李 昊，周可磊，唐國強(qiáng)，陳世云，彭艷伶

（1.西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013；2.四川省涼山州動物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615050；3.四川省西昌市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 西昌 615000）

犢牛腹瀉一年四季均可發(fā)生，尤其以冬季和早春多發(fā)，且3 周齡以內(nèi)的犢牛更容易發(fā)生［1］。導(dǎo)致犢牛腹瀉的主要病因分病毒性、細(xì)菌性、寄生蟲性和營養(yǎng)性，病毒感染是引起腹瀉的重要原因且易引起系統(tǒng)損傷和免疫抑制，導(dǎo)致犢牛生產(chǎn)性能下降甚至死亡［2］。近年來，我國各個地區(qū)對犢牛腹瀉的流行病學(xué)調(diào)查都有很多報(bào)道［3-5］，然而，針對四川省涼山州西昌市犢牛腹瀉的病原調(diào)查未見報(bào)道。本次采集西昌市某奶牛場22 頭有臨床腹瀉癥狀的犢牛腹瀉糞便樣本，對常見的重要病原進(jìn)行檢測，以摸清犢牛腹瀉的病原種類和流行規(guī)律，為西昌市犢牛腹瀉防控提供參考依據(jù)。

1 發(fā)病情況

該奶牛場于2020年先后進(jìn)行了口蹄疫、牛出敗、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV）-牛傳染性鼻氣管炎（IBR）二聯(lián)滅活苗的免疫，飼喂經(jīng)巴氏消殺的抗生奶、代乳粉、誘食料?，F(xiàn)有犢牛135頭（未斷奶犢牛83頭），2021年1月犢牛發(fā)生腹瀉（腹瀉主要發(fā)生于30 日齡前，個別2 日齡也出現(xiàn)腹瀉），現(xiàn)場調(diào)查腹瀉犢牛22 頭，發(fā)病率達(dá)16.30%。主訴該場發(fā)病率最高達(dá)40%，死亡率為10%。腹瀉發(fā)生后，采用恩諾沙星注射液（肌注0.025 mL/kg）、磺胺間甲氧嘧啶注射液（肌注0.2～0.3 mL/kg）、土霉素片（內(nèi)服15 mg/kg）進(jìn)行治療，但效果不佳。

2 材料和方法

2.1 樣本采集 2021 年1 月對該奶牛場22 頭腹瀉犢牛逐一采集糞便樣本，隨后冷藏運(yùn)輸并儲存在-80 ℃。

BCoV、BRV、BVDV、BNoV、NeV、BPV、BToV及大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等陽性毒（菌）株均由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

2.2 主要試劑及儀器 Trizol 試劑RNAiso Plus（Code No.9109）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Code No.RR037A）、TaKaRa Ex Taq 酶、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、6×DNA Loading Buffer、DL2000 DNA Marker、pMDTM19-T 克隆載體、感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α Competent Cells等購于寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒Gel Extraction Kit D2500 和質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I 購于Omega Bio-Tek 公司；氯仿、蛋白酶K、異戊醇、SDS（10%濃度）、STE等DNA提取常規(guī)試劑由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。儀器：紫外分光光度計(jì)Cary 50 Probe（Vatian 公司，美國）；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000（Bio-Rad 公司，美國）；高速冷凍離心機(jī)TGL-16（蜀科公司，中國）。

2.3 核酸提取 取適量的糞便與滅菌PBS 緩沖液（pH 7.2）按1∶5的比例制成混懸液，置于-80 ℃超低溫中反復(fù)凍融3次，于4 ℃臺式高速冷凍醫(yī)用離心機(jī)中以8 500 r/min離心10 min，取其上清液再用0.22 μm 微孔徑過濾器過濾，過濾好的混懸液取300 μL 嚴(yán)格按照TrizolTMReagent 試劑盒說明書的方法提取樣本總RNA，全程在4 ℃下操作（旨在保證所提取的核酸不被降解），提取的總RNA嚴(yán)格按照PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒說明書的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱中備用。另取過濾好的混懸液300 μL 加入STE 500 μL、SDS 和PKA 各20 μL 后水浴1～3 h 進(jìn)行DNA 提取，提取后的細(xì)菌DNA 保存于4 ℃冰箱中備用。

2.4 細(xì)菌和病毒的PCR 和RT-PCR 檢測 運(yùn)用PCR和RT-PCR方法進(jìn)行檢測，所用引物均由上海生工生物科技有限公司合成，詳細(xì)序列見表1。

表1 引物序列信息

3 結(jié)果

由表2、表3 可見，大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌均未檢出；22 份糞便樣本均檢測到了BVDV（100%）；BNoV 陽性樣本有16 份（72.73%）；NeV陽性樣本有12 份（54.54%）；BRV 陽性樣本有8份（36.36%）；BPV 陽性樣本有4 份（18.18）；BCoV陽性樣本有1 份（4.54%）；BToV 陽性樣本有1份（4.54%）。BVDV 感染率達(dá)100%，說明該牛場BVDV 感染呈廣泛流行，BNoV 和NeV 感染率次之。

表2 犢牛糞便樣本檢測結(jié)果

表3 犢牛糞便樣本陽性率檢測情況

檢測結(jié)果表明，22 份犢牛糞便樣本中除1 份樣本只感染1種病毒外，其余21份樣本均為混合感染，感染率高達(dá)95.45%。其中，有3 份樣本感染了5種病毒（13.64%），有2份樣本感染了4種病毒（9.09%），有8份樣本感染了3種病毒（36.36%），其余8份樣本感染了2種病毒（36.36%）。

4 討論

病毒感染是引起犢牛腹瀉的重要原因，這些病毒主要有牛輪狀病毒（BRV）、牛冠狀病毒（BCoV）、紐布病毒（NeV）、牛諾如病毒（BNoV）、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV）、牛細(xì)小病毒（BPV）和牛環(huán)曲病毒（BToV）等。其中，BRV、BCoV、BVDV 能導(dǎo)致70%以上的新生犢牛發(fā)病，且死亡率高達(dá)50%，給養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。細(xì)菌如大腸桿菌（E.coli）、沙門氏菌（Salmonella）、巴氏桿菌（Pasteurella）等也可引起犢牛腹瀉。大腸桿菌、沙門氏菌、輪狀病毒和冠狀病毒等病原還是重要的人畜共患病病原［6-8］，可能對地區(qū)公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。

本試驗(yàn)對22 份犢牛腹瀉糞便樣本進(jìn)行了PCR 和RT-PCR 檢測，結(jié)果細(xì)菌性病原并未檢測到，可能與該場犢牛群使用了抗生素藥物有關(guān)；檢 出BVDV、BNoV、NeV、BRV、BPV、BCoV 和BToV 的陽性率分別為：100%、72.73%、54.54%、36.36%、18.18%、4.54%和4.54%。本結(jié)果表明，該場發(fā)生的犢牛腹瀉由多種病毒混合感染所致，感染率達(dá)95.45%，這與美國之前的報(bào)道相似［9］。犢牛群中BVDV 感染率最高，達(dá)100%，BNoV和NeV 陽性率分別為72.73%、54.54%，表明BVDV、BNoV 和NeV 是該奶牛場犢牛腹瀉的主要病原。此外，BRV 和BCoV 屬于人畜共患病病原［8］，在防控BRV 和BCoV 的同時，應(yīng)當(dāng)做好飼養(yǎng)員自身的生物安全防護(hù)，防止出現(xiàn)公共衛(wèi)生事件。

依照BVDV 的病毒基因序列差異，將其分為BVDV-1（Pestivirus A）、BVDV-2（Pestivirus B）和BVDV-3（Pestivirus H、HoBi-like Pestivirus and atypical ruminant Pestivirus），并且BVDV-1和BVDV-2 還包含不同的亞型［10］。全球范圍內(nèi)主要流行的2 個亞型為BVDV-1a 和BVDV-1b。有文獻(xiàn)報(bào)道，BVDV-1b是我國牛群最優(yōu)勢流行毒株，且難以防控［11］。該奶牛場使用了BVDV-IBR二聯(lián)滅活苗，感染率仍然高達(dá)100%，猜測可能與感染毒株的基因型不一致所致?，F(xiàn)在國內(nèi)外BVD 滅活疫苗大多數(shù)針對于BVDV-1 型，雖然BVDV-1型滅活疫苗免疫牛群后產(chǎn)生的抗體能與BVDV-2型產(chǎn)生部分交叉免疫，但對抵御BVDV-2 型強(qiáng)毒株的能力卻不得而知［12］，對BVDV-3 型的免疫力尚未見報(bào)道。所以該場感染的BVDV屬于哪一個基因型，需作進(jìn)一步研究。

近年來，BNoV、NeV、BToV 作為新發(fā)腹瀉病原，嚴(yán)重危害了我國牛群的健康，也越來越受到關(guān)注。王玥琳等［13］采用RT-PCR方法檢測了我國5個省12個奶牛場的BNoV感染情況，結(jié)果顯示糞便樣本中BNoV的檢出率達(dá)25.81%。郭紫晶等［14］采用RT-PCR方法檢測了我國6個省18個奶牛場的NeV感染情況，結(jié)果顯示糞便樣本中NeV的檢出率高達(dá)48.1%。Li Hao等［15］采用RT-PCR方法檢測了我國4個省5個奶牛場的BToV感染情況，結(jié)果顯示糞便樣本中BToV 的檢出率達(dá)21.73%。這些都表明BNoV、NeV、BToV作為我國新發(fā)病原已經(jīng)在國內(nèi)廣泛流行。本次檢測結(jié)果表明，BNoV、NeV和BToV存在于該奶牛場中，一方面可能是由于管理人員對新發(fā)病原的了解重視程度低，在奶牛引種過程中未對其檢測；另一方面可能是由于人為因素造成了交叉感染，造成多種腸道病毒協(xié)同作用，引起患病牛群腹瀉病情加重，進(jìn)而對犢牛腹瀉的診斷和控制難度大大增加。因此，在養(yǎng)牛生產(chǎn)中，建議將這些新發(fā)腹瀉病原納入日常檢測范圍。