黃勇，易發(fā)現(xiàn)，任超，張宏，寶詩(shī)琪，閆駿

膀胱癌是臨床較為常見(jiàn)的一種泌尿系惡性腫瘤，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生較為嚴(yán)重的影響[1]。為明確膀胱癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，臨床一直致力于治療靶標(biāo)和診斷標(biāo)志物的研究。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種來(lái)自于人體本身，但長(zhǎng)度小于200 kb且不具有編碼功能的RNA[2]。多項(xiàng)臨床研究顯示[3-4]，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中均有l(wèi)ncRNA的參與;同時(shí)大量lncRNA被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、胃癌等惡性生物學(xué)過(guò)程中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，AK092375在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中過(guò)表達(dá)，而在正常膀胱黏膜中不表達(dá)或低表達(dá)[5]。然而，高表達(dá)的AK092375如何導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)仍不清楚[6]。為此，應(yīng)用基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)軟件分析了與AK092375轉(zhuǎn)錄相關(guān)的共表達(dá)基因和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路，表明葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(GLUT3)的表達(dá)及NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路在膀胱癌細(xì)胞進(jìn)展中起著一定作用[7]?，F(xiàn)探究lncRNA AK092375在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，并分析AK092375通過(guò)GLUT3的表達(dá)對(duì)NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子的影響，為膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供新的方向和思路，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：人膀胱癌細(xì)胞系T24、人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1。(2)試藥及試劑：鼠抗NF-κB單克隆抗體、鼠抗TCS2單克隆抗體、鼠抗mTOR單克隆抗體、鼠抗AK092375單克隆抗體、鼠抗GLUT3單克隆抗體均購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；胎牛血清和RP-MI1640培養(yǎng)基購(gòu)于上?；蚩萍加邢薰荆琑NA提取試劑購(gòu)于廣州賽百純生物科技有限公司；AK092375 siRNA、GLUT3 siRNA、AK092375全長(zhǎng)序列的過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-AK092375)、GLUT3全長(zhǎng)序列的過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-GLUT3)和RT-PCR引物購(gòu)于上海北諾生物科技有限公司。(3)儀器設(shè)備：iMark酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，ST-360型)；PCR擴(kuò)增儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，A700型)；BPN-40 RHP型二氧化碳培養(yǎng)箱(蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司);顯微鏡(蘇州西默醫(yī)療科技有限公司,DOM3000A型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年1月—2021年5月于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將人膀胱癌細(xì)胞系T24和人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1于含有10%雙抗和胎牛血清的培養(yǎng)液(RP-MI1640)中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱充予5%CO2、維持37℃，隔天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合到90%左右時(shí)，即可進(jìn)行傳代；而后隨機(jī)分為A組(AK092375和GLUT3同時(shí)過(guò)表達(dá))、B組(AK092375和GLUT3同時(shí)干擾)、C組(AK092375過(guò)表達(dá)而GLUT3干擾)、D組(AK092375干擾而GLUT3過(guò)表達(dá))4組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將上述培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的T24細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，置于多個(gè)6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行接種，待細(xì)胞匯合處于70%左右時(shí)，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。其中A組進(jìn)行40 nmol/L的pcDNA-AK092375、pcDNA-GLUT3轉(zhuǎn)染；B組進(jìn)行40 nmol/L的AK092375 siRNA、GLUT3 siRNA轉(zhuǎn)染；C組進(jìn)行40 nmol/L的pcDNA-AK092375、GLUT3 siRNA轉(zhuǎn)染；D組進(jìn)行40 nmol/L的AK092375 siRNA、pcDNA-GLUT3轉(zhuǎn)染。4組孵育48 h后分別收集培養(yǎng)好的細(xì)胞，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)[8]：收集各組部分轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞蛋白提取、含量測(cè)定，而后將其置于SDS-PAGE膠中，在130 V條件下進(jìn)行2 h的電泳處理；通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；在室溫條件下，以Tris緩沖液(含有5%脫脂奶粉)處理PVDF膜1 h，裁剪完成后與一抗混合，在4℃條件下，孵育過(guò)夜；采用TBST對(duì)上述膜清洗8 min，重復(fù)操作4次，加入二抗(經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，之后在室溫條件下孵育2 h；采用TBST對(duì)上述膜清洗8 min，重復(fù)操作4次，最后通過(guò)ECL試劑盒對(duì)GLUT3及NF-κB、TCS2、mTOR蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)[9]：收集各組部分轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的細(xì)胞，將Trizol試劑加入其中，提取細(xì)胞RNA，并對(duì)其完整性進(jìn)行鑒定，通過(guò)說(shuō)明書(shū)建立PCR反轉(zhuǎn)錄體系，之后再進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸處理30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增之后，進(jìn)入數(shù)據(jù)分析界面，內(nèi)參以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為準(zhǔn)，通過(guò)2-ΔΔCt法對(duì)AK092375、GLUT3及NF-κB、TCS2、mTOR目的基因表達(dá)量的相對(duì)值進(jìn)行計(jì)算。

表1 相關(guān)基因表達(dá)的PCR引物序列

1.3.3 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖水平[10]：將轉(zhuǎn)染4 h后的各組細(xì)胞取出，向其中加入CCK-8溶液10 μl，再常規(guī)培養(yǎng)4 h，以iMark酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定光密度值(OD)，細(xì)胞增殖能力以O(shè)D450表示。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力[11]：完成轉(zhuǎn)染48 h以后，取出生長(zhǎng)良好的各組膀胱癌細(xì)胞，置于6孔板中，并在其底面劃出均勻?qū)挾鹊木€(xiàn)條。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)融合度達(dá)到95%時(shí)，用磷酸鹽緩沖液沖洗1次，之后采用移液槍槍頭進(jìn)行劃痕處理；再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，將其置入到無(wú)血清的培養(yǎng)基中，進(jìn)行24 h的常規(guī)培養(yǎng)，最后通過(guò)顯微鏡拍照進(jìn)行細(xì)胞遷移率的統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 AK092375和GLUT3蛋白在不同細(xì)胞系中的表達(dá)比較 以GAPDH為參照，在人膀胱癌細(xì)胞系T24中AK092375和GLUT3蛋白的表達(dá)量明顯高于人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1(t/P=3.215/<0.001、2.538/<0.001)，見(jiàn)圖1。

注：A.人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞；B.人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1

2.2 各組膀胱癌細(xì)胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)比較 GLUT3、NF-κB、TCS2、mTOR基因mRNA表達(dá)水平比較，A組>D組>C組>B組，且各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組膀胱癌細(xì)胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)比較

2.3 各組膀胱癌細(xì)胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 GLUT3、NF-κB、TCS2、mTOR蛋白表達(dá)水平比較，A組>D組>C組>B組，且各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3和圖2。

2.4 各組膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移情況比較 膀胱癌細(xì)胞遷移率和增殖情況比較，A組>D組>C組>B組，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表3 各組膀胱癌細(xì)胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖2 各組膀胱癌細(xì)胞GLUT3及NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

膀胱癌病因?qū)W研究認(rèn)為，膀胱癌的發(fā)病與基因異常及外界危險(xiǎn)因素侵襲有關(guān)，其中遺傳學(xué)研究涉及的分子改變包括染色體的不穩(wěn)定性、表觀遺傳沉默及腫瘤抑癌基因的改變等[12]。近年來(lái)，表觀遺傳機(jī)制在惡性腫瘤中的作用受到關(guān)注，因?yàn)樵絹?lái)越多的證據(jù)表明表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重

構(gòu)、RNA干擾等的異常在細(xì)胞腫瘤惡變行為中起到了重要作用[13]。在各種表觀修飾中，以非編碼形式存在的RNA可能在膀胱癌中具有特殊的意義[14]。非編碼RNA(ncRNA)是指由基因轉(zhuǎn)錄形成但不編碼蛋白質(zhì)的RNA。人類(lèi)基因組中98%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為ncRNA，其中具有調(diào)節(jié)作用的ncRNA包括短鏈RNA(如microRNA、siRNA等)和lncRNA[15]。過(guò)去10年研究積累的證據(jù)表明，lncRNA是基因表達(dá)重要的調(diào)控因子，在許多人類(lèi)惡性腫瘤(如前列腺癌、膀胱癌和腎癌)中特異的lncRNA功能改變促進(jìn)腫瘤的形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移，組織特異性表達(dá)的lncRNA可能作為非侵入性預(yù)后或治療判定的標(biāo)志物[16]。通過(guò)研究lncRNA在正常和惡性細(xì)胞中的功能，更好地了解lncRNA分子的性質(zhì)和機(jī)制，從而更好地了解腫瘤的生物學(xué)特征，為泌尿系統(tǒng)腫瘤的治療提供新靶點(diǎn)。

本結(jié)果顯示，AK092375和GLUT3蛋白在T24細(xì)胞系中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，表明AK092375和GLUT3可能參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。有研究顯示[17]，AK092375在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織和非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌組織中過(guò)表達(dá)，而在正常膀胱黏膜中不表達(dá)或低表達(dá)。而GLUT3是細(xì)胞膜上跨脂質(zhì)雙分子層、參與細(xì)胞外葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白，GLUT3高表達(dá)后可提高糖酵解的速率和增加葡萄糖的攝取[18]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)GLUT3在人類(lèi)乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，且高表達(dá)的GLUT3與預(yù)后不良有關(guān)[19]。研究表明AK092375和GLUT3的過(guò)表達(dá)程度越高，膀胱癌細(xì)胞的NF-κB、TCS2、mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)水平也越高[20]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤在產(chǎn)生侵襲時(shí)重要的一種機(jī)制，而GLUT3可促進(jìn)癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。GLUT3也可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB、TCS1/2基因的表達(dá)，從而激活NF-κB/TCS/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的形成[21]。NF-κB是對(duì)機(jī)體血管生成、細(xì)胞凋亡生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的一種關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，其通路被激活后可廣泛參與多種病理和生理過(guò)程的基因調(diào)控，在腫瘤和炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用顯著[22]。mTOR是一種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及蛋白質(zhì)翻譯的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，具有高度的保守性。mTOR通路包含一系列相關(guān)的蛋白和底物，其可對(duì)磷酸化蛋白激酶B(Akt)、PI3K依賴(lài)的激酶1(PDK1)的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)[23]。相關(guān)研究顯示[24]，mTOR通路相關(guān)因子的異常表達(dá)，可導(dǎo)致心血管疾病及腫瘤等重大疾病。在卵巢癌、乳腺癌及膀胱癌等惡性腫瘤中，Akt/PI3K信號(hào)通路被激活后，可將信號(hào)通過(guò)NF-κB、mTOR的高表達(dá)向下游底物進(jìn)行傳遞，進(jìn)而對(duì)CDK4抑制劑的表達(dá)產(chǎn)生抑制效果，進(jìn)而使細(xì)胞周期加速。另外，NF-κB還可對(duì)腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的多種細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和增殖。故mTOR通路和NF-κB通路兩者產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

表4 各組膀胱癌細(xì)胞遷移率和增殖情況比較

綜上所述，AK092375可能通過(guò)上調(diào)GLUT3的表達(dá)，從而激活下游NF-κB/TCS2/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，具有一定的臨床參考價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃勇：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；易發(fā)現(xiàn)：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;任超、寶詩(shī)琪：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改;張宏：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;閆駿：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)