劉 璉，陸呂佳，胡淵淵,2，戴文圣,2,3，索金偉,2,3，宋麗麗,2,3，吳家勝,2,3，喻衛(wèi)武,2,3，樓 君,4

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 國(guó)家林業(yè)草原香榧工程技術(shù)研究中心，浙江 杭州 311300；3. 浙江農(nóng)林大學(xué) 香榧產(chǎn)業(yè)國(guó)家創(chuàng)新聯(lián)盟，浙江 杭州 311300；4. 浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 林業(yè)站，浙江 杭州 311400）

隨季節(jié)變化，植物生長(zhǎng)環(huán)境中的光照強(qiáng)度、氣溫等均會(huì)發(fā)生改變。一般認(rèn)為，植物光合作用的季節(jié)性變化是其對(duì)氣溫的適應(yīng)性響應(yīng)[1]。光能和二氧化碳(CO2)分別是光合作用的動(dòng)力和基本原料，研究光合作用對(duì)光強(qiáng)和CO2的響應(yīng)特征有助于闡明植物在環(huán)境變化中的生理生態(tài)適應(yīng)性[2?3]。因此，研究植物光合作用的季節(jié)性變化對(duì)預(yù)測(cè)樹(shù)種響應(yīng)氣候變化引起的氣溫改變具有重要的意義[4]。研究不同季節(jié)植物葉片的氣體交換參數(shù)(Jmax和Vcmax)、葉綠素含量、葉氮含量及氮分配的變化是揭示植物葉片光合作用季節(jié)性變化的生理機(jī)制的一種方法[1,5?12]。香榧Torreya grandis ‘Merrillii’種籽經(jīng)炒制后食用，風(fēng)味香醇，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是中國(guó)珍稀的上等干果。隨著市場(chǎng)需求的增大，從2008年開(kāi)始，浙江香榧的種植面積迅速增大。截至2019年，浙江省香榧種植面積達(dá)4.8萬(wàn)hm2，已成為中國(guó)南方山區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[13]。在生產(chǎn)上，通常采用2年生實(shí)生榧樹(shù)Torreya grandis作為砧木嫁接香榧，4～5 a開(kāi)始掛果，15 a后達(dá)盛果期。葉片或樹(shù)體的生理年齡被認(rèn)為是評(píng)估其對(duì)逆境響應(yīng)能力時(shí)需協(xié)同考慮的重要因子，因?yàn)椴煌砟挲g的葉片或樹(shù)體生長(zhǎng)對(duì)碳源的需求、酶活性、激素活性、水、冠層微環(huán)境和葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)等均會(huì)發(fā)生變化[14]。隨樹(shù)齡的增加，樹(shù)體會(huì)由于光合作用/呼吸作用比率降低發(fā)生碳饑餓，樹(shù)體老化[15]。橡樹(shù)Quercus cerris葉片的光合速率隨樹(shù)齡的增加呈降低趨勢(shì)[16]。近年來(lái)，對(duì)于香榧的研究主要集中在藥用價(jià)值和幼苗與生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)系上[17?19]，對(duì)香榧不同樹(shù)齡不同季節(jié)葉片光合特性方面的研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以6年生嫁接苗(初掛果期)和16年嫁接苗(盛果期)香榧葉片為研究對(duì)象，從表觀光合特性和光合內(nèi)部機(jī)構(gòu)系統(tǒng)地探討不同樹(shù)齡香榧葉片光合作用及對(duì)氣溫的響應(yīng)機(jī)制，為制定香榧高效栽培措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)區(qū)位于浙江省杭州市臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)香榧基地，29°56′～30°23′N，118°51′～119°52′E，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，溫暖濕潤(rùn)，光照充足，雨量充沛。土壤類型為黃壤土，林地肥料以復(fù)合肥為主，配施農(nóng)家肥。供試材料為16年生和6年生香榧嫁接苗。其中，16年生香榧嫁接苗為2000年采用嫁接苗造林，林分密度為450株·hm?2，砧木為2年生實(shí)生榧樹(shù)，接穗為1年生香榧，平均地徑為11.5 cm，平均樹(shù)高為2.6 m，記為16-a；6年生香榧嫁接苗為2010年采用嫁接苗造林，砧木為2年生實(shí)生榧樹(shù)，接穗為1年生香榧，平均地徑為8.3 cm，平均樹(shù)高為1.8 m，記為6-a。香榧于每年4月底萌發(fā)新葉，約50 d葉片生長(zhǎng)成為成熟葉[20]。本研究分別以2017年春季(5月)的未成熟葉片、夏季(8月)的成熟葉和秋季(11月)的成熟葉的當(dāng)年生葉片為材料。

1.2 方法

1.2.1 凈光合速率和暗呼吸速率的測(cè)定 氣象數(shù)據(jù)取自杭州市臨安區(qū)氣象局。選擇晴朗無(wú)風(fēng)的天氣，采用Li-6400便攜式光合儀(Licor-6400，Licor，美國(guó))，使用可控光簇狀葉室(22 L)進(jìn)行香榧當(dāng)年生葉片的光響應(yīng)測(cè)定。測(cè)定時(shí)，葉室內(nèi)CO2摩爾分?jǐn)?shù)設(shè)置為400 μmol·mol?1，由便攜式CO2小鋼瓶控制CO2摩爾分?jǐn)?shù)；根據(jù)氣溫(5月的最低和最高氣溫分別為16.2和27.2 ℃；8月分別為21.0和32.5 ℃；11月分別為13.3和24.7 ℃)，將5月、8月及11月葉室測(cè)定溫度分別控制在25、30和20 ℃，葉室的空氣相對(duì)濕度約50%；采用RGB-18白光光源，設(shè)定氣體流動(dòng)速度為 500 μmol·s?1。正式記錄前，先用800 μmol·m?2·s?1光強(qiáng)對(duì)葉片進(jìn)行光誘導(dǎo)20 min，待葉片活化穩(wěn)定后，再記錄測(cè)定數(shù)據(jù)，記為凈光合速率；再將光強(qiáng)調(diào)至0 μmol·m?2·s?1，并用黑色布將測(cè)定葉室罩住，待穩(wěn)定后再記錄測(cè)定數(shù)據(jù)，記為暗呼吸速率。重復(fù)3～5次，取平均值作為測(cè)定結(jié)果，以上測(cè)定均在9:00—11:00完成。

1.2.2 CO2響應(yīng)曲線 成熟香榧葉片的光飽和點(diǎn)為 (779.0±71.9) μmol·m?2·s?1[21]，因此，對(duì)葉片進(jìn)行CO2響應(yīng)曲線測(cè)定時(shí)，光照強(qiáng)度設(shè)為800 μmol·m?2·s?1。同時(shí)，為模擬生長(zhǎng)環(huán)境的溫度，5月、8月及11月葉室溫度分別控制為25、30和20 ℃。在開(kāi)始CO2響應(yīng)曲線測(cè)定前，先將葉片在CO2摩爾分?jǐn)?shù)為400 μmol·mol?1和光強(qiáng)為 800 μmol·m?2·s?1下持續(xù) 30 min，再依次按不同的 CO2摩爾分?jǐn)?shù) (400、300、200、100、50、400、800、1 200、1 600、1 800、2 000 μmol·mol?1)進(jìn)行凈光合速率 (Pn)的測(cè)定，再將數(shù)據(jù)通過(guò)FARQUHAR等[5]的模型擬合CO2響應(yīng)曲線。當(dāng)RuBP充足時(shí)，Rubisco是光合速率(Ac)的限制因子，公式如下：

式(1)中：Vcmax是最大RuBP羧化速率；Kc和Ko是Rubisco羧化作用和加氧作用的Michaelis常數(shù)；Ci和O分別為細(xì)胞間隙中的CO2和氧氣(O2)摩爾分?jǐn)?shù)；Rd是光下的呼吸速率；Г*是不含暗呼吸的CO2補(bǔ)償點(diǎn)。本研究采用von CAEMMERER等[22]模型中的Rubisco動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。

當(dāng)光合速率(Aj)受RuBP更新的限制，可表示為：

式(2)中：Jmax是光飽和時(shí)用于RuBP再生的光合電子傳遞速率。通過(guò)非線性最小二乘法得到擬合A—Ci曲線，分析得出 Vcmax和 Jmax。葉片的 Vcmax和 Rd可根據(jù) A—Ci曲線 (Ci＜250 μmol·mol?1)得出；Jmax則根據(jù) A—Ci曲線 (Ci＞600 μmol·mol?1)獲得。

CO2響應(yīng)曲線的測(cè)定在9:00—11:30和14:00—16:00完成。每株樹(shù)為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理為5～6個(gè)重復(fù)。

1.2.3 比葉重(SLW)測(cè)定 在氣體交換測(cè)定完成后，收集葉片并帶回實(shí)驗(yàn)室，將測(cè)定枝上的披針葉全部剪下，用透明膠帶把葉片粘貼在復(fù)印紙上，然后把復(fù)印出的針葉剪下稱量，葉面積根據(jù)單位復(fù)印紙的質(zhì)量計(jì)算。隨后將葉片放置烘箱，保持85 ℃烘干至恒量，稱干質(zhì)量。比葉重(g·m?2)=干質(zhì)量/葉面積。

1.2.4 葉綠素 (Chl)測(cè)定 采香榧新鮮葉片約 0.02 g，剪碎浸入盛有 8 mL 提取液 (體積分?jǐn)?shù)為 95% 乙醇)的離心管中，密封避光低溫浸提至無(wú)色[20]。根據(jù)用紫外分光光度計(jì)(UV 2500，島津)檢測(cè)波長(zhǎng)在649和664 nm處的吸光度。記錄所測(cè)葉片的鮮質(zhì)量和面積，計(jì)算葉綠素含量(mg·dm?2)。

1.2.5 葉片氮含量、光合氮素利用效率(PNUE)及氮素在光合機(jī)構(gòu)中的分配 采香榧葉片，用凱式定氮法[20]測(cè)定單位面積上的葉氮含量(NA，g·m?2)。以飽和最大光合速率(Amax)與NA的比值表示光合氮素利用效率 (photosynthetic nitrogen utilization efficiency，PNUE)[20]。植物葉氮在光合機(jī)構(gòu)中的分配[12]，即分配到Rubisco的氮素(Vcmax/NA)、RuBP再生作用的氮素(Jmax/NA)和捕光組分的氮素(Chl/NA)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel處理數(shù)據(jù)，通過(guò)SigmaPlot 12.5作圖，使用Origin 8.0繪制光合—光響應(yīng)曲線和光合—CO2響應(yīng)曲線，用SPSS檢驗(yàn)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片比葉重的變化

從圖1可以看出：無(wú)論樹(shù)齡大小，8月和11月香榧葉片的比葉重顯著大于5月香榧葉片的比葉重(P＜0.05)，8月和11月香榧葉片比葉重之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。5月，16-a的比葉重顯著高于6-a(P＜0.05)；8月和11月，樹(shù)齡之間的比葉重?zé)o顯著差異 (P＞0.05)。

圖1 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片比葉重的變化Figure 1 Changes in specific leaf weight (SLW) of T. grandis‘Merrillii’ at different tree ages among different months

2.2 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片凈光合速率和暗呼吸速率的變化

無(wú)論樹(shù)齡大小，香榧葉片的Pn在5月較低，8月快速上升達(dá)到峰值，且保持穩(wěn)定至11月(圖2)。5—11月，6-a和16-a香榧葉片的Pn均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。5月6-a香榧葉片的Rd顯著高于16-a(P＜0.05)，但8—11月兩者之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖2 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片凈光合速率(Pn)和暗呼吸速率(Rd)的變化Figure 2 Changes in net photosynthetic rate (Pn) and dark respiration rate (Rd) of T. grandis ‘Merrillii’ at different tree ages among different months

2.3 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片CO2響應(yīng)曲線的變化

由圖3可知：無(wú)論樹(shù)齡大小，11月香榧葉片的CO2飽和點(diǎn)顯著高于8月(P＜0.05)；8月時(shí)，16-a和 6-a 香榧葉片的 CO2飽和點(diǎn)分別為 725和 550 μmol·mol?1，11月時(shí)分別為 740和 1075 μmol·mol?1。由圖4可知：無(wú)論樹(shù)齡大小，5月香榧葉片的Vcmax和Jmax均顯著低于8月和11月(P＜0.05)。與8月相比，11月16-a和6-a的Vcmax分別降低了54.4%和64.6%，而Jmax分別降低了22.1%和25.8%。

圖3 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片CO2光合響應(yīng)曲線的變化Figure 3 Changes in CO2 response curves of photosynthesis in leaves of T. grandis ‘Merrillii’ at different tree ages among different months

圖4 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片的 Vcmax 和 Jmax 的變化Figure 4 Changes in Vcmax and Jmax in leaves of T. grandis ‘Merrillii’ at different tree ages among different months

2.4 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片葉色素含量的變化

圖5顯示：無(wú)論樹(shù)齡大小，5月香榧葉片的葉綠素含量顯著高于8和11月(P＜0.05)，且16-a香榧葉片的葉綠素含量均極顯著高于6-a香榧葉片的葉綠素含量(P＜0.001)。

圖5 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片葉綠素含量的變化Figure 5 Changes in chlorophyll content in leaves of T. grandis‘Merrillii’ at different tree ages among different months

2.5 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片氮含量、光合氮素利用效率(PNUE)及氮素在光合機(jī)構(gòu)中的分配

由圖6可見(jiàn)：無(wú)論樹(shù)齡大小，與5月相比，8月16-a和6-a香榧葉片的氮含量分別下降了23.8%和17.6%，差異顯著(P＜0.05)；與8月相比，11月16-a和6-a香榧葉片的氮含量均增加了11.0%，差異顯著(P＜0.05)；且6-a香榧葉片的PNUE均極顯著高于16-a (P＜0.001)；其中8月和11月時(shí)，6-a香榧葉片的PNUE分別為16-a香榧葉片的1.14和1.20倍。

圖6 不同月份不同樹(shù)齡單位面積上的香榧葉片氮含量(NA)和光合氮素利用效率(PNUE)的變化Figure 6 Changes in nitrogen content per area (NA) and photosynthetic nitrogen utilization efficiency (PNUE) in leaves of T. grandis‘Merrillii’ at different tree ages among different months

由表1可見(jiàn)：無(wú)論樹(shù)齡大小，與5月相比，8月香榧葉片的Jmax/Vcmax顯著降低(P＜0.05)；而與8月相比，11月香榧葉片的Jmax/Vcmax顯著增加(P＜0.05)。5月和8月時(shí)，16-a香榧葉片的Jmax/Vcmax顯著高于6-a (P＜0.05)。無(wú)論樹(shù)齡大小，與5月相比，8月香榧葉片的Jmax/NA、Vcmax/NA和Chl/NA均顯著增加(P＜0.05)；與8月相比，11月的16-a和6-a的Jmax/NA分別降低了30.1%和29.4%，而Vcmax/NA分別降低了60.9%和67.8%，而Chl/NA無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

表1 不同月份不同樹(shù)齡香榧葉片 Jmax/Vcmax、Jmax/NA、Vcmax/NA 和 Chl/NA 的變化Table 1 Changes in Jmax/Vcmax, Jmax/NA, Vcmax/NA and Chl/NA in leaves of T. grandis ‘Merrillii’ at different tree ages among different months

3 討論與結(jié)論

植物干物質(zhì)的90%～95%來(lái)源于光合作用。本研究結(jié)果顯示：5月時(shí)，16-a香榧葉片的比葉重顯著高于6-a葉片的，而此時(shí)16-a與6-a香榧葉片的Pn之間無(wú)顯著差異，但6-a香榧葉片的Rd則明顯大于16-a香榧葉片，這可能是由于呼吸消耗相對(duì)較低的16-a香榧葉片更有利用干物質(zhì)的積累，可為盛果期的豐產(chǎn)提供較多的物質(zhì)基礎(chǔ)。5和8月時(shí)，16-a和6-a香榧葉片的SLW均增至最大，這與其快速增長(zhǎng)的Pn、太陽(yáng)總輻射和日照長(zhǎng)度的增長(zhǎng)密切相關(guān)。杭州地區(qū)8月的太陽(yáng)總幅射和日照時(shí)數(shù)均明顯多于5月[23]。

本研究結(jié)果顯示：與5月相比，無(wú)論樹(shù)齡大小，8月香榧葉片的Pn和SLW均明顯增大；但8月香榧葉片的NA均顯著降低，這可能是由于葉片光合作用增強(qiáng)，碳水化合物快速積累，而使其葉片中的氮含量被稀釋了[9?10]。有研究表明：隨著山胡椒屬Lindera植物L(fēng)indera umbellate落葉植物葉片的衰老，葉片中可代謝的氮素(如光合相關(guān)蛋白質(zhì))會(huì)降解成可再利用的氮素[24]，再轉(zhuǎn)移至其他發(fā)育的器官中[25]。無(wú)論樹(shù)齡大小，與8月相比，11月香榧葉片的Pn略有上升，且NA顯著增加，表明當(dāng)年生的香榧葉片并未啟動(dòng)衰老過(guò)程，其所增加的葉片氮含量可能來(lái)源于其他多年生衰老的葉片。這與趙雨馨[26]的研究結(jié)果相一致，12月香榧葉片光合速率顯著高于7和10月。無(wú)論哪個(gè)月份，16-a香榧葉片的NA均顯著高于6-a香榧葉片的，但其PNUE卻均顯著低于6-a香榧葉片的，表明在生產(chǎn)上須注意氮肥的施用，尤其是像16-a這種進(jìn)入盛果期的香榧。通常，葉片中50%以上的氮素分配到光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)中，如Rubisco、捕光蛋白等[8]。有研究表明：Vcmax的降低通常是由于Rubisco含量的減少[27]或Rubisco活化位點(diǎn)降低[28]。矮垂頭菊Daphniphyllum humile當(dāng)年生葉片的氮含量、Rubisco含量隨季節(jié)變化(從春季到秋季)呈逐漸增加的趨勢(shì)，但其葉片的飽和光合速率穩(wěn)定不變[9]。本研究結(jié)果顯示：無(wú)論樹(shù)齡大小，與8月相比，11月香榧葉片SLW、Pn無(wú)顯著變化，而其NA均顯著增加，但Vcmax均顯著降低，表明當(dāng)年生的香榧葉片Vcmax的降低可能是Rubisco活化位點(diǎn)的減少引起的。8月時(shí)，6-a香榧葉片的Vcmax顯著高于16-a香榧葉片的，但兩者之間的Amax無(wú)顯著差異，這可能是由于其Rubisco未完全激活，僅起著儲(chǔ)存氮素的作用[29]。已有研究表明：相比較易招引昆蟲(chóng)的氨基酸形式的氮素形態(tài)，Rubisco是更好的氮素儲(chǔ)存形式[30]。

與20世紀(jì)相比，大氣CO2摩爾分?jǐn)?shù)和溫度均明顯升高，且未來(lái)還將會(huì)持續(xù)升高[31?32]。本研究結(jié)果顯示：無(wú)論樹(shù)齡大小，香榧葉片的CO2飽和點(diǎn)均大于500 μmol·mol?1，表明香榧葉片的光合作用在當(dāng)今大氣的CO2摩爾分?jǐn)?shù)下仍未達(dá)到飽和，對(duì)高摩爾分?jǐn)?shù)CO2有一定的適應(yīng)性，這可能也是香榧的結(jié)果期可達(dá)百年甚至千年的原因之一。研究表明：Jmax/Vcmax可以指示RuBP再生作用和羧化作用2個(gè)過(guò)程的相關(guān)蛋白質(zhì)的分配情況[33?34]。本研究結(jié)果顯示：無(wú)論樹(shù)齡大小，隨溫度的降低(8—11月)，香榧葉片的Jmax/Vcmax均明顯增大，這與前人的研究結(jié)果一致[7, 35]。當(dāng)光合速率處于受RuBP羧化作用限制的階段(Ac)時(shí)，碳同化對(duì)溫度的變化不太敏感，由于低溫下光呼吸也受抑制，有利于促進(jìn)CO2的羧化固定，降低的光呼吸消耗從一定程度上彌補(bǔ)了低溫引發(fā)減弱的RuBP羧化作用[36]，而當(dāng)光合速率受RuBP再生作用限制的階段(Aj)，其碳同化較易受到低溫的影響[36?37]，因此，在高CO2摩爾分?jǐn)?shù)下，溫度對(duì)其光合碳同化的影響遠(yuǎn)大于其在低CO2摩爾分?jǐn)?shù)下的影響。由此可知，較低溫下(與8月相比，11月香榧苗木生長(zhǎng)的環(huán)境溫度約下降了10 ℃以上)，香榧葉片通過(guò)Jmax的相對(duì)增加(下降幅度相對(duì)較小)來(lái)緩減低溫對(duì)RuBP再生作用的影響，即植物通過(guò)改變Jmax/Vcmax來(lái)調(diào)整Ac和Aj之間的失衡狀態(tài)[37?38]。

此外，調(diào)整氮素在光合機(jī)構(gòu)的分配常被認(rèn)為是植物適應(yīng)溫度變化的重要機(jī)制[11]。本研究結(jié)果顯示：隨著氣溫的降低(8—11月)，香榧葉片分配到Rubisco的氮素(Vcmax/NA)顯著減少，其下降幅度明顯大于分配到其他光合蛋白的氮素(Jmax/NA和Chl/NA)。這可能是由于不同光合蛋白的理化性質(zhì)引起的，即Rubisco是一種可溶性蛋白，而反應(yīng)中心和捕光蛋白(如LHCII)是類囊體膜蛋白，因此，Rubisco中氮素再利用效率明顯高于其他捕光蛋白(如LHCII)中的氮素。有研究表明：在高CO2摩爾分?jǐn)?shù)下，如果將氮素相對(duì)較少地分配到Rubisco，且相對(duì)較多地分配到RuBP再生作用相關(guān)的光合蛋白上，則會(huì)大大提高氮素的光合利用效率[37, 39]。本研究結(jié)果顯示：隨著氣溫的降低(8—11月)，6-a香榧葉片Vcmax/NA的下降幅度明顯大于16-a葉片的，而6-a與16-a香榧葉片Jmax/NA的下降幅度相差不多，因此，低溫下(11月)，6-a香榧葉片分配到RuBP羧化作用的氮素較少和分配到RuBP再生作用的氮素較多是其葉片PNUE相對(duì)較高的原因。此外，香榧是一種長(zhǎng)壽的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，是否能通過(guò)調(diào)控氮素在光合組分中的分配來(lái)適應(yīng)逐漸變暖、CO2摩爾分?jǐn)?shù)持續(xù)上升的全球氣候變化？因此，未來(lái)應(yīng)該重點(diǎn)研究香榧古樹(shù)與新種植的香榧樹(shù)對(duì)溫度和CO2摩爾分?jǐn)?shù)倍增變化的適應(yīng)性是否存在差異。