銀慧慧，童艷梅，曾雪顏，盧光強(qiáng)，趙 武，姜源明，劉 偉

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；3.廣西隆安縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧 532799)

目前，抗生素的不規(guī)范使用以及抗生素殘留和耐藥性問題日趨嚴(yán)重，一些抗生素能夠通過動(dòng)物性食品轉(zhuǎn)移到人體中，對(duì)人類的健康造成了嚴(yán)重威脅[1-2]。研究顯示，從天然植物中分離的多糖具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗糖尿病活性等，與抗生素作用性質(zhì)相同，并且具有無污染、無殘留、無致癌、無致突變和無致畸作用等優(yōu)點(diǎn)，能夠作為一種綠色新型的免疫增強(qiáng)劑，成為近代畜牧養(yǎng)殖道路上新的方向[3-5]。

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.)為桃金娘科桃金娘屬常綠多花小灌木，是一種野生兼?zhèn)涫乘幑δ艿闹参镔Y源，果實(shí)中富含黃酮、多酚、多糖等多種活性成分[6-8]，中國(guó)南方地區(qū)民間常以其入藥，用于急、慢性腸胃炎、痢疾以及提高人體免疫等，也有農(nóng)民在日常飼料中添加桃金娘作為輔食提高家畜和家禽的免疫力。隨著對(duì)多糖的不斷深入研究，桃金娘多糖得到了越來越多的重視[9-10]，而桃金娘多糖提高機(jī)體免疫作用機(jī)制的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究利用免疫抑制小鼠模型對(duì)桃金娘果多糖的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，為桃金娘的保健及藥用資源開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桃金娘果(產(chǎn)地：廣西玉林，經(jīng)廣西獸醫(yī)研究所獸藥新技術(shù)研究開發(fā)中心鑒定為桃金娘果實(shí))；桃金娘果多糖，由廣西壯族自治區(qū)獸藥新技術(shù)開發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室提供，為桃金娘的干果打粉經(jīng)過水浴、醇沉(濃度為80%)、濃縮、過濾、干燥后獲得，多糖的含量為65.8%。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(CTX)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、γ干擾素(IFN-γ)、過氧化物酶(POD)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶(LZM)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)酶生物科技有限公司；生理鹽水購(gòu)自江西御醫(yī)堂實(shí)業(yè)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TECAN Infinite M200酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士帝肯公司；分析天平購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋購(gòu)自江蘇金怡儀器科技有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物和飼料

SPF級(jí)昆明小鼠96只，雌雄各半，體重為(20±2)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。試驗(yàn)期間動(dòng)物房溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，小鼠自由攝食及飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后進(jìn)行正式試驗(yàn)。SPF飼料由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 小鼠分組、造模及給藥 對(duì)昆明小鼠進(jìn)行腹腔注射環(huán)磷酰胺80 μg/g BW，1次/d，連續(xù)3 d，建立小鼠免疫抑制模型[9]。將造模成功的模型小鼠隨機(jī)分為5組(每組16只)：模型組、黃芪多糖組、桃金娘果多糖低、中、高劑量組。 另設(shè)16只健康小鼠為正常組。 黃芪多糖組每只小鼠按200 μg/g BW劑量腹腔注射黃芪多糖混懸液，桃金娘果多糖低、中、高劑量組分別按50、100、200 μg/g BW劑量腹腔注射桃金娘果多糖混懸液，正常組和模型組每只小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水(0.02 mL/g BW)，1次/d，連續(xù)7 d。

1.4.2 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重。眼球采血，分離血清，置于-20 ℃保存待用；頸椎脫臼處死小鼠，取其胸腺、脾臟洗凈、吸干后稱量，并計(jì)算免疫器官指數(shù)：免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/小鼠體重×100%。

1.4.3 小鼠血清細(xì)胞因子含量測(cè)定 于末次給藥后禁食不禁水12 h，對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重。眼球采血，分離血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明檢測(cè)血清中IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、LZM、POD的含量。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 桃金娘果多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表1可知，模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯偏低，均極顯著或顯著低于正常組(P<0.01；P<0.05)，提示模型組小鼠建模成功。與模型組相比，黃芪多糖組脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，但胸腺指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；桃金娘果多糖不同劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有不同程度提高，尤以桃金娘果中劑量組最高(P<0.01)。

表1 各組小鼠免疫器官指數(shù)(n=8)

2.2 桃金娘果多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子的影響

由表2可見，模型組小鼠血清中細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-1β含量極顯著或顯著低于正常組(P<0.01；P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖組小鼠血清IL-6和IL-1β含量極顯著或顯著升高(P<0.01；P<0.05)；桃金娘果多糖不同劑量組血清IL-6、IL-1β含量相較于模型組均極顯著升高(P<0.01)；黃芪多糖組和桃金娘果多糖低、中劑量組的血清IFN-γ、IL-2含量相較于模型組都有所提升，但差異均不顯著(P>0.05)，桃金娘果多糖高劑量組的IFN-γ、IL-2含量極顯著高于模型組(P<0.01)。

表2 各組小鼠細(xì)胞因子水平(n=6)

2.3 桃金娘果多糖對(duì)免疫抑制小鼠血清LZM含量和POD活性的影響

由表3可知，模型組POD活性和LZM含量均顯著低于正常組(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖組POD活性顯著升高(P<0.05)，LZM含量有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。桃金娘果多糖低、中、高劑量組小鼠的POD活性和LZM含量均極顯著或顯著高于模型組(P<0.01；P<0.05)。

表3 各組小鼠POD活性和LZM含量(n=6)

3 討 論

植物多糖具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗菌和抗癌活性等。與傳統(tǒng)藥物相比，生物活性植物多糖的副作用相對(duì)較少，因此受到越來越多的學(xué)者青睞[10-11]。從桃金娘果實(shí)中提取的桃金娘多糖，已被發(fā)現(xiàn)能夠提高免疫功能，具有抗病毒和抗腫瘤等功效[12]。環(huán)磷酰胺是一種常用的治療惡性腫瘤的代表性藥物和免疫抑制劑，高劑量會(huì)引起免疫抑制作用和腸道潰瘍[9]?；谔医鹉镌诿庖呦到y(tǒng)方面的積極作用，本研究通過建立環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型，分別從胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、細(xì)胞因子水平變化等方面探討了桃金娘果多糖的免疫功能作用。

胸腺和脾臟是機(jī)體的重要免疫器官，其重量的變化能夠間接反映機(jī)體免疫水平的變化[13-14]。本研究結(jié)果顯示，桃金娘果多糖不同劑量組均能顯著提高小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，說明桃金娘果多糖對(duì)免疫器官有一定的恢復(fù)和促進(jìn)作用。

IL-1β是一種重要的促炎細(xì)胞因子，參與了機(jī)體中多種自身免疫性炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞活動(dòng)[15]。有研究顯示，黃芪多糖對(duì)大黃魚頭腎巨噬細(xì)胞IL-1β具有調(diào)節(jié)作用[16]。本研究表明，桃金娘果多糖不同劑量組均能極顯著提高小鼠血清中IL-1β水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IL-2又稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在免疫系統(tǒng)的治療中起著核心作用[17]。 有報(bào)道指出人參莖葉多糖和海藻多糖分別對(duì)雞和豬的IL-2分泌有調(diào)節(jié)作用[18-19]。本研究中，桃金娘果多糖高劑量能夠極顯著增高IL-2水平，由此可見，桃金娘果多糖能通過調(diào)節(jié)IL-2水平從而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。IL-6能夠參與T細(xì)胞的早期激活，具有B細(xì)胞分化生物功能[20]。已有的研究表明，黨參多糖可調(diào)節(jié)豬血清中IL-6水平[21]。本研究中免疫抑制小鼠經(jīng)過腹腔注射不同劑量的桃金娘果多糖后，血清IL-6含量極顯著增高，可能是隨著桃金娘果多糖含量的增加，刺激了Th2細(xì)胞分泌增強(qiáng)所致。 IFN-γ是免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，在抗感染的保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草多糖能明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ[23]。本研究結(jié)果顯示，桃金娘果多糖能夠提高免疫抑制小鼠血清IFN-γ水平，說明桃金娘果多糖可調(diào)節(jié)免疫抑制小鼠的免疫功能，提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫。Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生的細(xì)胞因子有IL-2、TNF-β和IFN-γ；而Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13[24]。在正常情況下，機(jī)體中Th1/Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，而當(dāng)機(jī)體發(fā)生功能異常時(shí)，Th1/Th2出現(xiàn)平衡偏移，通過調(diào)節(jié)Th1或Th2細(xì)胞在機(jī)體中的水平，能夠恢復(fù)機(jī)體正常功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，200 μg/g BW劑量的桃金娘果多糖能顯著提高小鼠的血清IL-6、IFN-γ、IL-2、IL-1β含量，提示桃金娘果多糖可能從調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡方面對(duì)機(jī)體的免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。

過氧化物酶POD是一類氧化還原酶，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用[25]。溶菌酶LZM是一種糖苷水解酶，能夠催化破壞某些細(xì)菌細(xì)胞壁[26]。有研究顯示，山藥塊莖多糖和黃芪多糖分別對(duì)POD和LZM具有調(diào)節(jié)作用[27-28]。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的桃金娘果多糖均能夠顯著提高POD活性和LZM含量，改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，不同劑量的桃金娘果多糖對(duì)免疫抑制小鼠的胸腺、脾臟、以及血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-2、LZM含量和POD活性具有恢復(fù)和促進(jìn)作用，其中桃金娘果多糖中劑量即100 μg/g BW對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能恢復(fù)的效果最佳。這一結(jié)果為桃金娘果多糖作為免疫增強(qiáng)劑的深度開發(fā)和應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。