張 琳,陳 晨,于藝冰,李一鳴,宋 輝,李峰敏

(秦皇島市第一醫(yī)院 血液科,河北 秦皇島066000)

淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤是最常見的淋巴瘤，發(fā)病率逐年升高，在惡性腫瘤死亡原因中居第10位，其中B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)發(fā)病占淋巴瘤的90%以上，而NHL中最常見的亞型為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)[1-2]。中國的DLBCL發(fā)病率占所有B細(xì)胞NHL的40%以上，是成人最常見的B細(xì)胞NHL。DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal center B-cell，GCB)型和非生發(fā)中心B細(xì)胞樣(non-GCB)型[3]。鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要的鈣結(jié)合蛋白之一，主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中，參與多個(gè)重要的細(xì)胞過程，主要包括鈣離子平衡調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)控、血管生成、細(xì)胞黏附、抗原呈遞、自身免疫等[4]。牛痘相關(guān)激酶1(vaccinia-related kinase1，VRK1)是絲氨酸-蘇氨酸激酶VRK家族中的一員，參與細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄激活、DNA修復(fù)和組蛋白修飾等[5]。F框/WD40域蛋白7(F-box and WD-40domain protein7,FBXW7)是一種腫瘤抑制因子，控制細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡、癌變等多種細(xì)胞生物學(xué)過程[6]。目前臨床中缺乏Calreticulin、VRK1、FBXW7聯(lián)合檢測(cè)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的相關(guān)研究，本文旨在研究上述因子在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)及診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年3月到2021年3月在秦皇島市第一醫(yī)院病理科保存的60例DLBCL組織以及癌旁組織；根據(jù)發(fā)病部位分為頸部淋巴結(jié)、腹腔淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、鎖骨上淋巴結(jié)、縱隔淋巴結(jié)。選取同時(shí)期在我院病理科保存的正常淋巴組織60例為正常組，兩組研究對(duì)象基線資料見表1。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)本文研究患者及其家屬均知情，簽署知情同意書，經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)精神異?；颊撸?3)妊娠期、哺乳期患者；(4)進(jìn)行漫大B細(xì)胞淋巴瘤手術(shù)前接受放射治療、化學(xué)治療以及生物學(xué)療法者。

1.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.1采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)Calreticulin、Fbxw7 使用傳統(tǒng)的規(guī)范Trizol提取方法提取RNA用beckman酶標(biāo)儀測(cè)定Calreticulin、Fbxw7(1)將彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織放入勻漿管中，加入RNA裂解液，用組織勻漿機(jī)破碎組織；(2)加入稀釋液，混勻，室溫放置5-6 min；再加入無水乙醇，混勻，離心10 000 g，半徑15 000 r，7 min，棄濾液；(3)反復(fù)3次離心、半徑、棄濾液，將得到的RNA保存在-80℃；(4)按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄；(5)按照Roche LightCycler?480實(shí)時(shí)定量PCR儀要求；(6)將PCR96孔板4 000 g離心5 min后放入Roche LightCycler?480儀器中，95℃ 5 min為一個(gè)循環(huán)，95℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 10 s為45循環(huán)，95℃ 5 s、65℃ 1 min、97℃、40℃ 30 s為一個(gè)循環(huán)利用公式-△△ct=(實(shí)驗(yàn)組目的基因ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因ct值)-(對(duì)照組目的基因ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因ct值)；(7)加入約30 μl DEPC處理的去離子水重新溶解白色沉淀物，即總RNA。

1.2.2采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中VRK1表達(dá) 按抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶(Streptavidin Peroxidase，SP)免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明進(jìn)行操作。(1)取彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織和瘤旁組織石蠟標(biāo)本，將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇再水合；(2)用配制好的修復(fù)液(0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，pH值6.0)PBS沖洗3次,高溫高壓下進(jìn)行抗原修復(fù)15 min,然后用5%過氧化氯處理，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；(3)滴加稀釋好的正常山羊血清封閉抗原。將切片與兔抗人VRK1單抗(稀釋比1∶100)在5℃下反應(yīng)過夜，添加山羊抗兔二抗在37℃下反應(yīng)30 min，然后用過氧化酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液室溫反應(yīng)30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，Harris蘇木精對(duì)比染色，最后進(jìn)行脫水與封固；(4)在顯微鏡下觀察到在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中有棕黃色或棕褐色顆粒即為陽性細(xì)胞，高倍鏡下觀察染色強(qiáng)度并計(jì)算陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基線資料比較

如表1所示，DLBCL組、正常組年齡、性別、BMI、比較無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05)，具有可比性。

表1 基線資料比較

2.2 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達(dá)在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中的比較

如表2所示，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織Calreticulin、VRK1表達(dá)高于瘤旁組織、正常組織，F(xiàn)bxw7表達(dá)低于瘤旁組織、正常組織(P<0.05)。瘤旁組織Calreticulin、VRK1表達(dá)高于正常組織，F(xiàn)bxw7表達(dá)低于正常組織(P<0.05)。

表2 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達(dá)在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中的比較

2.3 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達(dá)在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者病理特征關(guān)系

如Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達(dá)與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者臨床分期、分化程度、結(jié)外病灶個(gè)數(shù)、LDH、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。隨臨床分期程度加重、分化程度越低、結(jié)外病灶個(gè)數(shù)增加、LDH升高，Calreticulin、VRK1表達(dá)不斷升高，F(xiàn)bxw7不斷降低(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Calreticulin、VRK1表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，F(xiàn)bxw7低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。

表3 Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達(dá)在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者病理特征關(guān)系

2.4 Calreticulin、VRK1、Fbxw7對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷價(jià)值

ROC分析Calreticulin、VRK1、Fbxw7單獨(dú)預(yù)測(cè)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的曲線下面積(area under the curve，AUC)低于3項(xiàng)聯(lián)合，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度高于Calreticulin、VRK1、Fbxw7表達(dá)單一檢測(cè)(P<0.05)，見表4，圖1。

表4 Calreticulin、VRK1、Fbxw7對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷價(jià)值

圖1 Calreticulin、VRK1、Fbxw7對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷價(jià)值(ROC曲線)

3 討論

DLBCL的發(fā)生發(fā)展與多種遺傳信息異常有關(guān)，是一個(gè)異質(zhì)性、多步驟的過程，由各種信號(hào)通路的異常激活或阻滯引起的異常細(xì)胞生長、分化、凋亡均會(huì)引發(fā)DLBCL[8]。現(xiàn)已明確藥物化療的主要機(jī)制是誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但最終會(huì)引起細(xì)胞異常增殖、凋亡受到抑制，進(jìn)而對(duì)化療產(chǎn)生耐受性[9-10]。

Araki M研究表明[11]，Calreticulin在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，如胃腺癌、尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌、前列腺癌等，在腫瘤中發(fā)揮促瘤生長、轉(zhuǎn)移及侵襲等作用,但其在淋巴瘤中尤其是B細(xì)胞NHL中表達(dá)的臨床意義仍不明確。本文研究結(jié)果顯示Calreticulin在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中高于瘤旁組織和正常組織，其水平的高低與患者的臨床分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)、結(jié)外病灶個(gè)數(shù)、LDH有關(guān)，提示Calreticulin可作為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的早期診斷輔助標(biāo)志物。Liu P研究發(fā)現(xiàn)[12]Calreticulin在多種惡性腫瘤中的表達(dá)增加，且與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)。其原因歸結(jié)為：Calreticulin是高度保守、普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的鈣結(jié)合蛋白，不僅局限在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而是涉及參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激、鈣離子平衡調(diào)節(jié)等多種生理和病理過程的多功能基因[13-14]。

有研究發(fā)現(xiàn)[15-16]VRK1在不同腫瘤中存在差異表達(dá)，對(duì)腫瘤的發(fā)展具有調(diào)控作用，如VRK1在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌中發(fā)生突變或差異表達(dá)，且調(diào)控腫瘤的發(fā)生。本文研究結(jié)果顯示VRK1在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中高表達(dá)，隨臨床分期程度加重、分化程度越低、結(jié)外病灶個(gè)數(shù)增加、LDH升高VRK1表達(dá)不斷升高。Ben等[17]研究發(fā)現(xiàn)VRK1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，VRK1的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)。與本文研究結(jié)果保持一致。

FBXW7基因是人類重要的抑癌基因，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，F(xiàn)BXW7的缺失與腫瘤化療過程中的抵抗也有一定關(guān)系[18]。有研究證明[19]FBXW7的腫瘤抑制功能可以由多個(gè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)、突變、剪接以及上游的細(xì)胞信號(hào)通路所調(diào)控，主要是通過對(duì)下游底物的影響導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，故恢復(fù)其腫瘤抑制功能也是設(shè)計(jì)治療癌癥患者的新思路。本研究經(jīng)ROC分析顯示FBXW7對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷價(jià)值的AUC達(dá)0.711，靈敏度和特異度分別為0.596%、0.825%，提示FBXW7可作為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的早期診斷輔助標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)[20]FBXW7在腫瘤中抑制蛋白，在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，包括急性T淋巴細(xì)胞白血病、胃結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、膽管上皮癌、胰腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等，這與本文研究結(jié)果一致。

綜上所述，Calreticulin、VRK1、FBXW7在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中表達(dá)異常，其表達(dá)水平的高低與臨床分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)、結(jié)外病灶個(gè)數(shù)、LDH升高有關(guān)，三者聯(lián)合對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的診斷價(jià)值顯著。

作者簡介：張琳(1986-)，女，主治醫(yī)師，研究生學(xué)歷，主要從事血液科常見病的臨床和科研工作。