康志欣，劉賽，張春陽，徐常青*，陳秀紅，趙光躍*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.西寧海關(guān)技術(shù)中心 青海省食品安全研究重點實驗室，青海 西寧 810001

枸杞子為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實，具滋補(bǔ)肝腎、益精明目之功效，為我國傳統(tǒng)藥食兩用中藥材，深受國內(nèi)外廣大消費者青睞[1-2]。近年來，寧夏枸杞種植面積不斷增加，出口量也持續(xù)增長，2020 年上半年出口額已達(dá)4981 萬美元，同比增長24.6%[3]。寧夏枸杞種植過程中病蟲害種類多，為害嚴(yán)重，頻繁使用農(nóng)藥使枸杞子農(nóng)藥殘留風(fēng)險較高[4]，這是導(dǎo)致枸杞子出口退貨的最主要原因之一[3]。與此同時，我國枸杞子出口過程中還普遍面臨貿(mào)易壁壘問題，其中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)不合理問題尤為突出[5]。2018 年，歐盟食品農(nóng)藥殘留報告顯示，出口歐盟的有機(jī)枸杞常被檢出尼古丁，而尼古丁為歐盟有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)禁止使用的農(nóng)業(yè)投入品。在未闡明枸杞子中尼古丁來源的情況下，歐盟委員會于2019年10月22 日發(fā)布（EU）2019/1793 條例[6]，對進(jìn)入歐盟市場的枸杞子臨時增加官方控制和緊急管理措施，全面檢測尼古丁（限量值＜0.01 mg·kg-1）[7]。這增加了出口企業(yè)的生產(chǎn)成本，延長了交貨期，使枸杞子出口受到一定程度的影響。獲得歐盟標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)認(rèn)證的枸杞生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢測時，不問緣由，一律不得檢出尼古丁，否則按生產(chǎn)過程中使用禁用物質(zhì)處理，由此對誠信生產(chǎn)的有機(jī)枸杞企業(yè)造成很大困擾，對企業(yè)信譽(yù)造成極大負(fù)面影響。枸杞子中尼古丁來源問題亟待解決。

尼古?。╪icotine）又名煙堿，是一種普遍存在于茄科煙草屬（Nicotiana）植物中的生物堿，茄科茄屬（Solanum）、番茄屬（Lycopersicon）、辣椒屬（Capsicum）等多個屬的植物中也可檢出微量尼古丁[8-9]。對植物而言，尼古丁是響應(yīng)外界刺激、適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的防御性次生代謝產(chǎn)物，光照時間長、晝夜溫差大、蟲害侵染等均會誘導(dǎo)煙草合成、積累尼古丁[10-14]。寧夏枸杞屬于茄科植物，花果同期，病蟲害種類多，主要種植于我國西北干旱地區(qū)，日照時間長、溫差大，具備尼古丁合成的內(nèi)因和外因[4]。目前，業(yè)界對于枸杞子中尼古丁的來源存在2 種猜測：一是內(nèi)源說，即寧夏枸杞作為茄科植物，本身具備合成尼古丁的能力，且生長環(huán)境有利于尼古丁積累；二是外源說，即寧夏枸杞種植過程中所用的有機(jī)肥或生物農(nóng)藥等投入品含有尼古丁，由此造成污染。

為此，本研究首先采集從未使用過投入品的野生寧夏枸杞和荒棄多年的寧夏枸杞根、莖、花、果柄和不同成熟度的葉、果實，檢測尼古丁含量，明確在沒有外源性污染的情況下，寧夏枸杞是否可內(nèi)源合成尼古丁及尼古丁在寧夏枸杞各組織器官、不同成熟度葉片和果實中的分布規(guī)律；其次，采集人工種植的寧夏枸杞成熟果實及其生產(chǎn)過程中所用有機(jī)肥、生物農(nóng)藥等材料進(jìn)行尼古丁檢測篩查，以期調(diào)查、了解寧夏枸杞成熟果實及其生產(chǎn)過程所用投入品中尼古丁情況，分析可能的外源性尼古丁來源，為解析枸杞子中尼古丁來源及殘留變化提供參考。

1 材料

1.1 無外源污染寧夏枸杞

寧夏枸杞樣品于2020 年8 月采集于青海省格爾木枸杞基地、都蘭縣五龍溝野生枸杞林、都蘭縣諾木洪農(nóng)場，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所徐常青研究員鑒定為寧夏枸杞Lycium barbarumL.，采樣時用冰袋保鮮，后期貯存于-80 ℃冰箱，備用。樣品信息見表1。將采集的寧夏枸杞樣品根據(jù)部位仔細(xì)分離，按照成熟度及組織部位分為根、莖、葉（大葉：葉長＞3.50 cm、中葉：2.00 cm ＜葉長≤3.50 cm、小葉：葉長≤2.00 cm）、花、果（青果、中果、紅果）、果柄。

表1 寧夏枸杞樣品信息

1.2 寧夏枸杞成熟果實及寧夏枸杞生產(chǎn)所用投入品

2019 年，收集124 份不同生產(chǎn)組織方式的寧夏枸杞干燥成熟果實樣品，其中來自生產(chǎn)企業(yè)43 份、農(nóng)場8 份、合作社19 份、農(nóng)戶54 份。與此同時，還收集到62份寧夏枸杞生產(chǎn)投入品，包括有機(jī)肥6份、印楝素20 份、除蟲菊素18 份、苦參堿6 份、植物精油4份、石硫合劑2份、農(nóng)用助劑6份。

1.3 儀器

無外源污染寧夏枸杞尼古丁檢測儀器：QTRAP 6500 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）儀（美國AB SCIEX 公司）；MILLI-QA 型超純水機(jī)（德國Merck Millipore 公司）；XSE 205DU 型分析天平（Mettler-Toledo公司）；5427R 型冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；MIX-200 型多管渦旋振蕩器（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；JSP-100 型高速多功能粉碎機(jī)（永康市金穗機(jī)械制造廠）；WGL-230B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

寧夏枸杞成熟果實及寧夏枸杞生產(chǎn)所用投入品尼古丁檢測儀器：QTRAP 5500 型UPLC-MS/MS 儀（美國AB SCIEX 公司）；MILLI-QA 型超純水機(jī)（德國Merck Millipore 公司）；XPE 205 型微量天平（Mettler-Toledo 公司）；SIGMA 3-30K 型高速臺式冷凍型離心機(jī)（德國Merck Sigma公司）；QL-861型旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；NEVAP-45 型氮吹儀（美國Organomation 公司）；DTC-27型超聲波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司）；R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；T-25 型均質(zhì)儀（德國IKA公司）。

1.4 試藥

無外源污染寧夏枸杞尼古丁檢測試藥：乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購于德國Merck 公司；乙酸（色譜純，國藥控股化學(xué)試劑有限公司）；尼古丁對照品（德思特生物技術(shù)有限公司，批號：DST180802-032，純度＞98%）。

寧夏枸杞成熟果實及寧夏枸杞生產(chǎn)所用投入品尼古丁檢測試藥：乙腈（色譜純，美國Merck 公司）；甲酸（色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；乙腈（分析純）、無水乙醇（分析純）均購于西隴科學(xué)股份有限公司；尼古丁對照品（美國Sigma公司，批號：BCBW4394，純度＞98%）。

2 方法

2.1 無外源污染寧夏枸杞尼古丁檢測

2.1.1樣品提取 將分揀后的樣品烘干，打粉過60 目標(biāo)準(zhǔn)篩，再將粉末烘至恒重。?。?0.00 ±2.50）mg 樣品，加入70%甲醇水溶液600 μL；振蕩5 min，靜置1 min，重復(fù)操作2 次；4 ℃冰箱靜置過夜，4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑為10.0 cm），取上清液120 μL上機(jī)。

2.1.2色譜條件 HSS T3 C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm），以0.04%乙酸水溶液（A）-0.04%乙酸乙腈溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～1.5 min，98%A；1.5～6.0 min，98%～5%A；6.0～8.0 min，5%A；8.0～8.1 min，5%～98%A；8.1～11.0 min，98%A）；流速為0.35 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。尼古丁對照品及樣品UPLC圖見圖1。

圖1 尼古丁對照品及無外源污染寧夏枸杞尼古丁UPLC圖

2.1.3質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓5500 V（+），簾氣壓為35 psi（1 psi≈6.895 kPa），離子源氣體1 壓力為5000 kPa，離子源氣體2 壓力為6000 kPa，離子源溫度為550 ℃，入口電壓為10 eV，碰撞室出口電壓為12 eV。MRM 參數(shù)：保留時間為3.25 min，Q1 Mass 為163.124 Da，Q3 Mass 為130.0 Da，去簇電壓為30 eV，碰撞能為30 eV。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線 制備0.2、0.5、2.0、5.0、20.0、50.0、200.0、500.0、2 000.0 ng·mL-19 個不同質(zhì)量濃度的溶液，用于UPLC-MS/MS 分析。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），外標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=85 940.3X+12 607.757 62（r=0.992 53）。

2.2 寧夏枸杞成熟果實及其生產(chǎn)所用投入品尼古丁檢測

參照GB/T 20769—2008 方法[15]，改進(jìn)并建立寧夏枸杞成熟果實及其生產(chǎn)所用投入品尼古丁檢測方法。

2.2.1樣品提取 將固體樣品（有機(jī)肥、石硫合劑等投入品）及冷凍后（-80 ℃放置48 h）的寧夏枸杞成熟果實研磨細(xì)粉，過35 目標(biāo)準(zhǔn)篩，混勻，備用。固體樣品稱取5 g（精確至0.01 g），液體樣品（生物農(nóng)藥、助劑等投入品）量取5 mL（精確至0.01 mL），于50 mL 離心管中，加入無水乙醇15 mL，15 000 r·min-1均質(zhì)提取1 min，超聲提取20 min，5000 r·min-1離心5 min（離心半徑為6.4 cm），取全部上清液于150 mL 雞心瓶中；離心管中重復(fù)加入無水乙醇15 mL，勻漿提取1 min，4200 r·min-1離心5 min（離心半徑為6.4 cm），取全部上清液與之前的提取液合并，提取液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1～2 mL，用氮氣緩慢吹干，準(zhǔn)確加入乙腈5 mL 渦旋混勻，超聲2 min 溶解殘渣，混勻，0.2 μm濾膜濾過。

2.2.2色譜條件 CAPCELL PAK C18IF2 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～1.0 min，10%A；1.0～2.5 min，10%～45%A；2.5～3.0 min，45%～90%A；3.0～4.0 min，90%A；4.0～4.1 min，90%～10%A；4.1～5.0 min，10%A），流速為0.3 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。對照品及樣品尼古丁HPLC圖見圖2。

圖2 尼古丁對照品、寧夏枸杞成熟果實及其生產(chǎn)所用投入品尼古丁HPLC圖

2.2.3質(zhì)譜條件 ESI，噴霧電壓5500 V（+），錐孔氣流速為50 L·min-1，去溶劑氣流速為55 L·min-1，氣簾氣流速為35 L·min-1，輔助氣5500 kPa，離子源溫度600 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)：保留時間為0.65 min，Q1 Mass 為163.2 Da，Q3 Mass 為130.0 Da（定量離子）、117.1 Da，去簇電壓為75 eV，碰撞能為25、28 eV。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線配制0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0 ng·mL-16 個不同質(zhì)量濃度的溶液，用于HPLC-MS/MS分析。以對照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，外標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=13 694.0X+3 065.8（r=0.999 83）。

3 結(jié)果

3.1 寧夏枸杞各組織器官尼古丁分布規(guī)律

寧夏枸杞不同組織器官中尼古丁含量（表2）檢測結(jié)果顯示，34 份樣品中有15 份檢出尼古丁，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于0.030 00 mg·kg-1。寧夏枸杞各組織器官中均有樣品檢出微量尼古丁，除花（0.029 13 mg·kg-1）和莖木質(zhì)部（0.025 05 mg·kg-1）外，其他組織均未超過歐盟進(jìn)口枸杞限量標(biāo)準(zhǔn)，尤其在果實中含量極低，不超過0.003 61 mg·kg-1。

表2 寧夏枸杞不同組織器官中尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·kg-1

3.2 寧夏枸杞不同成熟度葉片、果實尼古丁分布規(guī)律

寧夏枸杞不同成熟度葉片、果實中尼古丁含量（表3）檢測結(jié)果顯示，6 份葉片樣品中均有檢出尼古丁，檢出率100%，12 份寧夏枸杞果實樣品中有2 份檢出尼古丁，檢出率16.7%，且所有檢出樣品中尼古丁含量均低于歐盟進(jìn)口枸杞限量標(biāo)準(zhǔn)。寧夏枸杞幼嫩葉片尼古丁含量相對較高，且寧夏枸杞果實也有近似趨勢，但由于尼古丁含量太低，這種差異并不顯著。

表3 不同成熟度寧夏枸杞葉片、果實中尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·kg-1

3.3 寧夏枸杞成熟果實及其生產(chǎn)所用投入品尼古丁調(diào)查

本研究共檢測了124 份寧夏枸杞成熟果實樣品（表4），其中21份檢出尼古丁，檢出量為0.000 55～0.030 30 mg·kg-1，樣本總檢出率為16.94%。其中農(nóng)戶的樣品檢出最多，檢出率為20.37%，尼古丁最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.027 80 mg·kg-1；合作社樣品的檢出略低于農(nóng)戶，檢出率為26.32%，尼古丁最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.030 30 mg·kg-1；然后依次為農(nóng)場樣品和公司樣品，其尼古丁檢出率分別為12.50% 和9.30%。在21 份檢出尼古丁的枸杞子樣品中，其中有7 份樣品的尼古丁含量超過歐盟進(jìn)口枸杞限量標(biāo)準(zhǔn)，1份來自公司，2份農(nóng)戶，4份合作社。

表4 寧夏枸杞成熟果實中尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)

本研究共檢測62 份寧夏枸杞生產(chǎn)常用有機(jī)肥和生物農(nóng)藥等投入品（表5），所有有機(jī)肥、石硫合劑和農(nóng)用助劑均未檢出尼古丁，但有14份生物農(nóng)藥檢出尼古丁，檢出量為0.000 92～21.900 00 mg·kg-1，檢出率為29.17%。苦參堿全部檢出尼古丁，尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為20.400 00 mg·kg-1，最高為21.900 00 mg·kg-1；除蟲菊素雖可檢出尼古丁，但含量遠(yuǎn)低于苦參堿，尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為0.057 40 mg·g-1，檢出率為44.44%。在14 份檢出尼古丁的投入品中有8 份檢出量超過歐盟進(jìn)口枸杞限量標(biāo)準(zhǔn)，2 份來自同一廠家、同一采集單位的除蟲菊素，6 份來自同一廠家，3 個不同采集單位的苦參堿。

表5 寧夏枸杞生產(chǎn)所用投入品尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)

4 討論

尼古丁是茄科煙草類植物的代表性次生代謝產(chǎn)物[16]。研究發(fā)現(xiàn)，常見茄科蔬菜包括番茄屬、茄屬和辣椒屬植物根、莖、葉、果實中均可檢出尼古丁，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.019 40～16.060 00 mg·kg-1[17-19]。本文研究結(jié)果顯示，在無外源污染情況下，寧夏枸杞的根、莖、葉、花、果中也可檢出尼古丁，但含量極低。尤其是寧夏枸杞的果實，干果尼古丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不超過0.003 61 mg·kg-1，顯示寧夏枸杞也可以內(nèi)源合成尼古丁，但具體合成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。寧夏枸杞葉片和果實中尼古丁含量均呈現(xiàn)隨葉片或果實成熟而降低的趨勢，與Siegmund 等[18]的研究結(jié)果一致。還有研究表明，煙草中尼古丁由根系合成并經(jīng)莖木質(zhì)部運輸至地上部分[20]。本研究發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞莖木質(zhì)部中尼古丁含量高于莖韌皮部，推測寧夏枸杞的尼古丁合成和運輸機(jī)制與同科植物煙草類似。

寧夏枸杞成熟果實及其生產(chǎn)所用投入品抽檢結(jié)果顯示，124 份果實樣品中有7 份樣品尼古丁檢測結(jié)果超過歐盟進(jìn)口枸杞限量標(biāo)準(zhǔn)。溯源結(jié)果顯示，其中4 份合作社樣品在枸杞生產(chǎn)過程中均使用過同一公司生產(chǎn)的苦參堿農(nóng)藥。。該公司生產(chǎn)的苦參堿農(nóng)藥檢測結(jié)果顯示，其中的尼古丁含量非常高。在保證無外源污染的情況下，寧夏枸杞果實中檢出痕量尼古丁，僅荒棄地枸杞幼嫩青果及中度成熟果實中檢出不超過0.003 61 mg·kg-1的尼古丁，這一含量甚至遠(yuǎn)低于一些人類日常大量食用的茄科果蔬，如茄子、辣椒、土豆和西紅柿[9，18]。本文研究結(jié)果顯示，枸杞子作為保健品食用時，其中所含天然尼古丁的攝入量遠(yuǎn)低于日常食用果蔬時的尼古丁攝入量。枸杞子尼古丁檢測超標(biāo)的最主要原因是外源污染所致。

隨著國內(nèi)外消費市場對枸杞子質(zhì)量要求的不斷提高，越來越多枸杞生產(chǎn)者開始種植生產(chǎn)綠色、有機(jī)枸杞，種植過程中會優(yōu)先選用低毒的生物源農(nóng)藥進(jìn)行病蟲害防治。由于生物源農(nóng)藥防治效果不如化學(xué)藥劑，使得個別不法廠商在生物源農(nóng)藥中違法加入其他成分以提高藥效、增加銷量，如本研究中苦參堿農(nóng)藥中檢出高濃度的尼古丁就屬于典型的非法添加隱性成分。因此，枸杞生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立并完善投入品采購的風(fēng)險管控及溯源機(jī)制，生產(chǎn)中選擇正規(guī)廠家的產(chǎn)品并簽訂產(chǎn)品質(zhì)量協(xié)議。同時，枸杞生產(chǎn)還需貫徹生產(chǎn)全程植保的理念，優(yōu)化病蟲害防治方法、改進(jìn)施藥工具并把握防治關(guān)鍵期，預(yù)防為主，防治結(jié)合，以提高生物農(nóng)藥的防治效果。

由于寧夏枸杞可自身合成尼古丁且種植過程具備多種促進(jìn)其合成積累尼古丁的條件，如日照時間長、晝夜溫差大、病蟲害嚴(yán)重、施用氮肥多等[4]，因此枸杞子中檢出痕量的尼古丁是合理的。此前，“牛肝菌頻繁檢出尼古丁事件”也引發(fā)了行業(yè)關(guān)注，證實其可內(nèi)源合成尼古丁后，歐盟最終決定對食用菌尼古丁實施新的限量標(biāo)準(zhǔn)[21-22]。據(jù)此，建議深入研究寧夏枸杞中尼古丁代謝合成機(jī)制、廣泛調(diào)查寧夏枸杞中天然尼古丁含量范圍，以期設(shè)置科學(xué)合理的枸杞子尼古丁限量標(biāo)準(zhǔn)，同時監(jiān)控生物農(nóng)藥質(zhì)量，及時反饋，建議和提醒廣大枸杞種植者合理選擇及使用合規(guī)的生物源農(nóng)藥，促使枸杞產(chǎn)業(yè)向好發(fā)展。