楊貴香 吳瑩瑩 馬雪 劉春花 鄭林 李勇軍 王永林
中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408(2022)04-0408-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.04.05
摘 要 目的 提升毛大丁草藥材的質(zhì)量標準。方法 觀察毛大丁草藥材的性狀并對其粉末進行顯微鑒別;按2020年版《中國藥典》(四部)通則方法測定該藥材中的水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物;采用高效液相色譜法測定該藥材中紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯的含量。結(jié)果 毛大丁草藥材呈皺縮狀,密被灰白色綿毛;須根多數(shù),表面呈灰褐色或灰棕色,質(zhì)脆,易折斷,斷面呈黃白色,中央有一明顯細小木心。其粉末呈棕褐色,鏡下可見非腺毛、石細胞、草酸鈣方晶、導管、纖維等。15批藥材樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物測定值分別為8.63%~11.34%、10.39%~14.93%、3.29%~6.37%、9.03%~15.02%,平均值分別為10.01%、12.26%、4.61%、12.36%。紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯的質(zhì)量濃度分別在3.87~154.88、1.64~65.41、1.60~64.00、1.92~76.96、1.27~50.93、0.40~15.89 μg/mL范圍內(nèi)與各自峰面積成良好的線性關(guān)系(r均不低于0.999 1);精密度、穩(wěn)定性(24 h)、重復性試驗的RSD均小于3%;平均加樣回收率分別為101.88%、100.89%、102.64%、95.75%、96.71%、103.48%,RSD分別為0.55%、0.43%、0.34%、0.49%、0.47%、0.37%(n=6);樣品中上述6種成分的含量分別為0.152 7~0.852 2、0.084 5~0.669 7、0.136 7~0.961 0、0.126 0~1.193 2、0.128 8~1.102 2、0.046 9~0.678 0 mg/g。結(jié)論 所建方法可用于毛大丁草藥材的質(zhì)量控制。初步擬定毛大丁草藥材中水分不得過12.0%,總灰分不得過15.0%,酸不溶性灰分不得過6.0%,醇溶性浸出物不得少于9.0%,木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量不得少于0.016%。
關(guān)鍵詞 毛大丁草;質(zhì)量標準;高效液相色譜法;性狀鑒別;顯微鑒別;木犀草苷;芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷
Improvement of the quality standard of Gerbera piloselloides
YANG Guixiang1,2,WU Yingying1,3,MA Xue1,LIU Chunhua1,ZHENG Lin4,LI Yongjun1,WANG Yonglin4(1. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM/State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China; 2. School of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China; 3. Dept. of Pharmacy, Bijie Medical College, Guizhou Bijie 551700, China; 4. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)
ABSTRACT ?OBJECTIVE To improve the quality standard for Gerbera piloselloides. METHODS The properties of G. piloselloides were observed and microscopic identification was conducted for powder. The moisture, total ash, acid-insoluble ash and ethanol-soluble extract were detected according to the method stated in 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia (part Ⅳ). The contents of nodakenin, luteolin-7-O-β-D-lutinoside, luteoloside, apigenin-7-O-β-D-lutinoside, apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside and marmesin were determined by high performance liquid chromatography method. RESULTS G. piloselloides were shrunken,densely covered with thick white cotton wool, with many fibrous roots; the surface was taupe or gray-brown; its texture was brittle and easy to break; the cross section was yellow-white, and there was an obvious small wooden heart in the center. Its powder was tan, and non-glandular hairs, stone cells, calcium oxalate cubes, ducts,fibers could be seen under microscope. The measured values of moisture, total ash,acid-insoluble ash and alcohol-soluble extract for 15 batches of samples were 8.63%-11.34%, 10.39%-14.93%, 3.29%-6.37% and 9.03%-15.02%, respectively; average values were 10.01%, 12.26%, 4.61%, 12.36%. The linear ranges of nodakenin, luteolin-7-O-β-D-rutinoside, luteoloside, apigenin- 7-O-β-D-lutinoside, apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside and marmesin were 3.87-154.88, 1.64-65.41, 1.60-64.00, 1.92-76.96, 1.27-50.93, 0.40-15.89 μg/mL, respectively (r≥0.999 1). RSDs of precision, stability (24 h) and repeatability tests were all less than 3%. The average recoveries were 101.88%, 100.89%, 102.64%, 95.75%, 96.71% and 103.48%, respectively; RSDs were 0.55%, 0.43%, 0.34%, 0.49%, 0.47% and 0.37%, respectively (n=6); the contents of above 6 components were 0.152 7-0.852 2, 0.084 5-0.669 7, 0.136 7-0.961 0, 0.126 0-1.193 2, 0.128 8-1.102 2, 0.046 9-0.678 0 mg/g. CONCLUSIONS The established method can be used for the quality control of G. piloselloides. It is preliminarily proposed that the moisture in G. piloselloides is not more than 12.0%; the total ash is not more than 15.0%, the acid-insoluble ash is not more than 6.0%, the alcohol-soluble extract is not less than 9.0%; the contents of luteoloside and apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside are not less than 0.016%.
KEYWORDS? ?Gerbera piloselloides; quality standard; high performance liquid chromatography method; property identification; microscopic identification; cynaroside; apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside
毛大丁草,又名小一枝箭、兔耳風、白眉等,為菊科植物毛大丁草Gerbera piloselloides(L.)Cass.的干燥全草[1],主要分布于我國西藏、云南、四川、貴州、廣西等地[2]。該藥材收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》中,為貴州省少數(shù)民族常用藥材[3]。據(jù)文獻報道,該藥材中含有多種生物活性物質(zhì),如糖苷類、黃酮類、香豆素類等,與其鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌活性密切相關(guān)[4-6]。毛大丁草以全草入藥,功效為宣肺止咳、發(fā)汗利水、利氣活血,常用于治療傷風咳嗽、哮喘、水腫、小兒食積等[7]。其飲片為醒脾養(yǎng)兒顆粒的主藥,而醒脾養(yǎng)兒顆粒具有健脾理氣、祛風除濕等作用,常用于治療由脾虛引起的小兒厭食、腹瀉、盜汗、遺尿等相關(guān)病癥[8]。在2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》中,毛大丁草藥材的質(zhì)量控制項目僅有性狀及薄層鑒別,并無含量測定項,不能有效地控制藥材質(zhì)量。近年來,已有學者建立了該藥材中熊果苷、大丁苷和綠原酸類、黃酮類成分的含量測定方法[9-11]。為了更全面地控制該藥材質(zhì)量,本研究對15批毛大丁草藥材進行了性狀和顯微鑒別,并對藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物進行了測定;同時,建立了高效液相色譜法,對該藥材中6種結(jié)構(gòu)明確、含量較高的化學成分(紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-
D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯)進行了含量測定;根據(jù)上述測定結(jié)果設定了限量指標,增補了毛大丁草藥材的定性和定量評價方法,以期為其質(zhì)量標準的提升提供科學依據(jù)。
1 材料
1.1 主要儀器
本研究所用的主要儀器有CX41型顯微鏡(日本Olympus公司)、S60型顯微成像系統(tǒng)(廣州市明美科技有限公司)、Ultimate3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、EL204型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、KQ5200E型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)、GZX-9030MBE型電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)等。
1.2 藥材與主要試劑
15批毛大丁草藥材收集自貴州、云南、四川、安徽、廣西和西藏6個省份(表1),經(jīng)貴州省藥物制劑重點實驗室生藥學教研室劉春花副教授鑒定,均為菊科大丁草屬植物毛大丁草G. piloselloides(L.)Cass.的干燥全草。紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯對照品均為本課題組分離純化而得,采用高效液相色譜法以峰面積歸一化法測定其純度均大于98%;乙腈、甲醇(國藥集團化學試劑有限公司)為色譜純,其余試劑均為分析純,水為超純水。
2 方法與結(jié)果
2.1 性狀鑒別
毛大丁草藥材呈皺縮狀,長15~25 cm,根莖粗短,密被灰白色綿毛。須根多數(shù),長可達12 cm,直徑1~2 mm;表面呈灰褐色或灰棕色,質(zhì)脆,易折斷;斷面呈黃白色,中央有一明顯細小木心。葉基生,皺縮,易破碎;完整葉片展平后呈橢圓形或倒卵形,全緣,長3~10 cm,寬1.5~4 cm,葉面呈褐黑色或淺黃綠色,背面密被灰白色綿毛。頭狀花序單生于花梗頂端,花梗長10~40 cm,中空。氣微,味澀。毛大丁草藥材性狀鑒別圖見圖1。
2.2 顯微鑒別
毛大丁草藥材的粉末呈棕褐色。非腺毛極多,單細胞,表面光滑,大多碎斷呈纖維樣,有的基部膨大,直徑11~27 μm。石細胞呈類長方形或類橢圓形,有的壁厚,孔溝明顯,胞腔較小;有的壁較薄,胞腔大,孔溝不明顯;直徑32~92 μm。草酸鈣方晶散在,直徑7~15 μm。導管多為梯紋或孔紋,也可見螺紋,直徑16~71 μm。纖維成束存在,直徑30~66 μm。毛大丁草藥材粉末顯微鑒別圖見圖2。
2.3 水分、灰分、浸出物檢測
照2020年版《中國藥典》(四部)通則“0832”“2302”“2201”對15批毛大丁草藥材進行水分(第二法)、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物(熱浸法,以95%乙醇作為溶劑)檢測[12],每批樣品平行測定2次。結(jié)果顯示,15批毛大丁草藥材的水分測定值為8.63%~11.34%,平均值為10.01%;總灰分測定值為10.39%~14.93%,平均值為12.26%;酸不溶性灰分測定值為3.29%~6.37%,平均值為4.61%;醇溶性浸出物測定值為9.03%~15.02%,平均值為12.36%。結(jié)果見表2。
2.4 含量測定
2.4.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O- β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯對照品各適量,加甲醇溶解制成上述成分質(zhì)量濃度依次為0.968、1.022、1.000、0.962、1.061、0.993 mg/mL的對照品貯備液,分別精密量取4.0、1.6、1.6、2.0、1.2、0.4 mL,置于同一25 mL量瓶中,用甲醇定容,搖勻,即得上述成分質(zhì)量濃度依次為0.154 9、0.065 4、0.064 0、0.077 0、0.050 9、0.015 9 mg/mL的混合對照品溶液。
2.4.2 供試品溶液的制備 取毛大丁草藥材粉末(過三號篩,下同)約1 g,精密稱定,置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲(功率200 W,頻率40 kHz)0.5 h,放冷,再次稱定質(zhì)量,用70%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,靜置,取上層液置于離心管中,以12 000 r/min離心10 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.4.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以ACE Excel 5 C18-PFP(250 mm×4.6 mm,5 μm)為色譜柱,以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動相進行梯度洗脫(0~5 min,10.0%A→15.0%A;5~15 min,15.0%A→15.5%A;15~32 min,15.5%A→16.5%A;32~50 min,16.5%A);流速為1.0 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測波長為340 nm;進樣量為20 μL。取空白溶劑(70%甲醇)和上述混合對照品溶液、供試品溶液各適量,按本項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結(jié)果顯示,各成分分離度均大于1.5,理論板數(shù)均不低于16 000,空白溶劑對測定無干擾。紫花前胡苷等6種成分系統(tǒng)適用性試驗的高效液相色譜圖見圖3。
2.4.4 線性關(guān)系考察 取“2.4.1”項下混合對照品溶液0.125、0.625、1.25、1.875、2.5、3.75、5 mL,分別置于5 mL量瓶中,加甲醇稀釋并定容,搖勻,各精密吸取20 μL,按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。以待測成分的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標,繪制標準曲線并進行線性回歸,得紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和異紫花前胡內(nèi)酯的回歸方程分別為y=719.03x+0.592 8(r=0.999 6)、y=648.84x+0.022 6(r=0.999 6)、y=613.68x+0.003 9(r=0.999 1)、y=532.41x+0.226 7(r=0.999 5)、y=453.78x+0.106 3(r=0.999 6)、y=1 377.4x+0.134 9(r=0.999 5)。結(jié)果顯示,上述6種成分的質(zhì)量濃度分別在3.87~154.88、1.64~65.41、1.60~64.00、1.92~76.96、1.27~50.93、0.40~15.89 μg/mL范圍內(nèi)與各自峰面積成良好的線性關(guān)系。
2.4.5 精密度試驗 取同一批次供試品溶液(編號M15)適量,按“2.4.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,記錄峰面積。結(jié)果顯示,紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.09%、0.40%、0.45%、0.56%、1.26%、0.29%(n=6),表明該方法精密度良好。
2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批次供試品溶液(編號M15)適量,分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。結(jié)果顯示,紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.80%、0.54%、0.69%、1.85%、1.51%、1.15%(n=6),表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.7 重復性試驗 取同一批次毛大丁草藥材粉末(編號M15)適量,共6份,分別按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并代入標準曲線計算樣品含量。結(jié)果顯示,紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯含量的RSD分別為1.89%、2.45%、1.66%、2.68%、2.50%、1.99%(n=6),表明該方法重復性良好。
2.4.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知樣品含量的毛大丁草藥材粉末(編號M15)約0.5 g,共6份,分別按各成分在藥材中已知含量的100%精密加入各對照品貯備液,按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率,結(jié)果見表3。
2.4.9 樣品含量測定 分別取各批次毛大丁草藥材粉末約1 g,精密稱定,按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并代入標準曲線計算藥材中6種成分的含量。每批樣品平行測定3次,結(jié)果見表4。
2.5 質(zhì)量標準提升建議
基于上述研究結(jié)果,本課題組對2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》所收載的毛大丁草質(zhì)量標準提出以下提升建議:增加顯微鑒別項;增加水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物等檢查項,以平均值上浮約20%[13-14]暫定本品水分不得過12.0%、總灰分不得過15.0%、酸不溶性灰分不得過6.0%,以平均值下浮約20%[13-14]暫定本品醇溶性浸出物不得少于9.0%;增加含量測定項,以本研究中木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量的最低值暫定以干燥品計,本品含木犀草苷(C21H20O11)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(C21H20O10)均不得少于0.016%。
3 討論
3.1 指標成分的選擇
本研究建立的含量測定方法能同時測定毛大丁草藥材中紫花前胡苷、木犀草素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異紫花前胡內(nèi)酯6種化學成分的含量;研究結(jié)果表明,15批藥材中 6種成分除異紫花前胡內(nèi)酯含量相對較低外,其余5種成分含量差別不大。據(jù)文獻報道,黃酮類化合物是毛大丁草藥材中一類重要的化合物,是該藥材發(fā)揮抗癌活性的主要成分[15]。木犀草苷為黃酮類化合物的代表性成分之一,具有較強的抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤等活性,且對人體呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)具有保護作用[16];芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷具有抗菌消炎等活性[17];兩種黃酮類成分的活性與毛大丁草藥材的傳統(tǒng)藥效一致,為該藥材的主要療效成分,故本研究選擇二者作為毛大丁草藥材質(zhì)量標準的含量測定指標。此外,由于本研究旨在提升貴州省地方質(zhì)量標準,故以貴州產(chǎn)毛大丁草藥材中木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷含量的最低值(編號M1)作為限度,即本品含木犀草苷(C21H20O11)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(C21H20O10)均不得少于0.016%。
本研究尚未成功鑒定出毛大丁草藥材高效液相色譜圖中所有共有峰所代表的化學成分,因此,在后期研究中還需利用核磁共振波譜、質(zhì)譜等技術(shù)對各主要成分的結(jié)構(gòu)進行鑒定及解析。
3.2 供試品溶液制備方法的選擇
本研究對供試品溶液的提取方法(超聲、回流)、提取溶劑(水、不同體積分數(shù)的甲醇和乙醇)及提取時間(0.25、0.5、1、1.5 h)等進行了考察,最終確定采用70%甲醇超聲提取0.5 h作為供試品溶液的制備方法。
3.3 高效液相色譜條件的優(yōu)化
本研究采用二極管陣列檢測器對各成分進行了全波長光譜掃描,結(jié)果顯示,各成分在340 nm波長處均有較強吸收,基線較平穩(wěn),分離度較好,且測定不受雜質(zhì)的干擾,故最終選擇340 nm作為檢測波長。本研究考察了4種流動相體系(乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液)對色譜峰峰形的影響,發(fā)現(xiàn)當流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液時,各待測成分色譜峰峰形較為尖銳且對稱,無前延、拖尾等問題,故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。此外,本研究還考察了不同柱溫(30、35、40 ℃)對各待測成分分離度的影響,發(fā)現(xiàn)當柱溫為35 ℃時的分離效果最佳,故選擇35 ℃為柱溫。
3.4 含量測定結(jié)果分析
本研究所收集的樣品產(chǎn)地來源較廣。有研究表明,毛大丁草藥材中的成分含量差異與其產(chǎn)地相關(guān),即與藥材的生長環(huán)境、采收時間及貯藏過程有關(guān)[10-11]。本研究含量測定結(jié)果表明,云南昆明(編號M3)、廣西南寧(編號M4)和西藏拉薩(編號M5)三地產(chǎn)藥材中木犀草苷的含量不符合限度要求,安徽淮南(編號M14)產(chǎn)藥材中芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量不符合限度要求,故不建議選擇上述藥材入藥。
綜上所述,本研究在2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》毛大丁草原質(zhì)量標準基礎上增加了顯微鑒別項,水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物檢查項及藥材中6種成分的含量測定項,同時規(guī)定了藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物及指標成分含量的檢測限度,提升了該藥材的質(zhì)量標準,可為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。
參考文獻
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(收稿日期:2021-07-27 修回日期:2022-01-24)
(編輯:胡曉霖)