將2.0×105細胞加入Transwell上室，下室加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日取出，用棉簽輕輕擦去上室表面的細胞，多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗，顯微鏡下計數(shù)后取平均數(shù)，檢測細胞的侵襲能力，實驗重復3次。

1.6 細胞遷移能力的測定 采用細胞劃痕實驗。細胞接種于6孔板并進行相應轉(zhuǎn)染處理，待細胞融合度達約90%后，用滅菌的200 μl槍頭垂直于板底均勻地劃痕，用無菌PBS洗去脫落細胞，于顯微鏡下觀察劃痕處有無細胞并拍照記錄，隨后放回細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h再次取樣拍照，用Image J軟件計算0 h及24 h劃痕面積，實驗重復3次。細胞遷移率=（T0h面積-T24h面積）/T0h面積×100%。

1.7 ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達水平的測定 采用Western blot法。細胞經(jīng)相應轉(zhuǎn)染處理后48 h收集樣品，RIPA法進行總蛋白提取，BCA法定量后，取50 μg總蛋白，進行SDS-PAGE垂直電泳，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗孵育，4℃過夜，洗去一抗，孵育對應種屬HRP標記的二抗，室溫1 h，洗去二抗，用化學發(fā)光顯色液顯色。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析并計算 ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相對表達水平，實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?CNE-2細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。將ZEB2 3'UTR-WT及ZEB2 3'UTR-MUT構(gòu)建到pmirGLO載體中，獲得WT-ZEB2和MUT-ZEB2，不含任何外源片段的空載體作為陰性對照。pmirGLO載體的螢火蟲熒光素酶luc2作為主要報告基因，海腎熒光素酶hRluc-neo為對照報告基因，按照LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，將miR-454-3p mimic分別與WT-ZEB2和MUT-ZEB2轉(zhuǎn)染到細胞中，同時以Mimic-NC作為對照。設置3復孔，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12 h，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶活性，以海腎熒光素酶hRluc-neo的活性作為校正報告基因，實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-454-3p的表達與鼻咽癌惡性進展的關(guān)系 鼻咽癌患者血清miR-454-3p水平為0.57±0.09，低于健康體檢者的1.02±0.17，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在鼻咽癌分期中，Ⅲ、Ⅳ期患者鼻咽癌組織miR-454-3p的相對表達水平為0.48±0.09，低于Ⅰ、Ⅱ期患者的 0.98±0.18，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ期患者鼻咽癌組織ZEB2 mRNA相對表達水平為2.12±0.53，高于Ⅰ、Ⅱ期患者的 1.06±0.19，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。miR-454-3p與 ZEB2 mRNA的表達呈負相關(guān)（r=-0.734，P＜0.01），見圖 1。

圖1 鼻咽癌組織中miR-454-3p和ZEB2 mRNA關(guān)系的散點圖

2.2 miR-454-3p對CNE-2細胞ZEB2的調(diào)控 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與Mimic-NC組比較，過表達miR-454-3p可降低ZEB2 3'UTR-WT的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而不影響ZEB2 3'UTR-MUT的熒光素酶活性，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖 2。CNE-2細胞轉(zhuǎn)染 miR-454-3p mimic后，與Mimic-NC組比較，miR-454-3p mimic組miR-454-3p表達水平明顯升高，ZEB2 mRNA及蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但與Control組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。CNE-2細胞轉(zhuǎn)染ZEB2過表達質(zhì)粒后，相較于miR-454-3p mimic+vector組，miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid組中ZEB2 mRNA及蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但miR-454-3p表達水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；miR-454-3p mimic組與miR-454-3p mimic+vector組 miR-454-3p和ZEB2的表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表 2、圖 3。

圖2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果

表2 各組細胞miR-454-3p與ZEB2mRNA及蛋白的表達水平比較

圖3 Western blot檢測ZEB2蛋白表達電泳圖

2.3 miR-454-3p抑制EMT降低CNE-2細胞的侵襲和遷移能力 與Mimic-NC組比較，miR-454-3p mimic組N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高，侵襲細胞數(shù)及遷移率降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。Mimic-NC組與Control組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與miR-454-3p mimic+vector組比較，miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid組中N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平及侵襲細胞數(shù)、遷移率明顯升高，E-cadherin蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；miR-454-3p mimic組與miR-454-3p mimic+vector組結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、4，圖4、5（見插頁）、6。

圖4 Western blot檢測 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達電泳圖

圖5 Transwell侵襲實驗檢測 CNE-2 細胞侵襲能力結(jié)果圖（a：Control組；b：miR-454-3p mimic組；c：Mimic-NC 組；d：miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid 組；e：miR-454-3p mimic+vector組；×100）

圖6 細胞劃痕實驗檢測 CNE-2 細胞遷移能力結(jié)果圖（a、f：Control組；b、g：miR-454-3p mimic組；c、h：Mimic-NC 組；d、i：miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid 組；e、j：miR-454-3p mimic+vector組；×40）

表3 各組細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的相對表達水平比較

3 討論

鼻咽癌是頭頸部腫瘤的主要類型之一，具有明顯的地理分布特征，常見于中國南部（特別是兩廣地區(qū)）及東南亞地區(qū)[6]，嚴重危害人類健康。盡管調(diào)強放療和同步放化療的患者健康狀況得以改善，使鼻咽癌的5年局部控制率已達80%～90%，但仍有15%～30%的患者發(fā)生骨、淋巴結(jié)、肝和肺的遠處轉(zhuǎn)移，這些轉(zhuǎn)移事件是導致鼻咽癌患者死亡的主要原因[7-8]。因此，迫切需要研究潛在鼻咽癌患者轉(zhuǎn)移的分子機制，并開發(fā)新的標志物以預測原發(fā)性鼻咽癌患者的轉(zhuǎn)移風險。

表4 各組細胞侵襲細胞數(shù)及遷移率的比較

越來越多的研究顯示，miRNA參與多種生物學過程，包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡、細胞周期調(diào)控以及侵襲、發(fā)育和代謝等[9]。miRNA被認為是包括鼻咽癌在內(nèi)許多腫瘤的關(guān)鍵分子，可作為潛在的預后生物標志物[10]；在功能上，充當腫瘤抑制基因或致癌基因的miRNA的失控會影響癌癥發(fā)生、發(fā)展；此外，miRNA的表達與化學抗性或放射抗性表型有關(guān)，表明miRNA在介導致癌過程中的重要性[11]。miR-454-3p是miR-454家族的一個亞基，可調(diào)控腫瘤啟動、侵襲和轉(zhuǎn)移機制。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、食管癌等惡性腫瘤中，miR-454-3p起抑癌作用，可抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲，并促進癌細胞凋亡[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者血清miR-454-3p水平低于健康體檢者，且Ⅲ、Ⅳ期患者組織miR-454-3p mRNA的表達水平也低于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明miR-454-3p在鼻咽癌惡性進展中也可能發(fā)揮抑癌作用。

miRNA主要通過靶向靶基因的3'UTR，抑制其表達來發(fā)揮其功能。本研究中雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，miR-454-3p可靶向ZEB2 3'UTR，降低熒光素酶活性。同時還發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ期患者組織中ZEB2 mRNA相對表達水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者，說明了ZEB2在鼻咽癌進展中起促癌作用，與既往研究一致；且鼻咽癌組織中miR-454-3p與ZEB2 mRNA的表達呈負相關(guān)，表明miR-454-3p在鼻咽癌中的抑癌機制與ZEB2有關(guān)。ZEB家族包含ZEB1和ZEB2，可通過結(jié)合靶標E-box區(qū)充當轉(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子，從而抑制一些上皮連接和極性基因（如E-cadherin），激活定義EMT表型的間充質(zhì)基因（如N-cadherin），驅(qū)動EMT[14]。這也進一步提示miR-454-3p可能通過靶向ZEB2進而介導鼻咽癌EMT過程。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到遠處器官的漸進過程，包括局部浸潤、內(nèi)滲、彌散、外滲和定植。越來越多的證據(jù)表明，EMT是癌細胞獲得轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵[15]。EMT導致細胞活動性增強，使腫瘤向遠處轉(zhuǎn)移部位擴散，其分子特征是上皮型標志物E-cadherin下調(diào)，間葉細胞標志物 N-cadherin、Vimentin上調(diào)[16]。EMT是由一組轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）介導的，其中包括ZEB家族、Snail、Twist和Slug。這些TFs通過激活或抑制維持上皮或間質(zhì)特征的下游靶點來協(xié)調(diào)調(diào)控EMT，而這些EMT-TFs本身受多種信號控制，如miRNA等，EMT-TFs異?？纱龠M腫瘤進展[17]。為進一步探究miR-454-3p對EMT的調(diào)控，筆者通過在CNE-2細胞中瞬時轉(zhuǎn)染miR-454-3p mimic，結(jié)果顯示過表達miR-454-3p 可顯著降低 ZEB2、N-cadherin、Vimentin表達，升高E-cadherin表達，同時降低細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力，表明miR-454-3p可抑制鼻咽癌細胞EMT。此外，為驗證miR-454-3p對ZEB2的調(diào)控機制，本研究也在CNE-2細胞中轉(zhuǎn)染了ZEB2過表達質(zhì)粒，結(jié)果顯示過表達ZEB2可逆轉(zhuǎn)miR-454-3p mimic對EMT的抑制作用，促進鼻咽癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，與鼻咽癌組織樣本結(jié)果一致，證實了ZEB2對EMT的促進作用，同時過表達ZEB2不影響miR-454-3p的表達，也進一步說明ZEB2位于miR-454-3p的下游，miR-454-3p可通過靶向ZEB2進而抑制鼻咽癌細胞EMT。

綜上所述，miR-454-3p是多種惡性腫瘤的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究表明，miR-454-3p可抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其機制可能是靶向抑制ZEB2的表達，進而抑制鼻咽癌EMT。提示miR-454-3p可能是鼻咽癌轉(zhuǎn)移風險的潛在預測指標，其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移機制中的潛在分子機制值得進一步深入探究。