王春曉 楊 銳 仉紅剛 李炳蔚 張秋菊

高血壓病是最常見(jiàn)的慢性病之一[1],部分高血壓患者并無(wú)明顯癥狀,但容易引發(fā)心腦腎等實(shí)質(zhì)性器官的損傷[2-4],如腦卒中、心肌梗死,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。持續(xù)的高血壓會(huì)導(dǎo)致血管的舒縮力下降與血管內(nèi)皮的損傷[3],進(jìn)而導(dǎo)致血管通透性增加及各種免疫粘附分子異常表達(dá),引起慢性血管內(nèi)皮炎癥[4]。當(dāng)損傷超過(guò)了血管內(nèi)皮自我修復(fù)能力時(shí)表現(xiàn)為血管功能受損。由于微血管的修復(fù)能力沒(méi)有大血管的修復(fù)能力強(qiáng),所以微循環(huán)功能障礙往往出現(xiàn)較早，且越來(lái)越得到重視[5]。因此,如何早期發(fā)現(xiàn)微循環(huán)改變是控制高血壓發(fā)病亟待解決的重要問(wèn)題。本文通過(guò)低周齡高血壓模型大鼠耳廓邊緣微循環(huán)檢測(cè)分析，探討早期高血壓微循環(huán)功能和形態(tài)變化特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR組)和正常血壓WKY大鼠(對(duì)照組)各6只,體重180-200g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)，于12h明暗交替、溫度22-25℃、濕度40-60%環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食，2天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑

大鼠血壓測(cè)量?jī)x(Softron BP-2010A，中國(guó))；激光多普勒血流成像儀(LDI)購(gòu)自英國(guó)Moor Instruments公司；高功率針式激光多普勒微循環(huán)檢測(cè)儀(moor VMS-LDF1 )購(gòu)自Moor Instruments公司；激光微循環(huán)形態(tài)和功能分析儀CapiScope CAM1(Capillary Anemometer, KK Research Technology, Devon, 英國(guó))；小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)ASA 1680(ASA，英國(guó))；異氟烷(批號(hào)：045747，北京友誠(chéng)生物科技有限公司)；醫(yī)用氧氣(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

實(shí)驗(yàn)大鼠持續(xù)吸入2%異氟烷與醫(yī)用氧氣的混合氣體，麻醉后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)，耳緣部位去毛后測(cè)量以下指標(biāo)。

1.3.1 血壓：采用Softron BP-2010A大鼠血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量血壓。前一晚大鼠禁食不禁水，第二天白天于22 ℃左右室溫條件下，將大鼠放置血壓儀保溫桶內(nèi)，暴露大鼠尾巴，采用尾套法將測(cè)量?jī)x套至尾巴近端，待保溫箱溫度升溫并穩(wěn)定至38 ℃后，對(duì)大鼠進(jìn)行血壓測(cè)量。每只大鼠至少測(cè)量6次，取平均值。

1.3.2 血流灌注量：采用激光多普勒血流成像儀 LDI掃描大鼠耳廓，定量檢測(cè)大鼠耳廓末梢皮膚單位面積里面的微血管血流灌注情況。

1.3.3 平均血流速度和血細(xì)胞聚集度及小波轉(zhuǎn)換：以高功率針式激光多普勒微循環(huán)檢測(cè)儀moor VMS-LDF1采取單點(diǎn)多時(shí)長(zhǎng)式監(jiān)測(cè)方法定量監(jiān)測(cè)大鼠耳廓斜上方部位的微血管血流速度及血細(xì)胞聚集度，獲取的正弦波式LDF信號(hào)經(jīng)moor VMS-PC Version 3.1分析軟件轉(zhuǎn)換為高斯函數(shù)Morlet小波。得到相應(yīng)指標(biāo)的數(shù)值后，使LDF信號(hào)轉(zhuǎn)換成五個(gè)不同生理來(lái)源的特征頻段。通過(guò)小波轉(zhuǎn)換后可將不同生理來(lái)源的特征頻段轉(zhuǎn)換為橫坐標(biāo)為頻率、縱坐標(biāo)為振幅值的二維和三維圖像。

1.3.4 微血管形態(tài)和功能性微毛細(xì)血管定量分析：將有血流通過(guò)的微毛細(xì)血管定義為功能性微毛細(xì)血管，以激光微循環(huán)形態(tài)和功能分析儀CapiScope CAM1取2個(gè)以上視野檢測(cè)大鼠耳廓皮膚微血管功能動(dòng)態(tài)圖，每個(gè)視野測(cè)量面積為980.4μm×784.3μm。再通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像進(jìn)行分析獲取大鼠耳廓直徑范圍小于100μm的功能性微毛細(xì)血管的總長(zhǎng)度、迂曲度和密度等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠血壓比較

表1顯示SHR組收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓和脈壓差均較對(duì)照組升高(P<0.01)。

表1 兩組大鼠血壓值的比較

2.2 兩組大鼠耳廓觀察和微血流灌注量比較

明場(chǎng)圖片，對(duì)照組大鼠耳廓呈紅色，SHR大鼠耳廓相對(duì)較白(圖1A、1C)，LDI掃描成像對(duì)照組大鼠耳廓血流灌注充盈，而SHR大鼠耳廓呈缺血狀態(tài)(圖1B、1D)。定量分析SHR大鼠血流灌注量明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

注：A、B為對(duì)照組，C、D為SHR組，A和C為明場(chǎng)耳廓照片，B和D為激光掃描血流成像圖1 兩組大鼠耳廓微循環(huán)肉眼觀察和多普勒激光成像掃描圖

2.3 兩組大鼠耳緣微循環(huán)血流速度、血細(xì)胞聚集度比較

經(jīng)過(guò)小波分析得到的不同生理來(lái)源的特征頻段分別為頻率區(qū)間為2.0- 5.0Hz的Band 1心臟活動(dòng)來(lái)源、頻率區(qū)間為0.4-2.0Hz的Band 2呼吸活動(dòng)來(lái)源、頻率區(qū)間為0.15-0.4Hz的Band 3肌源性活動(dòng)來(lái)源、頻率區(qū)間為0.05-0.15Hz的Band 4神經(jīng)活動(dòng)來(lái)源及頻率區(qū)間為0.01-0.05Hz的Band 5內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源。

SHR組大鼠耳緣微循環(huán)平均血流速度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；平均血細(xì)胞聚集度與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，小波分析，不同生理來(lái)源的耳緣末梢血流速度與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)，血細(xì)胞聚集度的Band 1、Band 2較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，而Band 3、Band 4、Band 5與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

注：A、C為對(duì)照組，B、D為SHR組；A、B為血流速度小波分析圖，C、D為血細(xì)胞聚集度小波分析圖圖2 大鼠耳緣微血管血流速度與血細(xì)胞聚集度小波分析3D圖

表2 兩組大鼠平均血流速度、血細(xì)胞聚集度和功能性微毛細(xì)血管指標(biāo)比較

2.4 兩組大鼠耳緣微循環(huán)形態(tài)指標(biāo)比較

結(jié)果顯示，SHR組與對(duì)照組大鼠相比其耳廓有效微血管密度明顯稀疏(P<0.01)，微血管迂曲度也有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

SHR組大鼠不同直徑微血管總長(zhǎng)度均較對(duì)照組減少，尤其直徑30-50μm的微血管總長(zhǎng)度減少顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

注：A為對(duì)照組、B為SHR組實(shí)時(shí)拍攝圖；C為微血管定量分析模式圖(視野尺寸：980.4μm×784.3μm)圖3 大鼠耳緣微血管密度分布分析

2.5 微循環(huán)指標(biāo)和血壓變化的相關(guān)性分析

圖4顯示，耳廓微循環(huán)的血流灌注、平均血流速度(包括Band 3、Band 5)與其血壓指標(biāo)值呈顯著或一定負(fù)相關(guān)，功能性微血管密度、直徑<50μm微血管總長(zhǎng)度及微血管迂曲度與其血壓呈強(qiáng)或較強(qiáng)負(fù)相關(guān)，而Band 1、Band 2和Band 5血細(xì)胞聚集度與其血壓呈強(qiáng)或較強(qiáng)正相關(guān)(P<0.01或P<0.05)。這些微循環(huán)指標(biāo)間亦存在不同程度的相互關(guān)系。

圖4 Pearson相關(guān)分析圖

3 討 論

原發(fā)性高血壓發(fā)病原因復(fù)雜，一直是重要的研究熱點(diǎn)[1,6]。有研究[7, 8]報(bào)道原發(fā)性高血壓患者93%以上存在微循環(huán)障礙，其中近50%存在原發(fā)性微循環(huán)障礙，其他為繼發(fā)性和伴發(fā)性微循環(huán)障礙。雖然高血壓與微循環(huán)障礙的因果關(guān)系尚不明確，但是目前研究支持改善微循環(huán)能夠有效減少高血壓患者靶器官損害[9,10]。

本文結(jié)果顯示高血壓大鼠早期出現(xiàn)顯著的血壓升高外，末梢微循環(huán)血流灌注量、平均血流速度均顯著降低，小波分析顯示心臟活動(dòng)來(lái)源及呼吸活動(dòng)來(lái)源的血細(xì)胞聚集度亦顯著增加，提示該階段已經(jīng)存在外周微小血管的阻力增加。從微循環(huán)形態(tài)和功能檢測(cè)結(jié)果顯示，高血壓早期的末梢微循環(huán)功能性微血管密度顯著降低(P<0.01)，不同直徑功能性微毛細(xì)血管的總長(zhǎng)度均減少，其中直徑30-50μm的顯著減少，均有力地說(shuō)明高血壓早期的末梢微循環(huán)的微毛細(xì)血管的形態(tài)和功能均有明顯改變。

高血壓發(fā)病的早期末梢微循環(huán)形態(tài)和功能變化特征是什么？傳統(tǒng)的激光多普勒血流成像儀和針式檢測(cè)儀都是通過(guò)采集血流信號(hào)來(lái)反應(yīng)微血管血流量和微血流速度以及血細(xì)胞聚集度，但無(wú)法觀察和判斷功能性微毛細(xì)血管的改變。而激光微循環(huán)形態(tài)和功能分析儀可以直觀測(cè)量功能性微毛細(xì)血管的形態(tài)、分布和功能變化，本文采用上述三種方法相互補(bǔ)充，能夠有效地檢測(cè)和分析末梢微循環(huán)形態(tài)和功能。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SHR大鼠微血流灌注、平均血流速度、功能性微血管的密度直徑<50μm微血管總長(zhǎng)度與其收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓和脈壓差的升高之間存在顯著負(fù)相關(guān)，而心源性和呼吸源性血細(xì)胞聚集度與其顯著正相關(guān)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道[11]的8周齡高血壓大鼠存在臟器微循環(huán)障礙，本文結(jié)果進(jìn)一步支持了末梢微循環(huán)功能障礙與早期高血壓發(fā)生發(fā)展的密切相關(guān)。

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