張鑫宇，王亞菲，應(yīng) 茵，王雪山

（棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東棗莊 277160）

樹莓是薔薇科懸鉤子屬的落葉小灌木，傳統(tǒng)中藥名為“覆盆子”，又名“山莓”“托盤”等，果實(shí)營養(yǎng)豐富，可入藥，是一種藥食同源植物。據(jù)記載，樹莓是最先被證明含有鞣花酸的植物之一，并且是抗癌物質(zhì)鞣花酸的最佳來源之一[1]。研究表明，鞣花酸具有良好的抗氧化、抗癌和抑菌消炎等生物活性，還有鎮(zhèn)靜、降壓等作用，具有很高的利用價(jià)值[2]。近年來，樹莓鞣花酸的提取及分離純化工藝發(fā)展迅速，已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

我國野生樹莓資源豐富，適合樹莓生長的地區(qū)廣泛，從樹莓中提取鞣花酸，并深入研究其生物活性具有重要的意義。本文對樹莓鞣花酸的提取、分離和純化方法進(jìn)行了總結(jié)，同時(shí)介紹了鞣花酸的生物活性，以期為樹莓鞣花酸的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供思路。

1 樹莓鞣花酸的結(jié)構(gòu)及提取純化方法

1.1 鞣花酸結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

鞣花酸是一種天然存在的酚類內(nèi)酯化合物，其分子式為C14H6O8，分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示，含有四個(gè)酚羥基、兩個(gè)內(nèi)酯基團(tuán)[3]，顯弱酸性，大部分以縮合形式（包括鞣花苷、鞣花單寧等）存在[4-5]。

圖1 鞣花酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of ellagic acid

純凈的鞣花酸呈現(xiàn)黃色結(jié)晶粉末的形態(tài)，溶解度隨pH 的增加而增加，可溶于堿性水溶液和醇[6]。鞣花酸與不同化合物反應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)不同顏色，如與硫酸反應(yīng)呈黃色，遇三氯化鐵顯現(xiàn)藍(lán)色等[7-8]。

1.2 鞣花酸的提取方法

在目前的研究中，鞣花酸提取方式主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等。

1.2.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法是使用廣泛，也是較早應(yīng)用于鞣花酸提取的一種方法。將原料破碎后，加入有機(jī)溶劑，在一定溫度下，提取一定時(shí)間后進(jìn)行過濾和濃縮，可以得到鞣花酸粗提物[9]。劉卉等[10]以樹莓葉為原材料，考察了影響鞣花酸提取率的關(guān)鍵因素，發(fā)現(xiàn)提取劑濃度的影響最為顯著，然后依次是提取溫度、提取時(shí)間和固液比，最終得出乙醇濃度80%、提取溫度95 ℃、提取時(shí)間60 min、固液比3∶140（g/mL）的組合最為合適，在此條件下鞣花酸的提取量最大，達(dá)到0.432 8 mg/g，這與吳士龍等[11]的研究結(jié)果相似。在常用的四種溶劑（甲醇、乙醇、丙酮、鹽酸）中，李小萍[12]以紅樹莓為原材料，通過對比分析以挑選出最佳提取溶劑，發(fā)現(xiàn)丙酮提取得率最高，經(jīng)過優(yōu)選工藝條件，確定選用80%的丙酮進(jìn)行萃取，在80℃下萃取90 min，最終可得到含量為322 μg/g 的鞣花酸提取物。

1.2.2 微波輔助提取法

微波輔助提取法（MAE）是利用微波破壞細(xì)胞壁加快釋放可提取化合物的一種方法[13]。Theocharis 等[14]研究表明，MAE 的最佳條件取決于待測物質(zhì)的類型及其對微波的吸收程度。Sun 等[15]通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，乙醇產(chǎn)量高、毒性低，是微波輔助提取的最佳培養(yǎng)基。崔珊珊等[16]以乙醇為提取劑，考察各影響因素后發(fā)現(xiàn)，微波功率的影響最為顯著，并得出最優(yōu)條件為采用50%乙醇在60 ℃下提取1.8 min，固液比1∶19（g/mL），微波功率411 W，測得提取量為827.5 μg/g。

1.2.3 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法主要是通過超聲波的機(jī)械振動(dòng)以及空化作用對鞣花酸進(jìn)行提取[17]。王佳慧等[18]研究表明，利用超聲波提取19.72 min，在提取溫度80.02 ℃、固液比1∶14.04（g/mL）的組合下，樹莓鞣花酸的提取量最大，為670.28 μg/g，并且通過分析各因素對鞣花酸提取率的影響，發(fā)現(xiàn)料液比、提取時(shí)間對其影響較為明顯，這與趙慧芳等[19]的發(fā)現(xiàn)相似。此外，Sebojka 等[20]在樹莓鞣花酸的提取實(shí)驗(yàn)中也利用了超聲波來輔助提取，提取量達(dá)到了40.06 mg/100 g。

1.2.4 鞣花酸提取方法的比較

表1（見上頁）分析了上述幾種提取方法，并對它們的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。由表可知，與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，借助超聲波和微波進(jìn)行輔助提取能極大地提高提取效率。

表1 鞣花酸提取方法的比較Table 1 Comparison of extraction methods of ellagic acid

1.3 樹莓鞣花酸的分離純化

鞣花酸粗提物中含有大量的雜質(zhì)，對粗提物進(jìn)一步分離純化才能達(dá)到更高的純度。樹莓鞣花酸純化的方法主要有以下幾種。

1.3.1 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法（HSCCC）早在20 世紀(jì)70 年代由Ito 博士研發(fā)出來，是一種高效、新型的色譜分離方法，因組分在固定相與流動(dòng)相（兩相都是液體）中分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)分離[23]。

溶劑體系的選擇是HSCCC 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Ding 等[24]研究表明，若選用對鞣花酸溶解度較低的兩相溶劑體系，不斷增加樣品量，鞣花酸純度不會(huì)提高。辛秀蘭等[25]在利用HSCCC 分離純化樹莓鞣花酸時(shí)，在體積比為丁醇∶異丙醇∶水=2∶1∶3 的條件下進(jìn)行了兩相溶劑體系的配制，設(shè)置流速為2 mL/min，機(jī)器轉(zhuǎn)速為850 r/min，且選擇了梯度洗脫方式來替換高速液相洗脫，可使鞣花酸純度達(dá)到81.6%。另外，Jikai 等[26]發(fā)現(xiàn)，每隔2.5 h 注射鞣花酸粗品，可以加速分離而快速獲得較高純度的鞣花酸。

1.3.2 大孔樹脂吸附法

大孔樹脂吸附法是一種物理吸附方式，因其對不同組分的吸附及篩選力度不同，進(jìn)而達(dá)到分離提純[27]。李慶等[28]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用乙醇溶液洗脫時(shí)可以在低濃度下將鞣花酸洗脫出來，得到較高純度的鞣花酸。王佳寧[29]也發(fā)現(xiàn)50%乙醇對鞣花酸具有較好的溶解性，而濃度過高或過低都會(huì)溶解出較多雜質(zhì)，不利于鞣花酸的分離。崔珊珊[30]采用X-5 大孔樹脂分離純化紅樹莓中的鞣花酸，得出經(jīng)吸附、水洗、50%乙醇溶液洗脫，回收率達(dá)到了83.56%，純度達(dá)到了50.53%，且對比分析發(fā)現(xiàn)，純化后鞣花酸的粒徑顯著減小，純化后的粉體更加細(xì)膩、均勻。

1.3.3 分離純化方法的比較

目前，關(guān)于樹莓鞣花酸的分離純化方法較少，且存在一些問題。表2 對上述幾種方法進(jìn)行了比較。

表2 分離純化方法的比較Table 2 Comparison of separation and purification methods

2 樹莓鞣花酸的生物活性

2.1 抗氧化及自由基清除作用

鞣花酸是一種天然的抗氧化劑[32]，起抗氧化作用的因素之一是它清除自由基的能力[33]。李小萍等[9]通過還原力測試、抗油脂氧化試驗(yàn)和自由基清除試驗(yàn)，證實(shí)了紅樹莓鞣花酸對·OH 與DPPH 自由基的清除作用非常顯著，并且具有很強(qiáng)的抗油脂氧化能力。Beekwilder 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，樹莓鞣花酸清除·OH 和DPPH 自由基的效率分別達(dá)到74.8%和57.82%。此外，李俊[35]分離得到幾種不同純度的樹莓鞣花酸提取物，對它們進(jìn)行抗氧化能力的比較，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力與鞣花酸含量成正比。崔珊珊等[16]發(fā)現(xiàn)通過不同方法得到的鞣花酸提取物，它們的抗氧化能力存在一定的差異。

2.2 抗炎性及抑菌性

鞣花酸可以抑制潰瘍，保護(hù)傷口避免細(xì)菌的感染，達(dá)到消炎的作用。NF-κB 是炎癥的中心因子[36]，Rosillo 等[37]發(fā)現(xiàn)，鞣花酸能夠抑制NF-κB 活化，抑制炎癥中心因子的表達(dá)。Marin 等[38]研究表明，鞣花酸可以減弱小鼠結(jié)腸炎癥狀，且可以有效治療潰瘍性腸炎。Enrico 等[39]以樹莓為原料，從中提取出鞣花酸，在TNF-α 和IL-1β 刺激的胃細(xì)胞系A(chǔ)GS 上檢測其抗炎活性，結(jié)果表明，樹莓鞣花酸提取物可以抑制NF-κB 核轉(zhuǎn)位，并且能使大鼠潰瘍指數(shù)降低75%，有效降低炎癥反應(yīng)。

鞣花酸對不同種類的細(xì)菌有不同程度的抑制作用。辛秀蘭等[40]發(fā)現(xiàn)，鞣花酸能夠顯著降低大腸桿菌、枯草桿菌等細(xì)菌的活性，而對霉菌、黑曲霉以及酵母菌的抑制效果并不突出。閆莉等[41]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其抑菌作用機(jī)理可能與破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜有關(guān)。Thiem 等[42]的研究也表明鞣花酸在人體內(nèi)具有抗菌活性，并且直接服用鞣花酸對人體無危害。

2.3 抑制腫瘤及抗癌性

樹莓鞣花酸在抑制腫瘤方面有良好的效果，且具有抗突變、抗癌變效應(yīng)。楊洪亮等[43]對鞣花酸抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了研究，提出了其作用機(jī)理可能與抑制DNA 合成、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。崔珊珊[30]通過建立紅樹莓鞣花酸體外抗氧化與肺癌細(xì)胞A549 增殖活性之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，證實(shí)了紅樹莓鞣花酸對A549 的增殖具有明顯的抑制作用。劉暢[44]研究發(fā)現(xiàn)，隨著紅樹莓鞣花酸濃度的增加，肝癌細(xì)胞的存活率會(huì)越來越低。鐘晨[45]證實(shí)鞣花酸對肝癌的抑制作用表現(xiàn)在它使HepG2 的細(xì)胞周期滯停在G0/G1 期，能進(jìn)一步促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的凋亡。

2.4 其他生物活性

除上述幾種生物活性外，樹莓鞣花酸還有很多的生物活性，如Kang 等[46]發(fā)現(xiàn)，樹莓籽粉中的鞣花酸對高糖高脂飲食導(dǎo)致的血脂異常有明顯的改善作用，還可以通過減輕肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而有效降低高糖高脂飲食引起的代謝并發(fā)癥，達(dá)到預(yù)防肥胖的效果。也有研究表明，紅樹莓鞣花酸可以保護(hù)正常細(xì)胞免受某些食品添加劑或化學(xué)物質(zhì)造成的致癌毒素的侵?jǐn)_[47]。一定劑量的鞣花酸能夠減弱順鉑抗癌藥物通過不同機(jī)制引起的腎毒性[48]，還有助于減輕飲酒導(dǎo)致的肝毒性[49-50]。

3 結(jié)論及展望

目前樹莓鞣花酸的提取工藝及分離純化技術(shù)還存在一些不足，有些副產(chǎn)物對環(huán)境造成一定影響。隨著儀器與科技的不斷發(fā)展，未來會(huì)有更多高效且綠色安全的方法被研發(fā)出來。近年來發(fā)展了一些新型技術(shù)，如超聲波-微波協(xié)同提取技術(shù)、膜分離技術(shù)等，但還未應(yīng)用到樹莓鞣花酸的提取及分離中。

鞣花酸具有良好的抗氧化、抗癌及抑菌等生物活性，且隨著研究的深入，鞣花酸的藥用價(jià)值和保健功效更多地被挖掘出來。近年來，國外鞣花酸功能性食品暢銷，而我國鞣花酸相關(guān)產(chǎn)品還很少，具有廣闊的發(fā)展前景。因此應(yīng)不斷優(yōu)化樹莓鞣花酸的提取工藝，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域發(fā)揮其更大的價(jià)值，以期促進(jìn)樹莓產(chǎn)業(yè)長久發(fā)展。