高瀅張青鴨頭輝山岨達也巖崎真一張滟馬偉軍陳耔辰張玉忠許珉任曉勇*

1西安交通大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

2日本東京大學耳鼻咽喉頭頸外科

3上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海交通大學醫(yī)學院耳科學研究所，上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室

4日本名古屋市立大學耳鼻咽喉頭頸外科

前庭神經(jīng)系統(tǒng)障礙可導致動物和人類空間定位和平衡功能紊亂。近年來，隨著各種前庭功能障礙動物模型的建立，人們對實驗動物前庭功能的評價也越來越關(guān)注[1]。因為缺乏像聽覺誘發(fā)電位（Auditory Evoked Potentials,AEP）那樣穩(wěn)定可靠的指標，我們對實驗動物前庭損傷的評價手段還遠不如對耳蝸損傷評價那么敏感、客觀、自信?，F(xiàn)有的動物前庭功能評價方法包括：1.一般行為觀察：包括游泳實驗等[2]；2.空間姿勢反射：用于評價動物前庭末梢的感受性和前庭脊髓神經(jīng)的反射情況；3.前庭眼反射（Vestibular Ocular Reflex,VOR）檢測[3,4]：一般用于半規(guī)管功能檢測，需要特殊設(shè)備且記錄難度較大；4.前庭誘發(fā)肌源性電位（Vestibular Evoked Myogenic Potential,VEMP）檢測[5]：因為受到肌力和肌張力的影響，動物實驗仍很困難。

前庭誘發(fā)電位（Vestibular evoked potential,VsEP）是近年來國際上出現(xiàn)的一種用于動物內(nèi)耳前庭成分檢測的實驗方法?，F(xiàn)有的研究表明它是來自前庭系統(tǒng)的遠場電位，而不是肌電位；刺激源通常是振動刺激，而不是聲刺激；這種振動刺激通常需要精確良好的控制與檢驗，施加于動物顱骨后通過頭皮電極記錄得到VsEP反應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取6只體重20-30g健康成年JCR雄性小鼠，8周齡，所有小鼠健康，鼓膜完整，無聽力障礙。研究通過了校倫理委員會項目審批（編號：No 2019-1072）。實驗組給予慶大霉素220mg/kg/day皮下注射，對照組給予等量生理鹽水皮下注射，連續(xù)注射14天。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物固定及VsEP檢測裝置連接

將兩組小鼠給藥后進行VsEP實驗，塞拉嗪(10mg/kg)+氯胺酮(40mg/kg)麻醉后將俯臥位小鼠頭部固定于頭部固定器（型號SG-4N，日本）內(nèi)，前門牙勾于上頜固定環(huán)，雙側(cè)耳前使用螺絲旋轉(zhuǎn)固定（圖1A）。固定器與振動發(fā)生裝置(圖1B)相連（型號S-0105，旭製作所，日本）相連，產(chǎn)生兩種振動形式的振動波：帶斜坡的對稱拋物線波（symmetric par‐abolic waves with ramps,SPR，或稱triangular wave，三角波），及具有線性加速度和斜坡的對稱拋物線波（symmetric parabolic waves with linear acceleration and ramps,SPLR，或稱square wave，矩形波）。加速度傳感器（型號352C65，PCB Piezotronics，美國）及壓力傳感器（型號P51，PCB Piezotronics，美國，圖1C）用于檢測和標定振動加速度，使VsEP刺激能量peak-jerk為0dB re.1g/ms.典型有效的刺激波形為1ms開始至2ms（peak-jerk波，圖1D）[6]。振動脈沖由14.5dB re.1g/ms輸出開始，依次遞減10dB，不能引出穩(wěn)定波形時再回升5dB脈沖刺激直至波形穩(wěn)定，重復性良好。每振動強度刺激下波形至少重復測試至少2次以確保結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖1 振動刺激前庭誘發(fā)檢測系統(tǒng)各部件示意圖A小鼠頭部固定裝置（型號SG-4N，日本）；B振動發(fā)生裝置；C加速度傳感器及壓力傳感器；D振動發(fā)生裝置產(chǎn)生的兩種振動形式波（SPR，SPLR）。Acceleration（加速度）在2ms內(nèi)提升至4.2g，Jerk（脈沖）反應刺激沖擊幅度（加速度的一階倒數(shù) dg/dt）。Fig.1 Vibration exciter generate vestibular evoked potential system;A:mouse head fixing frame（Type SG-4N，Japan）;B:Vibration exciter generator;C:Acceleration and pressure sen‐sors;D:The raw acceleration waveforms and the jerk wave‐forms of the vibration exciter with SPR or SPLR waveform with differential calculation of the digital oscilloscope.Accel‐eration elevate to 4.2g in 2ms，Jerk reflect the magnitude of stimulus(The reciprocal of the acceleration dg/dt）.

1.2.2 前庭誘發(fā)電位VsEP波形判定標準和參數(shù)記錄

采用美國智聽（Smart EP IHS）聽覺誘發(fā)電位儀進行VsEP波形記錄。銀針記錄電極置于顱頂，接地及參考電極分別置于雙耳后區(qū)域。典型的VsEP為短潛伏期（在2ms內(nèi)）出現(xiàn)的N1-P1波，重復性良好，否則認為波形消失或未引出。分別記錄SPR及SPLR兩種振動刺激形式下的波形，刺激強度從14.5dB re.1g/ms脈沖刺激開始，依次遞減10dB，波形無法引出時回升5dB，每個強度刺激下至少重復兩次直至波形消失，記錄上一刺激強度為閾值。記錄參數(shù)包括刺激閾值，14.5dB re.1g/ms脈沖刺激下N1潛伏期及N1/P2振幅。

1.2.3 聽性腦干反應ABR測試

分別給予頻率為 4kHz，8kHz，16kHz，32kHz Tone burst刺激，刺激強度從100dB SPL開始，刺激頻率21.1次/s，平均250次，直至ABR波形消失，上一刺激強度記錄為閾值。

2 結(jié)果

2.1 VsEP測試結(jié)果及參數(shù)

所有小鼠VsEP波形均可正常引出，在SPR及SPLR振動刺激下閾值，14.5dB re.1g/ms脈沖刺激下N1潛伏期、N1/P1振幅結(jié)果比較見表1。正常組及慶大霉素處理組在SPLR振動刺激下閾值及N1/P1振幅比較具有統(tǒng)計學差異。

2.2 ABR測試結(jié)果及參數(shù)

對照組及慶大霉素處理組小鼠ABR波形皆可正常引出。將V波消失時的短純音刺激定義為閾值。對照組在4kHz短純音刺激下閾值為67.3±2.9dB SPL;在8kHz短純音刺激下閾值為29.3±8.1dB SPL;在16kHz短純音刺激下閾值為29.7±4.5dB SPL;在32kHz短純音刺激下閾值為51.0±8.7dB SPL。慶大霉素處理組在4kHz短純音刺激下閾值為77.3±5.8dB SPL(與對照組比較t=0.443，P=0.670);在8kHz短純音刺激下閾值為52.3±11.5dB SPL(與對照組比較 t=1.868，P=0.100);在16kHz短純音刺激下閾值為61.7±12.6dB SPL(與對照組比較t=2.304，P=0.050)，在 32kHz短純音刺激下閾值為78.7±4.6dB SPL(與對照組比較t=0.971，P=0.360)。ABRI波潛伏期及振幅見表1。

2.3 VsEP典型N1-P1波形及與ABR I波的鑒別

圖2 A所示為各頻率振動脈沖下正常小鼠及慶大霉素注射小鼠VsEP引出波。圖2B所示為4kHz聲刺激下正常小鼠及慶大霉素注射小鼠ABR各個引出頻率波形示例，VsEP典型N1-P1波為2ms內(nèi)出現(xiàn)先負-正波形，而ABR的I波出現(xiàn)在2ms左右，N1波與I波潛伏期的比較見圖2C，藍色線條為4kHz在99dB SPL的ABR波形，紅色線條為SPR在4.5dB re.1g/ms的VsEP波形，明顯可見VsEP波N1潛伏期與ABR波I潛伏期差異。ABR的I波來源于聽神經(jīng)纖維，ABR的I波區(qū)別于VsEP的P1波，其潛伏期更長，通常在2ms左右，而VsEP的N1波潛伏期通常在1ms左右（見表1）。

表1 各組前庭誘發(fā)電位（VsEP）及聽性腦干反應（ABR）參數(shù)比較（±s）Table 1 Comparison of parameters in VsEP and ABR between the two groups（±s）

表1 各組前庭誘發(fā)電位（VsEP）及聽性腦干反應（ABR）參數(shù)比較（±s）Table 1 Comparison of parameters in VsEP and ABR between the two groups（±s）

*Comparing with control group P<0.05,**Comparing with control group P<0.01

VsEP Threshold（dB）images/BZ_118_985_2197_1028_2240.pnglatency of N1 wave in VsEP（ms）images/BZ_118_1281_2197_1325_2240.pngAmplitude of N1-P1 wave in VsEP（μV）latency of I wave in ABR（ms）images/BZ_118_1599_2197_1642_2240.png32kHz 2.6 2.3 2.2 2.4±0.2 2.5 2.4 2.4 2.4±0.1 0.535 0.621 Control group Gentamicin group 1#2#3#images/BZ_24_1766_2589_1789_2624.png±s 4#5#6#images/BZ_24_1766_2589_1789_2624.png±s t P SPR-10.5-15.5-10.5-12.2±2.9-0.5-10.5 5.5-1.8±8.1 2.085 0.105 SPLR-15.5-15.5-10.5-13.8±2.9-0.5 5.5 5.5 3.5±3.4**6.658 0.003 SPR 1.2 1.2 1.0 1.1±0.1 1.1 1.2 1.0 1.1±0.1 0.378 0.724 SPLR 1.2 1.0 0.7 1.0±0.3 0.9 1.1 1.2 1.1±0.1 0.588 0.588 SPR 28.4 7.3 14.6 16.8±10.7 11.4 13.6 0.95 8.7±6.8 1.110 0.329 SPLR 18.2 10.1 17.9 15.4±4.6 3.5 1.3 4.6 3.1±1.7*4.345 0.012 4kHz 1.9 2.0 2.2 2.0±0.2 2.2 2.3 2.1 2.2±0.1 1.581 0.190 8kHz 1.8 1.9 2.1 1.9±0.2 2.2 2.2 2.1 2.2±0.1 2.475 0.067 16kHz 2.3 2.1 2.3 2.2±0.1 2.0 2.1 2.2 2.1±0.1 1.512 0.205

圖2 振動刺激誘發(fā)的小鼠VsEP與聲刺激誘發(fā)ABR波形比較。A SPR振動刺激條件下慶大霉素處理組與正常對照組小鼠VsEP典型波形；B 4kHz聲刺激條件下慶大霉素處理組及正常對照組小鼠ABR典型波形；C ABR波形與VsEP波形比較（藍色標識為小鼠ABR波形，紅色標識為VsEP波形）。Fig.2 Comparison between vibration exciter generate VsEP wave and click generate ABR wave.A:Typical VsEP waves in gentamicin group and control group of SPR stimulation waveform;B:Typical ABR waves in gentamicin group and control group of 4kHz click stimulation waveform;C:Com‐parison of ABR wave and VsEP wave(blue line represents ABR wave,red line represents VsEP wave).

3 討論

線性機械振動刺激誘發(fā)的前庭誘發(fā)電位（VsEP）源于前庭，不同于耳蝸反應的迷路電信號，是可能來源于耳石器與前庭神經(jīng)的復合動作電位。其與VEMP不同的是：1.潛伏期不同：VsEP為短潛伏期電位,潛伏期<2ms；VEMP潛伏期為10-20ms。2.電活動來源不同。VsEP記錄位置在顱頂，電活動來源于前庭神經(jīng)或腦干；而VEMP記錄位置位于眼肌或胸鎖乳突肌表面，電活動來源于肌細胞[7,8]。1991年Arulkumaran首次將VsEP應用于人。將頭部固定于一個針對每個對象單獨制造的固定器中，用以支持上顎牙齒與固定器貼合固定良好且穩(wěn)定。電極刺激產(chǎn)生2/s每次的角加速度，強度為10000°/S2（速度上升時間為1-2ms）。記錄前額與乳突間的電位差。1996年Rodionov[9]給予正常人頭部在垂直平面上10000°/S2(1.8°位移)的角加速度刺激，分別于前額和乳突表面記錄到平均12.7ms及63.5ms的中潛伏期電位。此后對于人振動刺激誘發(fā)VsEP鮮有報道。

VsEP來源于耳石器、半規(guī)管還是前庭神經(jīng)，最初尚不確定。Jones于1989年在鳥類的研究中最先報告和定義這些VsEP波的來源[10，11]，隨后于1999年利用遠場記錄的方法描述了四種哺乳動物（大鼠，小鼠，豚鼠和沙鼠）的迷路重力感受器功能。VsEP是通過施加在顱骨上的線性加速度振動引起的前庭神經(jīng)和中樞的復合動作電位，這四種哺乳動物的VsEP都發(fā)生在1.5ms以內(nèi)。1999年Jones對Het基因突變小鼠采用VsEP檢測其前庭功能[12]。Het基因突變小鼠又稱傾斜小鼠[13]，先天缺失耳石器，而半規(guī)管及耳蝸都存在。Jones發(fā)現(xiàn)這種小鼠對click聲刺激可產(chǎn)生聽覺反應出現(xiàn)ABR波形，但VsEP波形消失，提示VsEP可能來源于耳石器。2013年Yas‐uhiro[14]手術(shù)選擇性分別切除豚鼠耳蝸、半規(guī)管，橢圓囊或球囊后發(fā)現(xiàn)耳蝸、半規(guī)管及球囊切除均不影響VsEP波形引出，而橢圓囊切除后VsEP波消失。他們的研究進一步提示VsEP可能來源于橢圓囊。

眾所周知，機械振動本身也是潛在的聲刺激來源，線性機械振動刺激誘發(fā)的VsEP是否會同時誘發(fā)耳蝸聽神經(jīng)產(chǎn)生ABR波對結(jié)果判讀產(chǎn)生干擾？為此Jones等設(shè)計了聽覺掩蔽裝置，這種掩蔽裝置可以產(chǎn)生強大的寬帶前向掩蔽刺激（116dB SPL，50-50000Hz），在檢測時持續(xù)給予這種掩蔽刺激可以避免耳蝸聽成分參與VsEP的形成[15]。而實際應用的掩蔽水平則高于消除聽覺反應所需的最低水平。Jone發(fā)現(xiàn)在不添加掩蔽的het小鼠仍無VsEP波，且很少出現(xiàn)聽覺“偽像”。Bohmer[16]同樣于無聽覺掩蔽的小鼠記錄到穩(wěn)定VsEP波形。在本研究中，我們使用了未添加掩蔽的振動刺激，同樣也觀察到穩(wěn)定的VsEP波形，并無ABR的波形干擾。因此可以認為線性機械振動刺激誘發(fā)的VsEP可以選擇性地反映前庭耳石器的功能，聽覺掩蔽可能并不是必須要考慮的科學問題。VsEP來源于前庭基于：1.在給予強烈的寬帶前向掩蔽（116dB SPL，50-50000Hz）的VsEP檢測過程中，動作電位持續(xù)存在；2.VsEP在雙側(cè)耳蝸切除后保留，而雙側(cè)迷路切除后消失[12]。

綜上所述，振動刺激誘發(fā)的VsEP前庭功能檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢在于它是來源于前庭的遠場電位而不是肌電位，可以很好地彌補肌電位的不足并與之相互印證。VsEP的檢測方法較其它前庭功能檢測方法更加簡便易行，麻醉后的動物僅需固定頭部進行無損傷的前庭功能評價。與目前常用的低頻旋轉(zhuǎn)實驗記錄眼震波形等檢測方法相比，所用儀器價格低廉，操作簡便，波形穩(wěn)定，重復性良好，可廣泛開展用于動物實驗研究。