李金星，蔣豐嶺，周青青，羅雅亭，王家妮，程如越，沈曦，何方

（四川大學(xué)四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041）

人體腸道是一個復(fù)雜而龐大的系統(tǒng)，其中棲息著約100億個微生物，這些微生物的總質(zhì)量約占人體體重的2.5%。腸道細(xì)菌具備多種功能，包括調(diào)節(jié)代謝、屏障效應(yīng)和營養(yǎng)功能，因此腸道菌群失調(diào)可能對人體健康造成負(fù)面影響[1]。腸道菌群、營養(yǎng)物質(zhì)、宿主細(xì)胞相互作用保持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這是機(jī)體生長發(fā)育至關(guān)重要的過程。

抗生素對各種病原菌感染癥具有廣泛的治療作用，近年來兒童抗生素的使用率越來越高，其對腸道菌群的發(fā)育和相關(guān)代謝過程的影響在公共衛(wèi)生領(lǐng)域里引起廣泛的關(guān)注，有待深入研究。頭孢曲松屬于第三代頭孢菌素，是世界衛(wèi)生組織基本藥物標(biāo)準(zhǔn)清單中推薦的衛(wèi)生系統(tǒng)需要的最安全有效的藥物之一[2]。已有研究表明，生命早期頭孢曲松暴露會顯著損傷腸道上皮組織并影響腸道菌群的構(gòu)建，對兒童的生長發(fā)育可能有一定的潛在危害[3-5]。前期研究表明，頭孢曲松能夠損傷生命早期小鼠腸道菌群的正常結(jié)構(gòu)，影響腸上皮發(fā)育，而益生菌有助于改善其造成的不良影響[6]。

目前針對益生菌改善抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)的效果，已有研究者提出益生菌可抑制抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的腸道細(xì)菌釋放過多脂多糖[7]、改善伴隨抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)出現(xiàn)的腸道短鏈脂肪酸和膽汁酸異常[8-9]，以及緩解抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)引起的對宿主免疫功能損害[10]等多種可能性。但益生菌對抗生素造成的腸道菌群失調(diào)的改善作用相關(guān)研究依然偏少，并且存在結(jié)論不一致及作用機(jī)理不明的現(xiàn)象，因此還有待進(jìn)一步研究。

本研究選擇頭孢曲松對4周齡幼年期雄性Balb/c小鼠進(jìn)行短期干預(yù)，觀察小鼠體重、脾臟細(xì)胞因子、腸道組織結(jié)構(gòu)、腸道菌群及其代謝產(chǎn)物等指標(biāo)的變化，探究合生元制劑對抗生素引起的腸道菌群失調(diào)的改善效果，同時為臨床治療用抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45只SPF級4周齡雄性Balb/c小鼠：成都達(dá)碩實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2014-028]。小鼠飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院實驗動物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，動物房室溫（24±2）℃，濕度50%～70%，12 h晝夜節(jié)律，飼養(yǎng)期間自由飲食、飲水。

1.2 試劑與材料

頭孢曲松：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；糞便細(xì)菌DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；動物組織RNA提取試劑盒：成都福際生物技術(shù)有限公司；合生元制劑：益加生物科技成都有限公司；Mouse Premixed Multi-Analyte Kit：安諾論（北京）生物科技有限公司；Qubit dsDNA HS分析試劑盒：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

45只4周齡雄性Balb/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為對照組、抗生素組、實驗組（n=15/組），第1周實驗組每天灌胃200 mg/mL頭孢曲松0.2 mL和5×109CFU/mL合生元制劑0.2 mL，以生理鹽水作為溶劑，合生元制劑在灌胃抗生素2 h后再灌胃；抗生素組每天灌胃200 mg/mL頭孢曲松0.2 mL；對照組灌胃等量生理鹽水，小鼠自由攝食攝水3周。

1.3.2 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

實驗28 d后處死小鼠后，取小鼠回腸、結(jié)腸各1 cm，組織固定液固定，HE染色后觀察回結(jié)腸結(jié)構(gòu)，在100倍視野下拍照，以100倍比例尺為標(biāo)準(zhǔn)，利用Image-Pro Plus 6.0分別測量每張切片5根完整絨毛的高度（mm）和深度（mm）。

1.3.3 糞便DNA提取

實驗結(jié)束時收集小鼠糞便。嚴(yán)格按照糞便總DNA提取試劑盒推薦的實驗步驟提取小鼠糞便DNA。

1.3.4 脾臟細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量測定

采用RNA提取試劑盒提取小鼠脾臟RNA，實驗步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。純化后的RNA在特異性引物的參與下進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），反應(yīng)條件：98℃預(yù)熱 30 s，98℃變性 5 s，引物結(jié)合和延伸 5 s[白介素-6（interleukin-6，IL-6）：55 ℃，IL-10：57.7℃，IL-12：59.5℃，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）：59.5 ℃]，從第二步開始循環(huán)39次。以β-actin作為內(nèi)參基因計算脾臟細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量。

1.3.5 血清細(xì)胞因子測定

實驗結(jié)束后，眼球采血，血液樣品室溫（25±5）℃靜置2 h后，2 000×g離心20 min，吸取上清液，相同轉(zhuǎn)速二次離心5 min，采用Mouse Premixed Multi-Analyte Kit測定小鼠血清 IL-6、IL-10、IL-12、TNF-a，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 糞便短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）測定

實驗結(jié)束后，采集小鼠糞便，稱取100 mg樣品，前處理后取上清液上機(jī)測定。色譜條件：色譜柱Agilent HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm內(nèi)徑×0.25 μm）；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量 1 μL，分流比 10 ∶1；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。以乙酸、丙酸、丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量計算糞便中SCFAs的含量。

1.3.7 二代測序

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增糞便細(xì)菌DNA后純化，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的濃度及純度。用Qubit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定量，檢測文庫的大小后上機(jī)測序，具體實驗步驟參考文獻(xiàn)[11]并稍作修改。

1.4 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量變量采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式描述集中程度和離散趨勢，組間比較用方差分析或Wilcoxon秩和檢驗。以P＜0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重和脾臟系數(shù)測定結(jié)果

頭孢曲松處理對小鼠體重和脾臟系數(shù)的影響見表1。

表1 小鼠體重和脾臟系數(shù)Table 1 Weight and spleen index of tested mice

由表1可知，抗生素組和對照組相比，體重和脾臟系數(shù)無明顯差異。已有研究發(fā)現(xiàn)高劑量的抗生素灌胃會損傷小鼠腸道上皮組織，導(dǎo)致小鼠體重下降，影響宿主的生長發(fā)育[11]。另外，使用一次性治療劑量的抗生素會增加小鼠體重累積的速度，小鼠體重卻沒有明顯增長[12]。然而，長期低劑量抗生素使用會增加腸黏膜的通透性從而導(dǎo)致小鼠的總體重、腹腔和內(nèi)臟脂肪增加[13]。故頭孢曲松對小鼠體重等的影響是可逆的，益生菌制劑能夠加快這種恢復(fù)過程。

2.2 腸道組織損傷情況

頭孢曲松處理對小鼠腸道組織的影響見圖1。

圖1 小鼠腸道組織損傷情況Fig.1 Intestinal development of tested mice

由圖1可知，停止治療劑量的抗生素干預(yù)后3周，小鼠回腸絨毛高度和結(jié)腸隱窩深度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與體重和臟器系數(shù)的結(jié)果類似。因此，推測治療劑量的抗生素導(dǎo)致的小鼠腸道組織的損傷在停止干預(yù)后可能可以自然恢復(fù)。

2.3 脾臟細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量

頭孢曲松處理對小鼠脾臟細(xì)胞因子的影響見表2。

表2 小鼠脾臟細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量Table2 The mRNA expression of cytokines in spleen of tested mice pg/mL

由表2可知，抗生素組和對照組相比，各細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量無顯著差異。而實驗組的IL-6和IL-12的mRNA相對表達(dá)量顯著低于抗生素組，IL-10表達(dá)量顯著低于對照組和抗生素組。已有研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可介導(dǎo)調(diào)節(jié)宿主免疫功能，發(fā)揮抗肥胖、抗糖尿病、抗炎、抗過敏等作用，例如益生菌可特異性地影響或者調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及組織釋放各種炎癥性細(xì)胞因子[14]。表明抗生素對免疫系統(tǒng)無直接影響，而合生元制劑可能有助于降低炎癥因子的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。

2.4 血清細(xì)胞因子測定

頭孢曲松處理對小鼠血清細(xì)胞因子的影響見表3。

表3 小鼠血清細(xì)胞因子含量Table 3 Serum cytokines of tested mice pg/mL

由表3可知，抗生素組和對照組相比，血清細(xì)胞因子含量無明顯差異，但實驗組的TNF-α含量明顯低于對照組。盡管抗生素組和實驗組的TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但實驗組的細(xì)胞因子含量仍低于抗生素組。

抗生素組與對照組各血清細(xì)胞因子水平無明顯差異，表明短期使用抗生素且停用一段時間后未對小鼠的免疫功能造成顯著影響。在使用抗生素的同時補(bǔ)充合生元制劑，可顯著降低血清炎癥性細(xì)胞因子TNF-α的含量，表明該合生元制劑可通過抑制炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生表現(xiàn)出一定的抗炎癥性免疫調(diào)節(jié)作用。

2.5 糞便SCFAs測定

頭孢曲松處理對小鼠糞便SCFAs的影響見表4。

由表4可知，抗生素組的乙酸、丙酸和丁酸含量顯著高于對照組；而實驗組的乙酸、丙酸、丁酸顯著低于抗生素組，而與對照組無顯著差異。

SCFAs是某些腸道菌群發(fā)酵膳食纖維的產(chǎn)物，能夠激活在腸內(nèi)分泌L細(xì)胞上表達(dá)的特定G蛋白耦聯(lián)受體從而參與調(diào)節(jié)能量代謝和腸道屏障功能的腸道肽的分泌，還可以通過抑制組蛋白去乙?；富钚詠碚{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[15]。SCFAs還是腸道上皮細(xì)胞的重要能量來源，CHO等[13]發(fā)現(xiàn)給剛斷乳的C57BL/6J小鼠灌胃亞治療劑量的青霉素、萬古霉素、氯四環(huán)素會升高抗生素組小鼠的腸道SCFAs含量，這可能與抗生素攝入升高SCFAs來誘導(dǎo)肥胖表型有關(guān)。而PERRIN等[16]給無菌雌性小鼠灌胃亞治療劑量和治療劑量的環(huán)丙沙星，未觀察到組間糞便SCFAs有顯著差異，表明抗生素對SCFAs影響可能與抗生素類型、小鼠品系、性別等有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，使用高劑量的頭孢曲松會大量增加SCFAs的產(chǎn)生，與CHO等[13]觀察到的趨勢一致，表明SCFAs水平并不是越高越好，過高的SCFAs可能對機(jī)體健康有不良影響。而同時使用頭孢曲松和益生菌制劑的實驗組，其SCFAs的產(chǎn)生量恢復(fù)至對照組水平，表明本研究使用的益生菌制劑具有緩解頭孢曲松等抗生素引起的腸道SCFAs代謝異常的可能性。

2.6 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 腸道菌群多樣性

頭孢曲松處理對小鼠腸道菌群alpha多樣性的影響見表5。

表5 小鼠腸道菌群alpha多樣性指數(shù)測定結(jié)果Table 5 Alpha diversity of intestinal microbiota of tested mice

由表5可知，抗生素組和實驗組的alpha多樣性指數(shù) ACE、chao1、shannon 和 PD_whole_tree均顯著低于對照組，而實驗組的simpson指數(shù)也低于對照組。實驗組的ACE、chao1和PD_whole_tree指數(shù)高于抗生素組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

頭孢曲松處理對小鼠腸道菌群beta多樣性的影響見圖2。

圖2 基于bray_curtis距離的PCoA分析Fig.2 PCoA analysis based on bray-curtis distance

由圖2可知，基于bray_curtis距離的PCoA分析可看出各組內(nèi)聚集性高，組間差異大，PC1具有61.78%的解釋度，表明3組之間腸道菌群beta多樣性也具有顯著差異，且使用抗生素是主要影響因素。

腸道菌群多樣性分析和PCoA分析表明，短期使用抗生素會對腸道菌群多樣性和群落結(jié)構(gòu)造成影響，且這種影響會持續(xù)一段時間，應(yīng)用合生元制劑對抗生素造成的腸道菌群失調(diào)的改善作用并不明顯。

2.6.2 腸道菌群群落結(jié)構(gòu)

頭孢曲松處理對小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)門水平的影響見表6和圖3。

表6 小鼠糞便腸道菌群門水平優(yōu)勢菌相對豐度Table 6 Relative richness of primary fecal microbiota in phylum of tested mice

圖3 小鼠糞便腸道菌群門水平群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of fecal microbiota in phylum of tested mice

由表6和圖3可知，在門水平，對照組和抗生素組的厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和F/B無顯著差異；而實驗組的厚壁菌門、變形菌門和F/B顯著高于對照組和抗生素組，擬桿菌門顯著低于對照組和抗生素組。

頭孢曲松處理對小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)屬水平的影響見表7和圖4。

表7 小鼠糞便腸道菌群屬水平優(yōu)勢菌相對豐度Table 7 Relative richness of primary fecal microbiota in genus of teated mice%

圖4 小鼠糞便腸道菌群水平群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of fecal microbiota in genus of tested mice

由表7和圖4可知，在屬水平，抗生素組的擬普雷沃菌屬的相對豐度明顯低于對照組，而實驗組的擬桿菌屬、乳桿菌屬和擬普雷沃菌屬的相對豐度明顯低于對照組，不確定的毛螺菌屬的相對豐度明顯低于抗生素組。

腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的結(jié)果也進(jìn)一步提示，在使用抗生素的同時聯(lián)用合生元制劑對抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)的改善效果并不明顯。在前期對幼年期小鼠進(jìn)行為期1周的頭孢曲松和鼠李糖乳桿菌干預(yù)研究中，發(fā)現(xiàn)干預(yù)結(jié)束后第4周實驗組乳桿菌屬的相對豐度低于空白組和對照組，表明在抗生素紊亂腸道菌群的同時投用益生菌制品可能會干擾益生菌的正常定殖[17]。但是，另外一項研究發(fā)現(xiàn)短期使用頭孢曲松的同時補(bǔ)充植物乳桿菌PC170似乎不能達(dá)到益生菌對腸道菌群紊亂的預(yù)期改善效果，而使用抗生素的同時且在停止抗生素干預(yù)之后再持續(xù)補(bǔ)充益生菌能夠更有效地增加腸道菌群的自然恢復(fù)速度[18]。除此之外，本研究選用的是合生元制劑，并不是單一的益生菌制劑。研究表明益生元增加雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量、降低有害病原菌等有益腸道健康作用是某些類別特有的[19]，且聯(lián)合使用益生菌益生元時，有益作用可能會被掩蓋[20]，這可能是導(dǎo)致其效果并不理想的潛在因素。這些研究表明益生菌的制劑選擇和干預(yù)方式是影響其對抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)的改善效果的重要因素之一。

3 結(jié)論

腸道屏障由腸道菌群及其產(chǎn)物、黏液層、宿主分泌的抗菌物質(zhì)、上皮組織和皮下免疫組織組成，具有選擇透過性，既能有效防止有害微生物和物質(zhì)進(jìn)入人體，又能吸收營養(yǎng)物質(zhì)以供宿主生長發(fā)育?？股乜赡芡ㄟ^擾亂腸道菌群的正常結(jié)構(gòu)、破壞腸道上皮細(xì)胞、影響宿主免疫系統(tǒng)等方面對宿主的生長發(fā)育和遠(yuǎn)期健康產(chǎn)生危害。

在本研究中，頭孢曲松能夠顯著破壞腸道菌群組成和SCFAs代謝，而對小鼠體重、脾臟臟器系數(shù)及腸道上皮組織無顯著不良影響。合生元制劑能夠調(diào)節(jié)抗生素誘導(dǎo)的菌群失調(diào)小鼠的免疫功能，這種調(diào)節(jié)可能通過影響SCFAs的合成來實現(xiàn)，而不是通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。