張士雙，李林波，田靜，王寶石，楊天佑

(河南科技學院 生命科技學院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

精釀啤酒不同于工業(yè)啤酒，因其麥汁濃度高、酒精度高、濃烈香郁的風味越來越受到消費者的喜愛[1]。國內一般的工業(yè)啤酒的酒精度普遍在2.5%～3.5%(體積分數，全文同)，進口啤酒普遍在4.5%～5.5%，精釀啤酒酒精度更高，甚至高達10%以上。高酒精度啤酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母往往會受到各種環(huán)境因子脅迫，如溫度、滲透壓、以及終產物乙醇濃度等[2]。高濃度的乙醇環(huán)境是影響啤酒酵母活力的關鍵因素，其中主要表現為影響細胞的形態(tài)及生長，使細胞活力下降[3]，呼吸能力下降，葡萄糖同化能力減弱，發(fā)酵性能下降，膜的通透性增加[4]，膜內pH值下降等[5]。高酒精度對釀酒酵母的毒性作用成為高酒精度精釀啤酒提升的瓶頸，隨著精釀啤酒的酒精含量的提高，必然會對啤酒酵母產生一系列的脅迫作用，這種乙醇脅迫影響已經成為高酒精度精釀啤酒釀造的關鍵制約因素。

本文介紹了國內外精釀啤酒發(fā)展現狀，結合精釀啤酒的乙醇脅迫問題和釀酒酵母酒精耐受機理從菌種選育，增加海藻糖(trehalose,TRE)含量、提高麥角甾醇(ergosterol,ERG)、添加氮源方面探討了高酒精度精釀啤酒釀造中乙醇脅迫這一瓶頸的對策。

1 高酒精度精釀啤酒的發(fā)展現狀

啤酒在傳入我國后經歷了飛速發(fā)展，于2002年超越美國成為世界第一大啤酒市場，但是我國的啤酒消費市場多為工業(yè)啤酒。工業(yè)啤酒是以大麥芽、玉米、大米、水、啤酒花為原料，采用拉格工藝生產，原麥汁濃度為8～9 °P，多屬于淡色啤酒，且口感單一。因此導致了啤酒市場中各啤酒產品間同質化、低質化嚴重，另隨著國人對啤酒多樣化的需求從而致使近年來的啤酒消費市場低糜[6]。但是由于西歐國家的精釀啤酒風格獨特多樣且風味豐富，因此在國內大受追捧。精釀啤酒是由小型啤酒廠或是工坊以大(小)麥芽、水、啤酒花及為了風味和口感添加的新型釀造原料為原材料，利用傳統(tǒng)的釀造工藝生產的具有獨特風味的啤酒[7]。精釀啤酒為了追求豐富的口感和濃郁的風味多采用高濃釀造技術，其原麥汁濃度高達14 °P以上，并且酒精度也基本上都在4.5%以上，屬于高酒精度啤酒[8]。表1為工業(yè)啤酒與精釀啤酒的區(qū)別。

表1 工業(yè)啤酒與精釀啤酒的差別Table 1 The difference between industrial beer and craft beer

隨著精釀啤酒的浪潮席卷全球，市場精釀啤酒風格也是逐漸豐富多樣，但是原麥汁濃度和營養(yǎng)價值愈來愈高、香味復雜且濃郁、口感厚重且伴隨而來的就是酒精度也在不斷提高。常見精釀啤酒的原麥汁濃度和酒精度見表2。

表2 常見精釀啤酒酒精度和原麥汁濃度Table 2 Alcohol content and original wort concentration of common craft beer

目前高酒精度精釀啤酒主要在西歐和亞太市場上比較流行，如丹麥、捷克、愛爾蘭、波蘭、菲律賓和印度等[9]。國外市場上主要的高酒精度啤酒品種見表3。據統(tǒng)計，在印度Kingfisher，Haywards 5000，蛇王啤酒的King Cobra等高酒精度啤酒消費在整個啤酒消費市場的占有份額高達1/2，在菲律賓，Red Horse成為了僅次于生力啤酒的第二大啤酒品牌，其酒精度可達到7.0%～8.0%，而國內生產高酒精度啤酒的則是鳳毛麟角，如藍帶船長啤酒，酒精度為10.0%[10]。中國消費者崇尚白酒，喜好高酒精度的酒水飲品，隨著我國精釀啤酒的興起，高酒精度精釀啤酒與國內消費者對高酒精度的推崇及對啤酒高品質需求相吻合，是我國精釀啤酒開發(fā)的重要領域，其研究開發(fā)不僅可滿足廣大啤酒愛好者的需求，對于釀酒商提升市場競爭力進入高端啤酒市場也具有重要意義[11]。

2 精釀啤酒的乙醇脅迫問題

釀酒酵母作為乙醇生產主要微生物，在實際發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵醪液中酒精含量的不斷積累，會對酵母菌株產生毒害作用。在相對較低的濃度，可抑制細胞分裂，降低細胞體積和比生長率，當發(fā)酵液中的酒精度高于5%時，乙醇則會對細胞造成損傷和細胞活力衰弱，甚至當乙醇濃度過高時會造成細胞死亡[12]。高濃度的乙醇脅迫作用表現為影響細胞膜的完整性和流動性，改變離子的通透性，引起跨膜電化學勢的消失，進而導致細胞內pH降低，酶活性改變和細胞死亡。還會改變蛋白質的立體結構，導致蛋白質變性和功能失活，例如糖酵解中關鍵酶丙酮酸激酶和己酮激酶。高濃度的乙醇還會影響酵母細胞對麥芽糖、葡萄糖、氨基酸(amino acid,AA)的攝取，并導致細胞AA、核苷酸、蛋白質和鉀離子的外滲。乙醇對酵母細胞的主要脅迫作用[5]，見表4。

在啤酒領域中，10%高酒精度的啤酒釀造一直是個難題，而對于國外目前存在的超高酒精度啤酒，如歷史終結者(The End of History)、封頂之作(Schorschbock)、蛇毒(Snake Venom)等，但是這3種啤酒并不是傳統(tǒng)的經過發(fā)酵而來的啤酒，因為這些超高度的啤酒經過了特殊的后期冷凍或蒸餾處理，這種制作工藝已經超出了傳統(tǒng)啤酒釀造的范疇。高酒精度對啤酒酵母的脅迫作用是精釀啤酒酒精度提升的瓶頸，降低高酒精度對酵母的毒害已經成為高酒精度精釀啤酒釀造亟待解決的關鍵問題。

表4 乙醇對酵母細胞的主要毒性[5]Table 4 Some effects of ethanol on yeast physiology

3 釀酒酵母的乙醇耐受機理

3.1 TRE與乙醇耐受

TRE水合能力強和穩(wěn)定性高，在脅迫條件下起到作為保護劑維持細胞活力作用，已經成為評價酵母乙醇耐受性的重要指標[13]。SHARMA[14]以高濃度NaCl及乙醇作為選擇壓力，篩選獲得乙醇耐受突變菌株，研究表明選育的酵母菌株TRE和存活率顯著高于野生型菌株。王憲斌等[15]研究顯示酵母存活率與TRE量關系密切，存活率隨著胞內TRE累積量增加而增加。當酵母處在乙醇脅迫環(huán)境中時，TRE可通過取代酵母細胞膜上的水和乙醇，與脂質極性基團之間形成氫鍵，起到穩(wěn)定酵母細胞膜作用[16]，也可防止蛋白質聚集和羰基化來保護細胞質蛋白，還可以幫助菌體蛋白進行適當折疊達到修復變性蛋白的效果，同時，TRE在流體條件下可以維持脂質雙分子層結構[17]。酵母TRE合成基因涉及TPS1、TPS2、TPS3和TSL14個基因，而其分解與海藻糖酶基因NTH1、NTH2、ATH1有關，這些基因與酵母的乙醇耐受能力密切相關。ALEXANDRE等[18]發(fā)現乙醇脅迫引起酵母TRE合成基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1表達水平呈現上調的趨勢，乙醇誘導TRE合成基因的表達產生更多TRE抵御乙醇脅迫。MAHMUD等[16]將中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2和酸性海藻糖酶基因ATH1同時敲除，并對TRE酶缺陷菌株進行乙醇耐受性分析，發(fā)現缺陷菌株TRE合成基因TPS1和TPS2表達增強，缺陷菌株TRE含量比原始菌株FY834高，海藻糖酶基因缺失可提高TRE表達進而增強酵母的乙醇耐受能力。

3.2 ERG與乙醇耐受

膜脂包括磷脂、鞘脂和固醇類等，除了磷脂和鞘脂脂肪酸會對酵母乙醇耐受性產生影響外，固醇含量及其他組成基團的變化也會改變酵母細胞乙醇耐受性[4]。研究發(fā)現許多真菌都可以合成ERG，是質膜上的主要甾醇成分，特別是酵母細胞可能將其作為首選甾醇，它參與細胞膜完整性、流動性、通透性和膜結合酶的活性等，是一種公認的具有多種功能的甾醇[19]。高濃度的麥角固醇與酵母的乙醇耐受性呈現一定的正相關關系[20]，DONG等[21]通過研究酵母細胞乙醇發(fā)酵時不同時期細胞的細胞膜成分變化來了解酵母細胞的應激機制，結果發(fā)現在指數期和穩(wěn)定期細胞的ERG含量升高。并且GIBSON等[22]也發(fā)現與乙醇敏感型的工業(yè)酵母菌相比，產高濃度乙醇的酵母在有氧分批培養(yǎng)過程中能合成較多的麥角固醇，更關鍵的是，在應對高濃度乙醇沖擊時，死亡速率明顯慢于乙醇敏感型酵母，這說明麥角固醇與酵母耐高濃度乙醇有密切關系。ZHANG等[23]對釀酒酵母菌株ZTW1進行誘變并進行酒精發(fā)酵實驗，發(fā)現突變菌株ZG27的ERG3基因發(fā)生突變，致使突變菌株ZG27酒精產量比ZTW1高7.9%，ERG產量比ZTW1高43.2%，證明ERG的含量與乙醇耐受密切相關。KUBOTA等[24]敲除ERG相關基因ERG2、ERG3、ERG5、ERG6、ERG24、ERG28后相關突變株不能在乙醇的脅迫下生長。

3.3 AA與乙醇耐受

在乙醇壓力下，AA通過調節(jié)滲透壓穩(wěn)定細胞內的生物大分子結構，增加微溶蛋白的溶解性，降低DNA的溶解溫度值等，以促使提高酵母細胞的乙醇耐受性。酵母的發(fā)酵過程中，脯氨酸對保護酵母細胞免于逆境脅迫表現出重要的作用，它可以提高蛋白質的穩(wěn)定性，同時，還可避免蛋白質在折疊過程中發(fā)生凝集[25]。TAKAGI等[26]將野生型酵母的PRO1基因替換為pro1d154n基因后，酵母的脯氨酸合成含量明顯增加，同時酵母的乙醇耐受性也得到了提高。除此之外，TAKAGI等[27]的研究結果表明PRO1基因敲除菌的乙醇耐受性明顯較野生型酵母差，也闡明了脯氨酸對酵母乙醇耐受性的重要貢獻。色氨酸是另一種被認為與酵母乙醇耐受性密切相關的AA，HIRASAWA等[28]采用DNA微陣列技術對清酒釀造酵母與釀酒酵母FY834進行分析，發(fā)現色氨酸合成基因與酵母的乙醇耐受性有緊密的聯(lián)系，過表達色氨酸合成基因TRP1～5、色氨酸通透酶基因TAT2，或在培養(yǎng)基中補充色氨酸，均可以提高酵母的乙醇耐受性。

綜上所述，酵母的乙醇耐受性與TRE、ERG、AA密切性關，因此整合了與酵母的乙醇耐受相關研究文獻并總結了酵母的乙醇耐受與TRE、ERG、AA可能存在的相關機制如圖1 所示。

圖1 酵母的乙醇耐受與TRE、ERG、AA的關系Fig.1 Relationship between ethanol tolerance and TRE, ERG, AA in Saccharomyces cerevisiae

4 精釀啤酒乙醇脅迫問題的對策

高濃麥汁釀造工藝前期的高滲透壓導致啤酒酵母的起發(fā)酵困難，并且隨著發(fā)酵的進行，乙醇濃度不斷增加又會給細胞帶來損傷，嚴重制約了精釀啤酒的發(fā)展。精釀啤酒釀造過程中高濃度乙醇帶來的壓力可通過選育高乙醇耐受性啤酒酵母和改良發(fā)酵培養(yǎng)基的成分來緩解。

4.1 選育酒精耐受性啤酒酵母

精釀啤酒所需的乙醇耐受性菌株可通過自然選育、誘變、雜交、原生質體融合、基因工程及基因組改組等途徑獲得。

自然選育是從特殊環(huán)境(高滲透壓、高溫、高酒精度)中存在的自發(fā)突變體中篩選具有優(yōu)良特性的菌株，該方法簡單實用，目前仍是篩選高乙醇耐受性酵母菌株的常用方法之一。ARACHCHIGE等[29]從斯里蘭卡的棕櫚酒中分離得到18種釀酒酵母菌株，并且通過分批發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)現這些菌株產生的酒精度要高于對照菌株。EDGARDO等[30]通過自然選育和適應進化篩選到能夠耐受42 ℃高溫的優(yōu)良菌株，且乙醇產量可以達到理論值的75%。

誘變選育是通過物理或化學方式使微生物發(fā)生基因突變，并通過定向篩選得到優(yōu)良的目的菌株，目前仍然被工廠廣泛采用。王犁燁等[31]報道了利用紫外誘變得到的突變株Y6-5能夠耐受更高的乙醇濃度，且能夠穩(wěn)定遺傳，與原始菌株Y6相比較，其產酒精能力提高了28.13%。近年來，研究者開發(fā)出了更易操作和高效的常壓室溫等離子體(atmospheric and room remperature plasma ARTP)技術，梁若楠[10]采用ARTP技術進行誘變處理，選育的突變株SC16在24 °P的超高濃發(fā)酵過程中發(fā)酵速度更快，并且與出發(fā)菌株相比，其酒精度提高了8.1%。

雜交育種是將同一種屬的2株具有不同優(yōu)良性狀菌體進行雜交，遺傳物質的結構被打亂然后又重新組合，最后在它們的雜交子代中甄選出具有這兩株親本菌株優(yōu)良性狀純合子的育種方法。ORIGONE等[32]報道了利用SaccharomyceseubayanusNPCC1292與Saccharomycesuvarum兩種酵母作為親本進行種間雜交獲得能夠穩(wěn)定遺傳且可耐受12.57%酒精度的H19菌株。KROGERUS等[33]通過種間雜交技術構建了不同倍體的雜交菌株，通過在高濃麥汁15 °P 和超高濃麥汁25 °P進行發(fā)酵實驗，研究結果表明雜交菌株比親本菌株有更好乙醇耐受性。SANHEZ等[34]利用經典遺傳學的方法獲得了Saccharomycescerevisiae和S.eubayanus的雜交菌株，并且經過發(fā)酵試驗驗證，證明獲得的新型突變株有更好乙醇耐受性和發(fā)酵性能。

原生質體融合技術是指將兩種菌種的原生質體相互融合，進而其基因組會相互接觸并進行基因交換，最終2株菌種的基因再進行重組，獲得雙親本都具有的優(yōu)良性狀的突變菌株[35]。SHI等[36]利用原生質體融合技術得到1株菌株，對其進行紫外輻照誘變，最終篩選到1株能夠耐受20%(體積分數)乙醇的菌株。XIN等[37]利用菌株Q和菌株L進行原生質體融合技術得到了1株融合菌株Q/Lf2，可以耐受14%(體積分數)的乙醇。

基因工程育種通常是通過基因工程手段刪除或過表達與乙醇耐受基因相關的某一基因或多個基因，從而達到使突變菌株能夠耐受更高乙醇濃度的目的。與傳統(tǒng)育種相比，基因工程育種技術具有很清晰的目標靶點，特別是在生物育種方面，利用構建目的DNA片段，從而獲得理想的菌株。李佳等[38]采用基因工程手段構建了18S rDNA介導的FKS1基因過表達菌株，該菌株能夠耐受8%(體積分數)的乙醇。OOMURO等[39]通過基因工程手段構建了Δrim15突變株，該突變株能夠耐受20%高濃麥汁或是高濃度的糖液，并且能夠明顯提高發(fā)酵速率和酒精度。

基因組改組使得子代篩選群體內的遺傳多樣性更加豐富，從而使具有優(yōu)良性狀的菌株獲得概率顯著提高，1998年STEMMER提出了全基因組改組技術，隨即該技術被各個領域的研究者用于自己的相關研究中。SHI等[36]以工業(yè)釀酒酵母SM-3作為出發(fā)菌株，對其進行3輪基因組改組，獲得乙醇高耐受菌株F34，其不僅可以在20%葡萄糖下保持發(fā)酵活力，而且其產酒精量高達9.95%。王灝等[40]利用對利用原生質體融合技術對f4、f5及f6融合，并經過紫外照射后再經過2輪的基因組改組，獲得了相較于出發(fā)菌株有更高的乙醇濃度耐受性酵母菌株R24。陸筑鳳等[41]對5株酵母菌株作為出發(fā)菌進行多輪基因組改組，并對融合后的子代菌株遴選，最終獲得的酵母菌能耐受16%(體積分數)乙醇。因此，應用基因組改組技術可以將多種優(yōu)良性狀菌株的基因組進行整合重組，構建出理想的酵母菌株，將對乙醇生產與釀酒工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

4.2 增加TRE增強酵母乙醇耐受

TRE與釀酒酵母細胞乙醇耐受關系密切，提高TRE含量增強酵母的乙醇耐受能力。目前研究報道表明可通過促使海藻糖合成酶相關基因的表達或是提高外源性TRE的含量兩種途徑達到提高TRE的目的。提高酵母細胞內海藻糖合成酶相關基因的表達量的方式是多種多樣，如適當的環(huán)境脅迫，優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)成分和通過基因工程手段等。利用基因工程手段對TRE合成及降解基因進行改良可顯著提高酵母細胞內TRE含量[42]。研究同時發(fā)現，在培養(yǎng)基中添加外源性TRE，同樣可以有效提高釀酒酵母的乙醇耐受性[43]。O′SHEA等[44]的研究發(fā)現通過外源添加TRE的方式提高了乙醇脅迫下酵母細胞的存活率。劉琦等[45]將葡萄酒泥酵母中的TRE提取物以300 mg/L的添加量加入到模擬葡萄汁中，研究其對酵母乙醇耐受性的影響。結果表明，酵母在穩(wěn)定期的生物量和存活率都大幅提高，且其可耐受10%(體積分數)的乙醇脅迫，說明TRE可以提高酵母的乙醇耐受性。可見，外源添加TRE提高釀酒酵母乙醇耐受性，可以有效改善釀酒酵母發(fā)酵特性，有利于釀酒工業(yè)的發(fā)展。

4.3 增加ERG增強酵母乙醇耐受

ERG是酵母細胞膜脂質的重要組成成分之一，與釀酒酵母耐受酒精關系密切。在酒精刺激條件下，酵母細胞通過啟動ERG的相關基因合成ERG，通過ERG含量的增加來提高釀酒酵母細胞對酒精的抗性[21]。HAYASHIDA等[46]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的TRE后證明SaccharomycessakeKyokai No.7的生長和活力明顯增強，并且其酒精產量高達20%(體積分數)。隨后，周進等[47]在培養(yǎng)基中添加不同劑量的ERG，其酒精產量提高了10.1%～23.5%。因此通過外源添加提高酵母細胞內ERG的含量的方式是完全可行的。培養(yǎng)基中添加ERG后，不僅能促進酵母的發(fā)酵速率和提高乙醇產量，而且當釀酒酵母細胞膜中含有豐富的ERG時比含有或膽固醇時乙醇耐受性更強。推測ERG可以增加細胞膜的堅韌性，減少膜的流動性。

4.4 添加氮源提高酵母乙醇耐受

很多研究顯示添加氮源可以加快酵母的發(fā)酵進程，并且能夠提高酵母的耐受乙醇的抗性。YANG等[3]研究在10%(體積分數)的乙醇培養(yǎng)基中添加不同分解度的面筋蛋白發(fā)現分解度越高酵母細胞的活性及耐受能力越高。OOMURO等[48]研究在培養(yǎng)基上加入S-腺苷甲硫氨酸顯著提高了巴氏酵母菌株的發(fā)酵速率。研究發(fā)現同時添加兩種及以上氨基酸對提高酵母乙醇耐受效果更好，LEI等[49]向培養(yǎng)基中添加賴氨酸和組氨酸，結果證實乙醇的產量顯著提高。YANG等[50]通過添加賴氨酸和異亮氨酸研究高糖環(huán)境下酵母細胞發(fā)酵速率和乙醇耐受，發(fā)現將2種氨基酸混合添加更有利于提高酵母細胞對于乙醇的抗性。

5 結束語

隨著中國經濟的持續(xù)穩(wěn)定增長，國內啤酒消費升級帶動產品結構優(yōu)化和價格提升，啤酒市場消費由增量向增質方向轉變，差異化、高品質漸成消費趨勢。目前我國精釀啤酒的年市場增速高達40%，并且國內的精釀啤酒毛利率和凈利率分別能達到50%和30%，高酒精度精釀啤酒成為消費者更高層次的追求趨勢。乙醇高耐性優(yōu)良菌株的選育及精釀啤酒高酒精度釀造工藝探索可能是未來精釀啤酒研發(fā)的重要領域，高酒精度對精釀啤酒釀造制約問題的探明及解決可能成為促進精釀啤酒釀造生產的助推劑。