鐘世歡，陳青俊 *，王京，葉佳明，楊琳，王岳，陳云義，孫崇德

1(贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州，310030)2(浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江 杭州，311305) 3(浙江大學(xué) 果實(shí)品質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州，310058)

柚子在我國栽培時間悠久，種植面積廣，具有清香、涼潤等優(yōu)良特點(diǎn)，被人們譽(yù)為果中珍品之一。檸檬苦素類化合物為一類三萜類物質(zhì)，是植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于蕓香科和楝科植物中，其中蕓香科柑桔屬植物是檸檬苦素類化合物的主要來源。

近年來，隨著研究的不斷深入，檸檬苦素類化合物的生物活性與藥理功能日益受到重視。有研究表明，檸檬苦素類化合物具有顯著的抗癌活性[1-2]，如結(jié)腸癌，胃癌等，還可防治骨質(zhì)疏松癥，提高骨礦物質(zhì)的密度和含量，調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平，抗炎化保護(hù)肝臟等[3-4]，檸檬苦素類具有與維生素C相當(dāng)?shù)目寡趸锘钚訹5]，且具有一定抗菌性[6]，可用于食品防腐，在藥品原料和天然食品添加劑方面具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。此外，檸檬苦素類物質(zhì)還具有催眠、抗焦慮、調(diào)節(jié)細(xì)胞色素及改善心腦血管循環(huán)的作用[7]。在農(nóng)業(yè)方面，檸檬苦素類物質(zhì)被認(rèn)為具有部分昆蟲拒食、調(diào)節(jié)作物生長等作用，作為植保方面的綠色殺蟲劑，用于生防也具有較好的前景[8]。將其添加至飼料中可增強(qiáng)動物抗應(yīng)激和解毒能力，有利于動物健康，同時還有利于飼料保藏等[9]。

目前國內(nèi)外報道的關(guān)于測定檸檬苦素類化合物的方法有熒光檢測法[10]、分光光度法[11]、放射免疫法[12]、高HPLC法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[13-16]，但主要測定到的物質(zhì)僅局限于檸檬苦素和諾米林，同時測定檸檬苦素、諾米林、黃柏酮3種化合物的方法較少。且大多數(shù)是局限于某一種柚類果實(shí)或者相同部位的方法，針對不同種類柚類果實(shí)中不同部位的檸檬苦素化合物測定分析尚未有報道。目前帶二極管陣列檢測器(diode array detector，DAD)的HPLC儀應(yīng)用普遍，可對目標(biāo)物進(jìn)行純度分析。我國柚類果實(shí)加工的大量副產(chǎn)物被當(dāng)作廢棄物丟棄，其中的檸檬苦素類化合物若能被高效合理地利用，將會帶來顯著的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

本研究采用QuEChERS-HPLC法同時測定柚類果實(shí)中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮3種檸檬苦素類化合物，高效便捷，并測定比較了不同品種柚類果實(shí)以及不同果實(shí)組織部位中含量的差異，為柚類果實(shí)中檸檬苦素類化合物在食品和醫(yī)藥等方面利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種檸檬苦素類似物標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬苦素(CAS:80226-00-2，純度≥98%)、諾米林(CAS:1063-77-0，純度≥98%)、黃柏酮(CAS:751-03-1，純度≥98%)，中國藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇均為色譜純，賽默飛世爾科技；磷酸(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

樣品均為種植基地采摘的‘楚門文旦’、‘早熟暹羅柚’、‘五布紅心柚’、‘強(qiáng)德勒柚’、‘舒化柚’、‘脆香甜柚’和‘馬家柚’，將果實(shí)的果肉、囊衣、白皮層、油胞層4個部位分離，經(jīng)冷凍粉碎后，四分法縮分出適量備用。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀，帶DAD檢測器，美國Agilent公司；AR2140電子分析天平，常州奧豪斯儀器有限公司；KS-300EI超聲波清儀，寧波海曙科生超聲設(shè)備公司；Centrifug-5804R臺式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；均質(zhì)器，德國弗魯克公司；Milli-Q純水，美國Millpore公司。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g(精確至0.01 g)至離心管，加25.00 mL乙腈，均質(zhì)勻漿，加5.0 g氯化鈉后再次勻漿，放入超聲波中超聲提取20 min，離心分層后取10.0 mL上清液加入裝有900 mg MgSO4，450 mgN-丙基乙二胺(N-propylenediamine，PSA)和50 mg石墨化炭黑(graphitized carbon black，GCB)凈化管中凈化，離心取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后供HPLC分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g(精確至0.000 1 g)于同一10.00 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容刻度，得到檸檬苦素、諾米林、黃柏酮質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-20 ℃避光保存。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18MG(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10.0 μL；柱溫：35 ℃；檢測器：DAD，檢測波長：210 nm；流動相：A為0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件確認(rèn)

本方法用DAD在190～700 nm對檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的色譜峰進(jìn)行掃描，選擇210 nm為檢測波長。

本研究選用了3種C18色譜柱，分別為Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、CAPCELL PAK C18MG (250 mm×4.6 mm，5 μm)，并對其分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,3種色譜柱在分離效果方面相當(dāng)，目標(biāo)峰對稱性均良好。相比較3種色譜柱，CAPCELL PAK C18MG (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜分析柱基線波動較小，目標(biāo)峰附近基線平穩(wěn)，故選之。不同色譜柱分離效果色譜圖見圖1。

流動相選用0.2%磷酸水溶液和乙腈兩相體系進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)優(yōu)化，確定了表1的梯度洗脫程序，3種檢測目標(biāo)物得到完全分離。

1-檸檬苦素；2-諾米林；3-黃柏酮(下同) a-Inertsil ODS-3 C18；b-Eclipse XDB C18；c-CAPCELL PAK C18 MG圖1 不同色譜柱分離效果色譜圖Fig.1 Chromatogram of separation effect of different chromatographic column

2.2 提取與凈化

根據(jù)該3種化合物的性質(zhì)，本方法考察了不同溶劑對其提取效率，比較了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷及乙酸乙酯溶液的提取效果。由圖2可知，以乙腈作為提取劑時，3種檸檬苦素類化合物響應(yīng)均高于其他提取溶劑，且測定過程不需要轉(zhuǎn)換溶劑，所以本方法采取乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑提取效果Fig.2 Extraction effects of different solvents

在實(shí)際樣品測定時，部分樣品有干擾物存在，本方法考察了3種QuEChERS凈化管對其凈化效果，分別是a(900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB)，b(900 mg MgSO4+300 mg C18)，c(900 mg MgSO4+150 mg PSA)。該3種凈化管對樣品凈化效果如圖3所示。結(jié)果表明凈化管中的PSA可有效去除糖和有機(jī)酸等糖類等極性干擾物，GCB可去除色素等干擾物。測定時比較了通過各凈化管得到的色譜圖峰高，無顯著差異，說明凈化管對樣品中目標(biāo)物無吸附。如圖3-a所示，3種檸檬苦素類化合物色譜峰對稱，除雜效果明顯，尤其是檸檬苦素色譜峰無雜質(zhì)影響，所以本方法采取a(900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB)作為凈化管。

a-(900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB)；b-(900 mg MgSO4+300 mg C18)；c-(900 mg MgSO4+150 mg PSA)圖3 不同凈化管的色譜圖Fig.3 Chromatograms of different purification tubes

2.3 方法線性、檢出限

配制0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中各組分的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用逐級稀釋的方法，以3倍信噪比確定檢出限。線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限分別見表2。結(jié)果顯示,檸檬苦素、諾米林和黃柏酮在0.1～200.0 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.4 回收率試驗(yàn)

在1.3方法條件下，選取‘楚門文旦’樣品，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按照1.3.1重復(fù)測定6次，由表3可知，各樣品測得加標(biāo)回收率為99.0%～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～2.1%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法精密度和回收率均良好。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equation, correlation coefficient and detection limit

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果(n=6)Table 3 Results of recovery rate(n=6)

2.5 柚類果實(shí)含量測定

采用本方法分別測定不同品種柚子果實(shí)的果肉、囊衣、白皮層、油胞層不同部位檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的含量，結(jié)果見表4。4個組織部位中，囊衣中的3種檸檬苦素類似物含量較高，與其他部位差異顯著。3種檸檬苦素類化合物中，檸檬苦素和諾米林的含量高于黃柏酮。幾個柚類果實(shí)品種中，‘早熟暹羅柚’、‘強(qiáng)德勒柚’和‘舒華柚’的檸檬苦素類化合物的含量較高，其中‘舒華柚’的囊衣中諾米林含量達(dá)678.9 mg/kg?！嘞闾痂帧汀R家柚’的檸檬苦素類化合物含量較低，其中‘脆香甜柚’的囊衣中諾米林含量僅為269.7 mg/kg，而‘馬家柚’囊衣中的檸檬苦素含量僅為193.6 mg/kg。

表4 不同品種柚類果實(shí)的不同部位中檸檬苦素類化合物含量 單位：mg/kg

3 結(jié)論與討論

本方法建立了檸檬苦素類似物的QuEChERS-HPLC檢測方法，并測定柚類果實(shí)中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量。樣品凈化選擇了900 mg MgSO4+450 mg PSA+50 mg GCB QuEChERS凈化管處理方式，有效去除了柚類果實(shí)中糖、有機(jī)酸、色素等干擾雜質(zhì)。方法操作簡單，快速高效，具有較強(qiáng)抗干擾能力，線性、精密度和回收率均良好。

應(yīng)用本方法測定比較了柚類果實(shí)不同品種以及不同果實(shí)組織部位中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量，發(fā)現(xiàn)存在較大差異，各組織部位中，囊衣中的檸檬苦素含量最高，且檸檬苦素和諾米林的含量高于黃柏酮的含量。‘早熟暹羅柚’、‘強(qiáng)德勒柚’和‘舒華柚’品種中檸檬苦素類化合物的含量較高量。這一規(guī)律可為柚類果實(shí)中檸檬苦素類化合物在食品和醫(yī)藥等方面進(jìn)行利用研究提供參考。