陳思卿,胡齊,潘飛兵,匡鳳姣,包怡紅*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,哈爾濱150040;2.海南華創(chuàng)檳榔研究院,海口570100;3.海南口味王科技發(fā)展有限公司,海南萬寧571500)

檳榔(ArecacatechuL.)是棕櫚科熱帶作物,主要種植在海南和臺灣兩省,在廣西、云南等地也有種植[1],是我國四大南藥之首。檳榔始載于晉代李當(dāng)之《藥錄》,在中國有一千多年的藥用歷史,具有驅(qū)蟲破積,降氣行滯等功效[2]。目前研究表明,其主要活性成分為生物堿和多酚類化合物,具有改善腸道功能[3]、抗氧化[4]、治療糖尿病[5]、促進(jìn)神經(jīng)興奮[6]等功能。據(jù)統(tǒng)計,除小部分藥用外,大部分檳榔用于鮮食和檳榔產(chǎn)品的加工制作[7]。隨著檳榔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,檳榔加工產(chǎn)品成為湖南食品深加工行業(yè)不可或缺的一部分,因此加深對檳榔活性功能的認(rèn)識及深加工工藝的研究與開發(fā),加速檳榔產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型,促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與精細(xì)化具有重要意義。

近年來,植物多酚的開發(fā)利用得到了極大的發(fā)展,其具有抗氧化、抗腫瘤、防治心腦血管疾病等多種功能,有較高的開發(fā)和利用價值。檳榔核是檳榔果的加工副產(chǎn)物,國內(nèi)檳榔果多以果肉加工制品進(jìn)行銷售,果核大多進(jìn)行廢品處理,但果核中含有大量多酚等活性成分。目前,國內(nèi)外研究者從多個領(lǐng)域、多個角度對檳榔核多酚進(jìn)行了基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。試驗以檳榔果核為原料,采用超聲輔助溶劑提取檳榔多酚,以提取液濃度、提取溫度、提取時間、料液比為影響因素,多酚提取量為評價指標(biāo),通過正交試驗進(jìn)行工藝優(yōu)化,有效提高多酚提取量,并對檳榔核多酚進(jìn)行體外降血糖活性測定,為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：檳榔果核(由海南口味王科技發(fā)展有限公司提供)。

試劑： Folin-Ciocalteu試劑,北京博奧拓達(dá)科技有限公司；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、沒食子酸標(biāo)品,上海源葉生物科技公司；可溶性淀粉、無水乙醇、無水碳酸鈉等均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司；721型可見分光光度計,上海佑科儀器有限公司；ELx800NB型酶標(biāo)儀,美國Bio Tex公司；電熱恒溫水浴鍋DK-8D,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；pH計,Sartorius;電子天平、移液槍以及其他實驗室常用儀器設(shè)備。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,參考GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[8],根據(jù)FC-酚法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,稱取(0.110±0.001) g沒食子酸,溶解并定容至100 mL。分別準(zhǔn)確移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于100 mL容量瓶中并定容,再分別移取1.0 mL與5.0 mL 10%Folin酚試劑和4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液于室溫暗反應(yīng)1 h,在765 nm波長下測定吸光值,以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo),溶液吸光度為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.1097X-0.0058(R2=0.9991)。

1.3.2 檳榔核提取物的制備

將干燥除雜后的檳榔核粉碎,過60目篩,精確稱取樣品0.5 g,以乙醇溶液為提取劑進(jìn)行超聲波輔助提取,冷卻后于4000 r/min離心10 min,收集上清液。取1 mL上清液用水定容至100 mL,備用。

1.3.3 檳榔核提取物中多酚提取量的測定

吸取1.0 mL檳榔核多酚提取液,參照1.3.1進(jìn)行多酚提取量測定,以沒食子酸計,并按照下式計算多酚提取量。

式中：C為多酚質(zhì)量濃度(μg/mL)；V為提取液總體積(mL)； N為提取液總稀釋倍數(shù)；M為檳榔核質(zhì)量(g)。

1.3.4 體外降糖能力測定

1.3.4.1 檳榔核提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用：參考文獻(xiàn)[9]的方法：將配置好的樣品溶液稀釋10倍,取10 μL稀釋后的樣品溶液和40 μL α-葡萄糖苷酶溶液(7 U/mL)加入96微孔板中,在酶標(biāo)儀中37 ℃孵化10 min,加入50 μL的pNPG(2 mmol/L),在37 ℃下反應(yīng)30 min,再加入50 μL Na2CO3(1 mol/L)終止反應(yīng),在 405 nm波長處酶標(biāo)儀測定其吸光度。對照組以磷酸鹽緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶,空白組以磷酸鹽緩沖溶液代替樣品溶液。

1.3.4.2 檳榔核提取物對α-淀粉酶的抑制作用：參考文獻(xiàn)[10]的方法。將配置好的樣品溶液稀釋10倍,取300 μL稀釋后的樣品溶液和300 μL α-淀粉酶溶液(10 U/mL)于試管中,置于37 ℃恒溫水浴中溫孵15 min,再加入300 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉溶液開始反應(yīng),15 min后各加入500 μLDNS試劑顯色,在沸水浴中反應(yīng)5 min,然后立即置于冰水浴中冷卻,于540 nm波長處測定吸光度。對照組以磷酸鹽緩沖溶液代替α-淀粉酶溶液,空白組以磷酸鹽緩沖溶液代替樣品溶液。

1.3.5 單因素試驗

按1.3.2中的操作方法對檳榔核中的多酚進(jìn)行提取和測定,分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、超聲時間(20、30、40、50、60 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)對多酚提取量的影響,以提取液中的多酚含量為考察指標(biāo)。

1.3.6 正交試驗

在單因素的基礎(chǔ)上,分別考察A料液比、B超聲時間、C乙醇體積分?jǐn)?shù)、D提取溫度對多酚提取量的影響,進(jìn)行正交試驗L9(34)設(shè)計。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組實驗至少重復(fù)3次,采用Origin 9.65繪圖軟件繪圖,SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對檳榔核提取物中多酚提取量及降糖活性的影響

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,多酚提取量先升高后降低,由圖1可知,在50%乙醇體積分?jǐn)?shù)時,多酚提取量最高,為93.93 mg/g,繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù),多酚提取量下降。乙醇體積分?jǐn)?shù)可能會影響多酚的溶解度[11],檳榔核中脂溶性物質(zhì)和醇溶性物質(zhì)溶出量增加,使多酚與乙醇-水分子結(jié)合量減少,多酚的提取量降低。檳榔核提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,在實驗范圍內(nèi),提取物對α-淀粉酶的抑制作用隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而降低,乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%抑制效果最好,抑制率為80.01%；提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后降低,乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%抑制效果最好,達(dá)到84.19%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

2.1.2 提取溫度對檳榔核提取物中多酚提取量及降糖活性的影響

隨著提取溫度的升高,多酚提取量逐漸增大,由圖2可知,在提取溫度超過60 ℃后,多酚提取量增加不顯著,分別為98.73、98.76、99.12 mg/g。這一現(xiàn)象可能是由于溫度升高,分子動能增加,溶解速率增加,導(dǎo)致提取液中多酚溶解量增大。在實驗范圍內(nèi),提取物對α-淀粉酶的抑制作用隨著溫度的升高,先升高后降低,70 ℃下的提取液對α-淀粉酶的抑制效果最好,抑制率為88.67%；提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著溫度的升高而升高,在40～50 ℃之間變化較顯著,50 ℃之后抑制效果較穩(wěn)定,70 ℃條件下抑制率為80.37%。

圖2 提取溫度對多酚提取量及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

2.1.3 超聲時間對檳榔核提取物中多酚提取量及降糖活性的影響

隨著超聲時間的增長,多酚提取量先升高后降低,由圖3可知,在超聲時間為40 min時多酚提取量最高,為95.21 mg/g。這可能是因為提取量隨著時間的增長而累積。在實驗范圍內(nèi),提取液對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著超聲時間的增長,其趨勢都為先升高后降低,40 min條件下提取液的抑制作用最顯著,α-淀粉酶的抑制率為89.74%,α-葡萄糖苷酶的抑制率為88.89%。

圖3 超聲時間對多酚提取量及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

2.1.4 料液比對檳榔核提取物種多酚提取量及降糖活性的影響

多酚提取量隨著溶劑體積的增加而增加,由圖4可知,當(dāng)料液比為1∶60時多酚提取量達(dá)到最大,為103.51 mg/g。這可能是由于溶劑用量的增大,接觸面積增大,使多酚的提取量增大。由于溶劑用量逐漸增大,提取液的濃度逐漸降低,但對于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶仍有較高的抑制作用。

圖4 料液比對多酚提取量及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

2.2 正交試驗

以多酚提取量為指標(biāo),用正交試驗對檳榔核多酚提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,正交試驗各個因素水平設(shè)置見表1,正交實驗結(jié)果與分析見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 檳榔核多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果表

如表2所示,影響檳榔核多酚提取量的因素依次為料液比>超聲時間>提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù),對檳榔核多酚的最佳提取條件為A3B2C2D3,即料液比1∶60(g/mL),超聲時間40 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,提取溫度80 ℃,在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗證試驗,所得檳榔核多酚提取量為111.47 mg/g,對α-淀粉酶的抑制率為90.51%,對α-葡萄糖苷酶的抑制率為89.67%。

3 結(jié)論

本實驗以檳榔核為原料,以多酚提取量、α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標(biāo),考查料液比、超聲時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對醇提液中多酚提取量及降糖活性的影響。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用正交試驗優(yōu)化超聲輔助提取的工藝參數(shù),得出多酚提取量最高的工藝參數(shù)為料液比1∶60(g/mL),超聲時間40 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,提取溫度80 ℃,所得檳榔核提取液的多酚提取量為111.47 mg/g,對α-淀粉酶的抑制率為90.51%,對α-葡萄糖苷酶的抑制率為89.67%。研究結(jié)果可為工業(yè)化提取檳榔核中多酚,實現(xiàn)檳榔核高值化利用提供技術(shù)依據(jù)。