朱瑞芝，王 凱，蔣 薇，楊 繼，司曉喜，劉志華，徐艷群，向能軍，何 沛

云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市五華區(qū)紅錦路367號(hào) 650231

電子煙為將電子煙煙液轉(zhuǎn)化為可吸入氣溶膠的系統(tǒng)［1］，通過氣溶膠向消費(fèi)者遞送一定量的煙堿，從而使消費(fèi)者獲得類似吸煙的感官感受［2-3］。煙堿是電子煙煙液的重要成分，大多數(shù)商業(yè)化的煙堿均由煙草企業(yè)的副產(chǎn)品提取純化而來［4-5］。煙堿分子含有一個(gè)手性中心，有兩個(gè)代謝機(jī)理和生理特性完全不同的異構(gòu)體［6-8］：S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。來源于煙草的煙堿主要以S-(-)-煙堿構(gòu)型存在，且其占煙堿總量的99%以上［9］。但近年來，隨著非煙草煙堿（Tobacco free nicotine,TFN）在電子煙等新型煙草制品中的應(yīng)用，煙堿異構(gòu)體越來越受到人們的關(guān)注［10］。文獻(xiàn)［11］報(bào)道對(duì)電子煙煙液中煙堿的手性分離分析方法主要有手性色譜柱-正相液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器分析法。正相色譜體系受試劑和環(huán)境中水分影響較大，會(huì)導(dǎo)致色譜峰保留時(shí)間不穩(wěn)定；同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)室常用反相液相色譜法，在儀器使用過程中反相色譜和正相色譜之間溶劑體系切換所需時(shí)間長(zhǎng)，而且對(duì)儀器穩(wěn)定性影響較大，不利于實(shí)驗(yàn)室多種方法的使用和儀器維護(hù)。基于此，本研究中開發(fā)了手性色譜柱-反相液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器分析法，對(duì)電子煙煙液樣品中的煙堿異構(gòu)體進(jìn)行分離分析，同時(shí)對(duì)2種煙堿異構(gòu)體及消旋體煙堿的感官差異進(jìn)行研究，旨在為電子煙的研發(fā)和管理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

20種不同煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的電子煙煙液樣品（市售）。

甲醇、乙腈（HPLC級(jí)，德國Merck公司）；三乙胺、甲酸銨（AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司）;乙酸（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨、二乙胺（AR，廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司）；(R，S)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品、S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（＞99%，加拿大TRC公司）。

可填充式電子煙（功率7~10 W，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供）；Agilent1290液相色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q-Intergral 5超純水儀（美國Millipore公司）；SHZ-88水浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；BT125D電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius科學(xué)儀器有限公司)；KQ-700DB數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；有機(jī)相濾膜（0.22μm，上海楚定分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理及分析

準(zhǔn)確稱取0.2 g電子煙煙液樣品，精確至0.000 1 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇溶液，密閉，放入超聲波水浴中，于常溫下超聲萃取20 min，過濾后進(jìn)行液相色譜分析。儀器條件：

檢測(cè)波長(zhǎng)：259 nm；柱溫箱：25℃；進(jìn)樣量：3 μL；色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T柱（150 mm×4.6 mm，2.7μm）；流動(dòng)相：V甲醇∶V乙腈=45∶55（甲醇為混合液：V甲醇∶V乙酸∶V三乙胺=100∶0.25∶0.05）；流速：1 mL/min，等度洗脫。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

采用Origin柱狀圖分析萃取溶劑體積對(duì)電子煙煙液中2種煙堿異構(gòu)體提取效果的影響；采用Agilent OpenLAB數(shù)據(jù)分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，獲取回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性色譜柱的選擇

為了實(shí)現(xiàn)2種煙堿異構(gòu)體在反相體系中的手性分離，考察了不同色譜柱及分離模式對(duì)煙堿異構(gòu)體的分離效果，選擇與反相色譜流動(dòng)相匹配的手性柱及其色譜條件，并優(yōu)化了流動(dòng)相的比例、添加劑的種類及濃度?？疾斓氖中陨V柱包括Agilent公司的Chiral-T、Chiral-CD柱以及DAICEL公司的IA-3、IC-3柱共4種，在反相色譜模式（Reverse Phase Chromatography，RP）及優(yōu)化的色譜條件下，發(fā)現(xiàn)Agilent Chiral-T柱對(duì)2種煙堿異構(gòu)體的分離度較好（圖1）。因此，本實(shí)驗(yàn)中采用Agilent Chiral-T柱進(jìn)行后續(xù)的煙堿異構(gòu)體分離。

圖1 不同手性柱對(duì)煙堿異構(gòu)體的分離效果Fig.1 Separation of nicotine isomers by different chiral columns

2.2 流動(dòng)相添加劑的優(yōu)化

由于煙堿是二元弱堿，在水溶液中以游離態(tài)、單質(zhì)子態(tài)和雙質(zhì)子態(tài)等多種形態(tài)存在，用流動(dòng)相洗脫時(shí)容易出現(xiàn)煙堿峰拖尾的現(xiàn)象［12］。在本研究中，考察了流動(dòng)相的酸堿比例對(duì)分離效果的影響。添加劑分別選用乙酸、甲酸、二乙胺、三乙胺和乙酸銨，發(fā)現(xiàn)三乙胺的分離效果最好，乙酸次之，二乙胺和乙酸銨均表現(xiàn)較差。采用乙酸-三乙胺的緩沖體系可穩(wěn)定流動(dòng)相的pH，從而使煙堿以合適的狀態(tài)存在，有利于色譜峰分離。在流動(dòng)相中添加一定比例的乙酸和三乙胺，具有重現(xiàn)性好以及準(zhǔn)確度和靈敏度高的特點(diǎn)，達(dá)到了改善峰寬和減少色譜峰拖尾的效果，2種煙堿異構(gòu)體的分離度達(dá)到1.9以上，如圖2所示。采用優(yōu)化的方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分離分析，色譜圖見圖3?？芍?，實(shí)際樣品中2種煙堿異構(gòu)體的分離度良好，滿足實(shí)驗(yàn)需求。

圖2 外消旋煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard solution for racemic nicotine

圖3 典型電子煙煙液樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of a typical e-liquid sample

2.3 萃取溶劑的選擇

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)電子煙煙液中煙堿的萃取溶劑主要是甲醇和異丙醇［11,13-14］，考慮到文獻(xiàn)報(bào)道方法與本方法在儀器方法和溶劑體系上均存在差異，因此比較了甲醇和異丙醇作為萃取劑在本方法中的適用性，結(jié)果如圖4所示。可見，以甲醇為萃取溶液，溶劑本底低，峰形好，峰面積稍大于異丙醇。由于本方法中采用甲醇為洗脫相，綜合考慮后，選擇甲醇為萃取溶劑。

圖4 不同溶劑對(duì)電子煙煙液中2種煙堿異構(gòu)體萃取效果的影響Fig.4 Effects of different solvents on extraction efficiencies of two nicotine isomers in e-liquids

2.4 萃取體積的選擇

在固定稱樣量的情況下，考察了不同萃取劑體積對(duì)電子煙煙液中2種煙堿旋光異構(gòu)體萃取效果的影響，結(jié)果如圖5所示?？芍?，分別采用10、15、20、25、30 mL甲醇萃取電子煙煙液中的2種煙堿異構(gòu)體，當(dāng)萃取溶液為20 mL時(shí)所測(cè)得的2種煙堿異構(gòu)體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到最大值。因此，采用20 mL甲醇進(jìn)行電子煙煙液中2種煙堿異構(gòu)體的萃取。

圖5 萃取溶劑體積對(duì)電子煙煙液中2種煙堿異構(gòu)體萃取效果的影響Fig.5 Effects of extraction volume on extraction efficiencies of two nicotine isomers in e-liquids

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢測(cè)限

根據(jù)目標(biāo)物的檢測(cè)濃度和靈敏性，對(duì)配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測(cè)，以分析物的濃度為橫坐標(biāo)，S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，獲取回歸方程和相關(guān)系數(shù)，決定系數(shù)(R2)應(yīng)不小于0.99。對(duì)每個(gè)物質(zhì)的最低濃度對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定10次，分別以所得測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍和10倍為方法的檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，相關(guān)結(jié)果如表1所示?？芍?，S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿分別在25~500、0.25~10.00μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，R2分別為0.999 6和0.999 4；2種煙堿異構(gòu)體的檢出限均為0.008 mg/g，定量限均為0.027 mg/g。

表1 方法的線性范圍、回歸方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限Tab.1 Linear concentration ranges,regression equations,linear correlation coefficients(R2),LODs and LOQs of the method

2.6 精密度和回收率

選取已知濃度的電子煙煙液樣品，考察方法的精密度和回收率。對(duì)樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行測(cè)定，考察方法的精密度。結(jié)果（表2）表明，本方法S-(-)-煙堿的日內(nèi)、日間RSD分別為0.89%、1.26%，R-(+)-煙堿的日內(nèi)、日間RSD分別為3.98%、4.70%。按高、中、低3個(gè)加標(biāo)水平對(duì)已知濃度的電子煙煙液樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3?？芍?，S-(-)-煙堿的回收率在95.87%~104.22%之間，R-(+)-煙堿的回收率在102.43%~108.85%之間?？梢?，本方法的精密度好，回收率高，表明方法穩(wěn)定可靠，可用于電子煙煙液中煙堿異構(gòu)體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。

表2 方法的日內(nèi)及日間精密度Tab.2 Intra-and inter-day precisions of the method （mg·g-1）

表3 方法的加標(biāo)回收率Tab.3 Spiked recoveries of the method （%）

2.7 樣品分析

對(duì)市售20種不同口味、不同煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的電子煙煙液樣品中煙堿異構(gòu)體的分析結(jié)果見表4?？芍娮訜煙熞褐袩焿A主要為S-(-)-煙堿，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在2.325～22.042 mg/g之間，而R-(+)-煙堿的量極少，在0.030～0.273 mg/g之間；S-(-)-煙堿的光學(xué)純度在96.74%~100.00%之間。在收集的20種電子煙煙液中，未發(fā)現(xiàn)外消旋煙堿的使用，可見由于國內(nèi)對(duì)煙堿來源的管控，國內(nèi)市場(chǎng)上所銷售的電子煙煙液中的煙堿，主要來源于煙草提取物。本研究結(jié)果也可為電子煙煙液中煙堿來源的管控提供一種便捷的方法。

表4 電子煙煙液樣品測(cè)試結(jié)果Tab.4 Test results of the e-liquid samples

2.8 煙堿異構(gòu)體感官評(píng)價(jià)結(jié)果

據(jù) 報(bào) 道［15］，非 煙 草 煙 堿（TFN），由Next Generations實(shí)驗(yàn)室合成，Pharmanic公司注冊(cè)商標(biāo)，并在幾家公司的電子煙煙液產(chǎn)品中得到應(yīng)用。因此煙堿異構(gòu)體在新型煙草制品中的可用性受到關(guān)注［10］。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)含不同濃度梯度的S-(-)-煙堿、R-(+)-煙堿以及(R，S)-煙堿的電子煙煙液感官差異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以V甘油∶V丙二醇=1∶1為基液，分別將不同煙堿異構(gòu)體樣品配制成不同濃度的溶液，注入電子煙儲(chǔ)液器中進(jìn)行感官評(píng)吸，評(píng)吸結(jié)果見表5。結(jié)果表明：S-(-)-煙堿、R-(+)-煙堿2種異構(gòu)體及(R，S)-煙堿消旋體，在勁頭、滿足感、刺激性3項(xiàng)指標(biāo)上的趨勢(shì)一致，均為S-(-)-煙堿＞(R，S)-煙堿＞R-(+)-煙堿，即S-(-)-煙堿的勁頭最高，滿足感最強(qiáng)，刺激性最大。

表5 煙堿異構(gòu)體的感官評(píng)吸得分結(jié)果Tab.5 Scores of sensory evaluation of nicotine isomers

3 結(jié)論

①建立了穩(wěn)定便捷的手性色譜柱-反相液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器分離分析電子煙煙液中的S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿異構(gòu)體的方法；②對(duì)20種市售電子煙煙液樣品中煙堿異構(gòu)體的分析結(jié)果表明，電子煙煙液中煙堿主要為S-(-)-煙堿，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在2.325～22.042 mg/g之間，S-(-)-煙堿的光學(xué)純度在96.74%~100.00%之間，未發(fā)現(xiàn)外消旋煙堿的使用；③對(duì)煙堿異構(gòu)體感官差異性評(píng)價(jià)結(jié)果表明：S-(-)-煙堿的勁頭最高，滿足感最強(qiáng)，刺激性也最大；R-(+)-煙堿的勁頭最小，滿足感最低，刺激性也最??；(R，S)-煙堿的勁頭、滿足感和刺激性均介于S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿之間。