王宏國 熊 剛 石海亮

腦動脈瘤(Cerebral Aneurysm, CA)是一種致命的神經(jīng)血管疾病，由多種因素引起，包括慢性炎癥、血流動力學(xué)應(yīng)激和血管壁重塑[1]。內(nèi)皮損傷可由血流動力學(xué)應(yīng)激的變化引起，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子分泌上調(diào)，隨后募集各種炎性細(xì)胞。炎性細(xì)胞被吸引到內(nèi)皮損傷部位，這種募集和隨后的浸潤誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡和動脈壁的重塑，促進動脈瘤的形成和破裂[2,3]。白細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞，滲入血管壁被認(rèn)為是CA形成和破裂的關(guān)鍵步驟；巨噬細(xì)胞已被確定為在CA中協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。近年來，已提出失衡的巨噬細(xì)胞M1/M2極化參與CA的進展[4,5]。在CA形成中促炎M1/M2比率隨時間延長而增加[6]；此外，在破裂的CA中M1細(xì)胞顯著高于M2細(xì)胞，針對巨噬細(xì)胞激活或防止M1/M2失衡的療法可阻止CA的形成和破裂[7]。

Hippo通路在炎癥和腦血管疾病中具有重要作用。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated Protein, YAP)是Hippo信號通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用，尤其是可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡。研究已經(jīng)證實YAP的異常上調(diào)或核定位發(fā)生在許多人類惡性腫瘤中，并促進它們的形成、進展和轉(zhuǎn)移[8,9]。然而，Hippo/YAP通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用和潛在機制仍不明確。據(jù)報道，Hippo信號通路關(guān)鍵蛋白YAP可調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，在炎癥性腸病中，YAP的過度表達(dá)會損害白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-4/IL-13誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化，同時促進脂多糖(LPS)/干擾素-γ(IFN-γ)觸發(fā)的M1巨噬細(xì)胞激活以產(chǎn)生IL-6；敲低其表達(dá)可促進M2巨噬細(xì)胞極化[10]。在機械通氣誘導(dǎo)的肺損傷和肺部炎癥中，巨噬細(xì)胞YAP的表達(dá)上調(diào)，YAP缺乏會增強M2極化，同時抑制M1極化[11]。而Hippo/YAP通路是否參與CA的形成和進展還未可知。因此，本研究旨在探究Hippo/YAP通路在CA形成中的作用及其可能的分子機制，為CA的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK(京)2019-0009。飼養(yǎng)在溫度(20±2)℃、濕度(45-55)%、12h光照/12h黑暗周期的條件下，可自由飲食和攝水。實驗經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，并按實驗動物使用的3R原則進行。

1.2 試劑及儀器

維替泊芬(Verteporfin，YAP抑制劑，可破壞YAP-TEAD相互作用，HY-B0146)購自美國MedChemExpress(MCE)公司；HE染色試劑(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購自碧云天生物科技公司；大鼠IL-6(ml102828)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)(ml002859)、IL-10(ml002813)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)(ml002862)、內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)(ml002890)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1, MCP-1)(ml002960)ELISA檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；小鼠抗大鼠F4/80抗體(sc-377009)購自Santa Cruz Biotechnology；兔抗大鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)(ab178945)、兔抗大鼠精氨酸酶-1(Argininase 1，Arg-1)(ab96183)、山羊抗小鼠Alexa Fluor 594(ab150116)、山羊抗兔Alexa Fluor?488(ab150077)、兔抗大鼠Histone H3(ab1791)均購自英國abcam公司；CelLyticTMNuCLEARTM提取試劑盒(NXTRACT)購自Sigma-Aldrich公司；兔源一抗哺乳動物Ste-20樣激酶(Mammalian Sterile 20-like Kinase, MST)1/2(PA5-36100)、Phospho-MST1/2(p-MST1/2，PA5-104616)、YAP(PA5-17609)、大型腫瘤抑制因子(Large Tumor Suppressor, LATS)1/2(PA5-115498)、Phospho-LATS1/2(p-LATS1/2，PA5-105895)、β-actin(MA5-32479)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)(65-6120)均購自Thermo Fisher Scientific公司。iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)；IX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；EZ4HD高清數(shù)碼解剖顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及分組:大鼠隨機分為對照組(n=10)、模型組(n=30)和YAP抑制劑組(n=10)，模型組根據(jù)樣本采集時間分為A、B、C共3個亞組，每個亞組10只。模型組和YAP抑制劑組大鼠采用結(jié)扎左頸總動脈和雙側(cè)腎動脈聯(lián)合高鹽飲食建立CA模型[12,13]：用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，脫去背部毛發(fā)，經(jīng)背雙側(cè)肋緣下行縱切口，用絲線結(jié)扎雙側(cè)腎動脈后支。7天后，在手術(shù)顯微鏡下用絲線結(jié)扎左頸總動脈，并用1%鹽水替代飲用水，建立大鼠腎性高血壓模型。YAP抑制劑組大鼠每2天腹腔注射100mg/kg的Verteporfin[14]。對照組僅分離左頸總動脈和雙腎動脈，不做結(jié)扎，其余操作同上，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)。使用鼠尾袖套法測定大鼠在清醒狀態(tài)下的血壓值。分別于造模后1周、造模后1個月、造模后3個月三個時間點對A、B、C亞組大鼠進行取材和指標(biāo)檢測，對照組和YAP抑制劑組大鼠于造模后3個月進行取材。

1.3.2 ELISA檢測血清炎性因子水平及血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物水平：大鼠麻醉后，腹主動脈取血3ml，靜置后1 500r/min離心10min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-10和血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物VEGF、ET-1水平。

1.3.3 CA形態(tài)學(xué)評估：取血完成后，通過左心室灌注4%多聚甲醛處死大鼠。然后立即通過左心室灌注溶解在10%(w/v)明膠/PBS溶液中的溴酚藍(lán)。收集大腦，光學(xué)顯微鏡檢查Willis環(huán)是否有血管異常[6]。0級，Willis環(huán)血管正常；1級，血管迂曲、擴張，形態(tài)不規(guī)則，但沒有可識別的動脈瘤；2級，單個囊狀動脈瘤；3級，多個囊狀動脈瘤；4級，破裂的囊狀動脈瘤。

1.3.4 免疫熒光染色檢測動脈瘤組織中巨噬細(xì)胞極化和浸潤：收集有或沒有動脈瘤的大鼠Willis環(huán)，用4%多聚甲醛固定24h后，將樣品轉(zhuǎn)移到18%蔗糖溶液中過夜，然后冷凍在OCT化合物中。用低溫恒溫器將所有樣品切片(30μm)，放在載玻片上，并在室溫下干燥過夜。抗原熱修復(fù)后，0.01M PBS靜置水化20min，漂洗后用10%正常山羊血清封閉1h，小鼠抗大鼠F4/80、兔抗大鼠iNOS、兔抗大鼠Arg-1(按1∶100稀釋)一抗孵育。再使用山羊抗小鼠Alexa Fluor 594、山羊抗兔Alexa Fluor?488二抗(按1∶200稀釋)檢測一抗。DAPI染核，固定。熒光顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞浸潤動脈壁的情況。圖像分析由不知情的觀察者進行。M1巨噬細(xì)胞定義為F4/80+iNOS+，M2巨噬細(xì)胞定義為F4/80+Arg-1+細(xì)胞。

1.3.5 Western blotting檢測動脈瘤血管組織Hippo/YAP通路相關(guān)蛋白表達(dá)：取有或沒有動脈瘤的大鼠Willis環(huán)血管組織，剪碎后，使用RIPA裂解液提取組織中的蛋白質(zhì)(用于檢測MST1/2、p-MST1/2、LATS1/2、p-LATS1/2蛋白表達(dá))，并采用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)(用于檢測YAP蛋白表達(dá))。BCA法測定總蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2h后，對應(yīng)加入一抗(MST1/2、p-MST1/2、LATS1/2、p-LATS1/2、YAP、β-actin、Histone H3，按1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。洗去一抗，加二抗(1∶2 000)室溫下孵育1h，ECL顯色，凝膠成像儀觀察蛋白條帶并拍照。以β-actin或Histone H3為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物VEGF、ET-1水平

各組大鼠血清VEGF、ET-1水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，A、B、C組大鼠血清VEGF和EF-1水平均顯著升高(t均>6.029，P<0.05);與A組相比，B組和C組大鼠血清VEGF、ET-1水平顯著升高(t均>4.761，P<0.05)；與B組相比，C組大鼠血清VEGF、ET-1水平顯著升高(t均>13.607，P<0.05)；與C組相比，YAP抑制劑組大鼠血清VEGF、ET-1水平顯著降低(t=7.167、11.175，P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清VEGF、ET-1水平

2.2 各組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-10水平

各組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-10水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，A、B、C組大鼠血清MCP-1(t=5.634、11.999、14.132，P<0.05)、TNF-α(t=13.229、19.131、25.906，P<0.05)、IL-6(t=14.098、19.736、27.559，P<0.05)水平均顯著升高，IL-10水平(t=6.888、13.125、19.607，P<0.05)顯著降低；與A組相比，B組和C組大鼠血清MCP-1(t=7.119、9.567，P<0.05)、TNF-α(t=7.209、15.184，P<0.05)、IL-6(t=17.781、7.404，P<0.05)水平顯著升高，IL-10水平(t=6.460、12.708，P<0.05)顯著降低；與B組相比，C組大鼠血清MCP-1(t=2.635，P<0.05)、TNF-α(t=8.184，P<0.05)、IL-6(t=11.087，P<0.05)水平均顯著升高，IL-10(t=5.553，P<0.05)水平顯著降低；與C組相比，YAP抑制劑組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IL-6水平均顯著降低，IL-10水平顯著升高(t=2.178、6.427、8.067、5.278，P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-10水平

2.3 各組大鼠CA形態(tài)學(xué)變化

對照組大鼠均無CA形成，A、B、C組大鼠可見動脈瘤形成，且動脈瘤級別依次增加；與C組相比，YAP抑制劑組大鼠動脈瘤形成級別顯著降低。見圖1和表3。

圖1 各組大鼠CA形態(tài)學(xué)變化

表3 各組大鼠CA級別分布情況(%，n均=10)

2.4 各組大鼠CA中巨噬細(xì)胞極化和浸潤情況

對照組大鼠的Willis環(huán)中未發(fā)現(xiàn)F4/80陽性細(xì)胞，無巨噬細(xì)胞浸潤；與對照組相比，A、B、C組大鼠Willis環(huán)中出現(xiàn)大量F4/80陽性細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞比例、M2型巨噬細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05);與A組相比，B組和C組M1型巨噬細(xì)胞比例(t=6.922、14.109，P<0.05)、M1/M2型巨噬細(xì)胞比值(t=12.017、28.185，P<0.05)顯著增加，M2型巨噬細(xì)胞比例(t=5.057、10.110，P<0.05)顯著降低；與B組相比，C組M1型巨噬細(xì)胞比例(t=8.210，P<0.05)、M1/M2型巨噬細(xì)胞比值(t=17.594，P<0.05)顯著增加，M2型巨噬細(xì)胞比例(t=5.413，P<0.05)顯著降低；與C組相比，YAP抑制劑組大鼠Willis環(huán)中M1型巨噬細(xì)胞比例、M1/M2型巨噬細(xì)胞比值顯著降低(P<0.05)，M2型巨噬細(xì)胞比例顯著升高(t=6.590、14.353、3.963，P<0.05)。見圖2和表4。

注：紅色熒光，iNOS+(Arg-1+)；綠色熒光，F(xiàn)4/80+；橙黃色熒光，雙陽性

表4 各組大鼠CA中M1型、M2型巨噬細(xì)胞比例

2.5 各組大鼠動脈瘤血管組織Hippo/YAP通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與對照組相比，A、B、C組大鼠動脈瘤血管組織p-MST1/2/MST1/2比值(t=4.462、8.535、12.738，P<0.05)、p-LATS1/2/LATS1/2比值(t=4.044、8.629、14.118，P<0.05)顯著降低，胞核YAP的表達(dá)顯著增加(t=4.445、7.894、14.033，P<0.05)；與A組相比，B組和C組p-MST1/2/MST1/2比值(t=4.116、8.455，P<0.05)、p-LATS1/2/LATS1/2比值(t=5.433、12.474，P<0.05)顯著降低，胞核YAP的表達(dá)顯著升高(t=3.644、9.312，P<0.05)；與B組相比，C組p-MST1/2/MST1/2比值(t=4.454，P<0.05)、p-LATS1/2/LATS1/2比值(t=7.589，P<0.05)顯著降低，胞核YAP的表達(dá)(t=5.217，P<0.05)顯著升高；與C組相比，YAP抑制劑組大鼠動脈瘤血管組織胞核YAP的表達(dá)顯著降低(t=4.859，P<0.05)，p-MST1/2/MST1/2和p-LATS1/2/LATS1/2比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表5。

圖3 各組大鼠動脈瘤血管組織Hippo/YAP通路相關(guān)蛋白的表達(dá)(Western blotting)

表5 各組大鼠動脈瘤血管組織Hippo/YAP通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

巨噬細(xì)胞通常分為兩個亞群，分別稱為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1型)和交替活化巨噬細(xì)胞(M2型)。靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞可識別LPS、TNF-α、IL-1β等向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，高表達(dá)iNOS、CD11b和促炎細(xì)胞因子，M2巨噬細(xì)胞可以被IL-4、IL-10、TGF-β等誘導(dǎo)分化，高表達(dá)Arg-1、CD206和IL-10等[15]。通常，M1細(xì)胞表現(xiàn)出促炎作用，而M2細(xì)胞促進炎癥消退并促進組織修復(fù)，它們的失衡被認(rèn)為與各種疾病有關(guān)。CA發(fā)展的特征是向M1巨噬細(xì)胞表型的極化增加；源自M1細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子引發(fā)動脈瘤壁的病理變化，尤其是TNF-α和IL-6。TNF-α是CA發(fā)病機制中的一種重要細(xì)胞因子，在未破裂和破裂的CA中升高，在CA形成和破裂中起關(guān)鍵作用；TNF-α抑制劑可有助于預(yù)防CA進展和破裂[16]。IL-6在人CA中表達(dá)，在雌激素缺乏小鼠血清中升高，可通過增強Willis環(huán)處的巨噬細(xì)胞浸潤促進小鼠雌激素缺乏相關(guān)的CA破裂[4]。Nowicki等[6]發(fā)現(xiàn)在小鼠CA形成中M1/M2比率隨時間的增加而逐漸升高，M1巨噬細(xì)胞是CA形成所必需的。血流動力學(xué)的改變、腎性血壓升高與CA的形成關(guān)系密切。在本研究中，我們通過結(jié)扎大鼠左頸總動脈改變其顱內(nèi)局部血流動力學(xué)，結(jié)扎雙側(cè)腎動脈后支以造成腎性高血壓的方法來誘導(dǎo)建立CA大鼠模型。結(jié)果顯示，隨著時間的增加，大鼠顱底Willis環(huán)上可觀察到從血管迂曲到有明顯動脈瘤形成；并且在此過程中，血清TNF-α、IL-6、MCP-1和VEGF、ET-1水平升高，IL-10水平降低；通過免疫熒光雙標(biāo)法檢測了動脈瘤中M1型(F4/80+iNOS+)和M2型(F4/80+Arg-1+)巨噬細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，在CA形成和發(fā)展過程中，M1/M2型巨噬細(xì)胞比值顯著增加，與以上研究結(jié)果一致。MCP-1可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤和粘附在動脈瘤的動脈壁上，促進CA的形成和發(fā)展[17]。以上結(jié)果說明巨噬細(xì)胞極化參與CA的形成和進展。Hippo信號通路最初是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，是一種保守的進化信號通路，參與組織發(fā)育和再生，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡來控制器官大小[18]。近年來，因其在調(diào)節(jié)器官大小方面的顯著作用以及與組織再生和癌癥的明顯相關(guān)性而迅速引起了人們的廣泛關(guān)注。Hippo信號通路由核心激酶級聯(lián)組成，其中上游激酶MST1/2磷酸化下游激酶LATS1/2，進而磷酸化和滅活促增殖轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ(具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子)，抑制YAP入核，通過與轉(zhuǎn)錄增強締合域(TEAD)家族結(jié)合控制基因表達(dá)[19]。在生理上，Hippo通路充當(dāng)腫瘤抑制因子，YAP是一種重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，受到Hippo信號通路的負(fù)調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ在人類癌癥中被過度激活，參與細(xì)胞增殖、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移形成，以及癌癥干細(xì)胞維持和化學(xué)抗性[20,21]；并且內(nèi)皮YAP/TAZ過度激活可誘導(dǎo)過度的絲狀偽足和增生的血管生長，參與病理性血管生成[22]。

最近的研究表明Hippo/YAP信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦腫瘤(包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤)中起著重要作用[23,24]。有研究者對正常成人大腦以及264個腦腫瘤中核YAP的表達(dá)進行檢測發(fā)現(xiàn)，在人腦腫瘤的細(xì)胞核中也很容易檢測到Y(jié)AP蛋白，高水平的YAP表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲性分子亞群以及患者總生存期和無進展生存期相關(guān)[25,26]。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)在頸動脈內(nèi)膜損傷大鼠中，YAP及其許多下游靶基因的表達(dá)增加，可增強血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移；通過激活Hippo信號通路，增強LATs的磷酸化，可抑制YAP入核，抑制血管損傷后的內(nèi)膜增生；Xu等[28]研究也發(fā)現(xiàn)激活Hippo-YAP/TEAD1信號通路可防止氧化LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥反應(yīng)。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的極化受Hippo信號通路關(guān)鍵蛋白YAP的調(diào)控，抑制YAP可以降低巨噬細(xì)胞中iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β水平，減輕LPS刺激的巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[29]。Zhou等[10]發(fā)現(xiàn)YAP的過度表達(dá)會促進LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞激活以產(chǎn)生IL-6，同時會損害IL-4/IL-13誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化，加重炎癥性腸??；Luo等[11]研究也發(fā)現(xiàn)特異性敲除巨噬細(xì)胞中的YAP，會增強M2極化，同時抑制M1極化，減輕機械通氣后的肺損傷。本研究結(jié)果顯示，在CA形成過程中，動脈瘤血管組織磷酸化MST1/2和磷酸化LATS1/2/的表達(dá)顯著降低，胞核YAP的表達(dá)顯著增加，說明Hippo信號通路被抑制；且胞核YAP的表達(dá)變化趨勢與M1/M2型巨噬細(xì)胞比值趨勢相反。使用YAP抑制劑Verteporfin干預(yù)可明顯降低胞核YAP的表達(dá)，并降低M1型巨噬細(xì)胞比例及M1/M2型巨噬細(xì)胞比值，升高M2型巨噬細(xì)胞比例；提示，抑制YAP的活化可抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，同時促進其向M2極化。

綜上所述，Hippo/YAP信號通路可能通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化參與CA的形成和進展。本研究僅從體內(nèi)動物水平上初步探討了Hippo/YAP在CA形成和進展中的作用機制，后續(xù)將考慮進行細(xì)胞實驗，深入驗證此研究結(jié)果。

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