王華 尹偉 張?jiān)?李成忠

原發(fā)性肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，每年全球新增約90萬新發(fā)病例和83萬死亡病例，其中近一半的新發(fā)病例和死亡病例集中在我國[2]，嚴(yán)重威脅我國人民的身體健康，給社會公共衛(wèi)生帶來沉重的負(fù)擔(dān)。受人群中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)高感染率的影響，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma ，HCC)是我國原發(fā)性肝癌的主要病理學(xué)類型[3]，85%～90%的原發(fā)性肝癌為HCC[4]。HCC的惡性程度通常較高，且多數(shù)HCC患者起病隱匿，早期多無明顯癥狀，近80% 的患者確診時(shí)已屬中晚期，從而錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，因此HCC的早期篩查和診斷極其重要。AFP是目前應(yīng)用最廣的診斷HCC重要的生物學(xué)標(biāo)志物，國內(nèi)外各大指南和共識推薦使用，但臨床中發(fā)現(xiàn)AFP易受一些非HCC疾病(肝炎和肝硬化等)的影響[3]，對于早期HCC和小HCC，其診斷能力較低，并且有30%～40%的HCC患者AFP陰性或低于臨界值。為了彌補(bǔ)AFP的缺點(diǎn)，提高診斷模型的敏感性和特異度，國內(nèi)外學(xué)者尤其對AFP陰性HCC患者早期篩查和診斷進(jìn)行了大量的研究，本文對有望用于AFP陰性HCC患者早期輔助診斷的生物學(xué)標(biāo)志物做一綜述。

一、凝集素反應(yīng)性甲胎蛋白(lensculinaris agglutinin-reactive alpha-fetoprotein ，AFP-L3)

AFP-L3是一種異常糖基化的AFP，是根據(jù)AFP的兩條復(fù)合糖鏈亞結(jié)構(gòu)的不同而衍生出AFP異質(zhì)體。血清AFP-L3值的升高與癌變的肝細(xì)胞分泌較多的AFP-L3有關(guān)，并且AFP-L3占血清AFP的百分比受總的AFP水平和其他疾病影響較小。

Hidenori等[5]研究納入AFP<20 ng/mL的270例的HCC患者和396例慢性肝病患者，采用新一代高靈敏度分析方法檢測血清AFP-L3(%)。當(dāng)AFP-L3(%)取5%為臨界值時(shí)，診斷AFP陰性HCC的靈敏度和特異度分別為41.5%和85.1%，高于常規(guī)檢測方法。這與Zhang Z等[6]的近期研究結(jié)果相近，該研究顯示AFP-L3診斷AFP陰性HCC的AUC為0.6094，靈敏度為50%，特異性為97.5%，準(zhǔn)確性為79.2%。Kumada等[7]的研究還發(fā)現(xiàn)，在AFP陰性HCC患者中，出現(xiàn)影像學(xué)陽性前的3～18個(gè)月即有AFP-L3(%)值升高，34%的HCC患者在確診1年前即出現(xiàn)AFP-L3(%)顯著升高，并且AFP-L3(%)可用于預(yù)測HCC患者預(yù)后，AFP-L3≥7%的患者生存率明顯低于AFP-L3 < 7%的患者。但也有研究[8-10]認(rèn)為AFP-L3單獨(dú)用于診斷早期HCC及AFP陰性HCC的靈敏度較低，用于鑒別HCC和肝硬化準(zhǔn)確性較差?？赡茉蚴歉餮芯坎扇〉腁FP-L3檢驗(yàn)方法、病例納入標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)量存在差異所致。因此，AFP-L3用于AFP陰性HCC早期診斷目前還存在爭議。從以上的研究結(jié)論看，AFP-L3單獨(dú)用于AFP陰性HCC早期診斷的靈敏度并不高，還缺乏統(tǒng)一公認(rèn)的界值，臨床實(shí)踐中可能需要聯(lián)合其他標(biāo)志物。

二、脫-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP)

DCP是癌變的肝細(xì)胞產(chǎn)生的異常凝血酶原，其機(jī)制可能與癌細(xì)胞對維生素K的利用障礙、依賴維生素K的γ谷氨酰羧化酶及輔酶活性降低有關(guān)。

Chen H等[8]發(fā)現(xiàn)血清DCP在CHB相關(guān)HCC中的表達(dá)水平明顯高于單純CHB患者和健康人群，早期診斷 HCC 的AUC 值為 0.82，敏感度為 65.2%，特異度為 90%，明顯優(yōu)于AFP-L3，對AFP陰性和陽性HCC患者具有相似的診斷價(jià)值。 Wang X等[11]人研究同樣針對HBV相關(guān)HCC和CHB患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清 DCP診斷AFP陰性HCC的AUC值為0.73，稍低于Chen H等的研究，但在早期診斷小肝癌(腫瘤<2 cm)方面具有一定價(jià)值(AUC值為0.69)。Ji J[12]等的一項(xiàng)多中心的隊(duì)列研究中，血清DCP在AFP 陰性 HCC早期診斷的AUC為0.856，高于Liu Z等[13](AUC值為0.685)的研究，稍低于Xu F[14]等(AUC值為0.858)和Feng H等[15]人的研究(AUC值為0.88)。而衛(wèi)榮榮[16]等發(fā)現(xiàn)患者血漿DCP取界值61 mAU/mL，診斷AFP陰性HCC的AUC值為0.858，敏感度為72.8%，特異度為88.2%，并且血漿DCP值與腫瘤大小和TNM分期正相關(guān)。目前血漿DCP用于AFP陰性HCC的研究較多，且多數(shù)認(rèn)為具有一定價(jià)值，但還缺乏統(tǒng)一的檢驗(yàn)方法和公認(rèn)的界值。

三、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)

OPN是一種分泌型磷酸化蛋白質(zhì)，在健康人體腎臟和骨骼等組織中少量表達(dá)。病理情況下，OPN可在人體多種腫瘤組織中高表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞趨化、粘附、侵襲和遷移等重要作用。肝細(xì)胞在癌變或遭受炎癥損傷時(shí)分泌OPN增加并進(jìn)入血液[17]。

Shang S等[18]的研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿OPN顯著高于肝硬化患者和健康人群(P<0.05)。在診斷HCC的前一年即可檢出血漿OPN值升高，并且OPN對AFP陰性HCC的早期診斷也有較好的敏感性(AUC值為0.75)。Zhu M等[19]的一項(xiàng)小樣本研究分析得出相似結(jié)論，在AFP陰性HCC患者中，OPN診斷性能良好，AUC為0.838，敏感性達(dá)78.26%，特異性為80.45%。另外，Ge T等[20]和Mona M等[21]的研究同樣認(rèn)為血漿OPN對HCC的早期診斷優(yōu)于AFP，并能有效鑒別早期HCC和肝硬化。診斷HBV相關(guān)HCC的 AUC值為0.908，靈敏度為89.89%，特異度為82.06%，這與早期的一項(xiàng)血漿OPN應(yīng)用于HCC早期診斷的薈萃分析[22]結(jié)論相似(合并敏感度和特異度分別為88%和87%)。以上研究表明，血漿OPN對HCC的早期診斷具有一定的價(jià)值，但目前針對AFP陰性HCC的研究不多，并且OPN檢測尚未建立國際公認(rèn)的參考方法，以及血漿OPN值受非肝臟系統(tǒng)腫瘤的影響較大，可能限制了其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。

四、循環(huán)游離DNA(circulating Cell-Free DNA,cfDNA)

cfDNA是由細(xì)胞凋亡或者壞死后釋放帶外周血的細(xì)胞外DNA分子。cfDNA在肝細(xì)胞癌等各種惡性腫瘤中升高，并具有癌癥特異性DNA改變，是一種特征性的腫瘤生物標(biāo)志物。許多具有高敏感性和特異性的方法有助于將cfDNA作為一種“液體活檢”用于肝細(xì)胞癌的診斷、預(yù)后和療效監(jiān)測。

Xiong Y等[23]發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA對診斷HCC有價(jià)值(AUC為0.92，靈敏度為65%，特異度為100%)，ctDNA與AFP聯(lián)合時(shí)，診斷AFP陰性HCC的AUC為0.96，靈敏度為73%，特異度為100%。此外，Wang T等的一項(xiàng)研究[24]使用實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)檢測 HCC患者血漿中的cfDNA相關(guān)熒光和血清自身熒光，該研究發(fā)現(xiàn)cfDNA相關(guān)熒光強(qiáng)度和血清自身熒光強(qiáng)度在診斷早期(BCLCA期)、小(腫瘤大小≤3 cm)和AFP陰性HCC中具有較好的診斷效能。在鑒別肝硬化、慢乙肝、健康對照組時(shí)，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的AUC值分別為0.777～0.963和0.764～0.972。在鑒別AFP陰性與非HCC時(shí)AUC 為0.836，敏感性為73.6%，特異性為79.7%。而且聯(lián)合AFP、肝功能檢查、血細(xì)胞分析等指標(biāo)時(shí)可提高其診斷價(jià)值[25]。然而， 血漿中總cfDNA含量低，檢測技術(shù)難度和成本較高，影響因素尚不明確，缺乏國際公認(rèn)的參考方法，可能限制了其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用，但隨著研究的深入，作為“液體活檢”的cfDNA檢測技術(shù)必定有廣闊的應(yīng)用前景。

五、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)

CRP是一種敏感的炎癥和組織損傷標(biāo)志物。在一些實(shí)體腫瘤中可檢測到CRP表達(dá)升高，血清CRP升高與惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。一項(xiàng)研究[26]納入了HBV相關(guān)的AFP陰性HCC患者74例，結(jié)果顯示65.9%的AFP陰性HCC患者血清CRP陽性，AFP陰性HCC患者CRP表達(dá)的AUC為0.724，敏感性和特異性分別為72.97%和60%，該研究表明CRP可作為AFP陰性的HCC診斷的輔助生物標(biāo)志物。Maetal等[27]人使用了一種高靈敏度CRP分析，發(fā)現(xiàn)血清hs-CRP診斷HCC時(shí)的AUC為0.903，而且對于AFP陽性和AFP陰性HCC患者診斷陽性率相近(86.9%vs84.6%)。此外，另一項(xiàng)研究[28]也發(fā)現(xiàn)在AFP陰性和AFP低水平(<100 μg/mL)的HCC患者中，CRP水平有明顯的升高 。以上研究表明血清CRP作為輔助診斷AFP陰性HCC的生物標(biāo)志物具有一定前景。但是易受其他疾病影響，目前相關(guān)研究樣本量較少，研究結(jié)果需要在更大隊(duì)列研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

六、基于新標(biāo)志物的聯(lián)合診斷在AFP陰性HCC中的價(jià)值

(一)基于新標(biāo)志物和免疫學(xué)、生化學(xué)指標(biāo)的聯(lián)合診斷模型 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測是一個(gè)包含許多相關(guān)疾病信息的巨大數(shù)據(jù)庫，為疾病的診斷和預(yù)后提供簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的預(yù)測方法。多項(xiàng)研究表明，系統(tǒng)性炎癥和代謝異常參與HCC的診斷和進(jìn)展，如前白蛋白[29]、D-二聚體[29]、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶[30]等。Wei J等[29]的研究發(fā)現(xiàn)AFP陰性HCC患者D-二聚體水平明顯高于對照組，診斷AFP陰性HCC的AUC值為0.868(P<0.05)；同時(shí)該研究顯示AFP陰性HCC患者前白蛋白明顯低于對照組，診斷AFP陰性HCC的AUC值為0.900(P<0.05)，兩者聯(lián)合診斷的AUC高達(dá)0.941，敏感性和特異性分別為85.7%和89.2%。另一項(xiàng)研究[31]發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原與前白蛋白比(FPR)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶與血小板比值(GPR)單一或聯(lián)合時(shí)，可作為AFP陰性HCC經(jīng)濟(jì)、簡單、有效的生物標(biāo)志物，兩者聯(lián)合在區(qū)分健康對照組AUC高達(dá)0.977。而Li J等[32]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和堿性磷酸酶比值聯(lián)合γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和天冬氨酸比值和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶比對AFP陰性HCC有較好的診斷能力，在區(qū)分健康對照組、AFP陰性CH組、AFP陰性LC組時(shí)AUC值分別為0.857、0.733、0.713，診斷價(jià)值稍低于Huang L等[31]的研究。此外，一項(xiàng)納入171例AFP陰性HCC患者的回顧性研究[33]中，結(jié)合多個(gè)常見的血液學(xué)參數(shù)(平均血小板體積、紅細(xì)胞分布寬度、平均血小板體積、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比、血小板計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞比)建立Logistic模型，該模型診斷AFP陰性HCC的 AUC為0.922，敏感性和特異性分別為83.0%和93.1%。并且該模型在來自不同醫(yī)院的試驗(yàn)中進(jìn)行了驗(yàn)證。以上研究表明常見血液學(xué)參數(shù)聯(lián)合可能有助于AFP陰性HCC的早期診斷，為AFP陰性HCC早期診斷提供新思路。

(二)多個(gè)新標(biāo)志物聯(lián)合診斷模型 既往的研究中，有學(xué)者開發(fā)出一些多個(gè)生物標(biāo)志物聯(lián)合使用或者新標(biāo)志物聯(lián)合傳統(tǒng)指標(biāo)的模型，可以進(jìn)一步提高診斷敏感性，有效克服單個(gè)標(biāo)志物準(zhǔn)確度較低的缺點(diǎn)。GALAD評分系統(tǒng)[34]是基于肝細(xì)胞癌患者的年齡、性別、AFP、AFP-L3、DCP水平構(gòu)建的模型，該模型診斷AFP陰性HCC的特異性為93.3%，敏感性為85.6%。Xu F等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，DCP聯(lián)合AFP較DCP單獨(dú)用于診斷HCC具有更好的診斷性能。Zhang Z等[6]人的研究表明AFP-L3聯(lián)合使用GP-73可提高AFP陰性HCC診斷準(zhǔn)確性和敏感性(敏感性40.0%、特異性100%、準(zhǔn)確性76.9%)。以上研究顯示多種生物標(biāo)志物聯(lián)合可提高診斷的敏感性和特異性。近期一項(xiàng)回顧性研究[35]構(gòu)建了基于AFP和5個(gè)常用的臨床指標(biāo)(年齡、APTT、ALP、鈉離子、氯離子)的診斷模型，該模型診斷AFP陰性HCC AUC為0.854，敏感性、特異性、準(zhǔn)確性分別為68.5%、86.6%、80.9%。此外，Zhu L等[36]的一項(xiàng)回顧研究發(fā)現(xiàn)AFP聯(lián)合血小板和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶比值(APAR)的診斷模型,在鑒別AFP陰性(<20 ng/mL)HCC與非癌對照組和慢乙肝患者時(shí), AUC分別為0.839和0.746，研究結(jié)果證明該模型在低AFP或AFP陰性中是一種有效的HCC篩查模型。以上研究表明，多個(gè)生物標(biāo)志物聯(lián)合或者新標(biāo)志物聯(lián)合傳統(tǒng)指標(biāo)或?qū)嶒?yàn)室常規(guī)指標(biāo)，可以進(jìn)一步提高診斷敏感性。目前多種生物標(biāo)志物聯(lián)合診斷AFP陰性HCC的模型較多，但同樣受制于檢測方法、界限值的影響；除此以外，聯(lián)合診斷模型如何能簡便、易于實(shí)現(xiàn)地協(xié)助早期診斷，還有待于進(jìn)一步的研究進(jìn)行大量的臨床驗(yàn)證和調(diào)整。

七、總結(jié)和展望

早期診斷HCC并進(jìn)行有效的治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵，AFP是目前應(yīng)用最廣泛的HCC診斷指標(biāo)，而AFP陰性HCC則缺乏理想的生物標(biāo)志物。前期已有較多研究提示一些生物標(biāo)志物和常見實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)單獨(dú)或聯(lián)合有望解決這些問題。從以上的研究來看， AFP-L3單獨(dú)用于AFP陰性HCC早期診斷的靈敏度并不高，隨著AFP-L3檢測方法靈敏度的提高，其輔助診斷AFP陰性HCC的靈敏度和特異度可能進(jìn)一步提高。DCP對AFP陰性HCC患者具有良好的診斷性能，尤其是AFP、AFP-L3、DCP聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高診斷的敏感性和特異性。OPN、CRP對AFP陰性HCC具有輔助診斷價(jià)值，但易受其他疾病影響。作為“液體活檢”，cfDNA在AFP陰性HCC中診斷價(jià)值較高，但其檢測技術(shù)難度、成本較高，影響因素尚不明確。以上標(biāo)志物單獨(dú)用于AFP陰性HCC的診斷準(zhǔn)確性較低，多種生物標(biāo)志物聯(lián)合在臨床實(shí)踐中能一定程度彌補(bǔ)AFP的不足，對早期診斷AFP陰性HCC具有較高的準(zhǔn)確度。此外，已有較多研究發(fā)現(xiàn)常用生物標(biāo)志物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指標(biāo)在診斷AFP陰性HCC方面具有較好的診斷效能。但是，目前各研究病例的納入條件和新型標(biāo)志物的檢測方法等并不完全相同，不同研究結(jié)論之間還存在一定差異，在此基礎(chǔ)上得到的診斷界值也不準(zhǔn)確，應(yīng)用于人群中篩查時(shí)可能影響結(jié)果的評定，在實(shí)際應(yīng)用過程中還需綜合判斷。目前多種新型腫瘤標(biāo)志物已被提出，包括高爾基蛋白-73(GP73)，Glypican-3(GPC-3)、α-L-巖藻糖苷酶(AFU)、MicroRNAs等。然而，目前尚沒有研究顯示出在AFP陰性HCC的早期診斷中具有足夠的敏感性和(或)特異性，未來需要進(jìn)一步開展更多的大樣本研究。因此，需要尋找更加理想的AFP陰性HCC篩查方法輔助臨床醫(yī)生進(jìn)行早期診斷。理想的肝癌預(yù)測方法應(yīng)是非侵入性的、準(zhǔn)確的、可獲得的和相對廉價(jià)的。從豐富的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查中挖掘隱藏信息，建立疾病預(yù)測模型，為臨床實(shí)踐提供更經(jīng)濟(jì)和無創(chuàng)的診斷方法。在未來，對于血清低AFP或AFP正常的患者，我們需開發(fā)一些簡單的模型，包括常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室變量，來輔助預(yù)測肝細(xì)胞癌，幫助臨床醫(yī)生初步確定HCC發(fā)展的特定風(fēng)險(xiǎn)患者，可作為血清AFP及超聲檢查的有力補(bǔ)充。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。