曾媛玲，吳文濤，周紹芳，閆曦蕊，陳榮春，王雪蘭，王揚(yáng)

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

根結(jié)線蟲寄主范圍廣泛，對(duì)蔬菜，薯類，豆類，棉麻類，香料和咖啡等作物都構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［1］。根結(jié)線蟲種類超過(guò)90種，種間致病性差異顯著，在生產(chǎn)上引起的危害程度也有所差異，不同地區(qū)間的優(yōu)勢(shì)種群也有所不同［2-3］。目前我國(guó)記載中值得關(guān)注的根結(jié)線蟲種類—象耳豆根結(jié)線蟲（Meloido?gyne enterolobii）具有致病力強(qiáng)、寄主范圍廣、并且能克服線蟲抗性基因的特性［4］，逐漸變?yōu)闊釒Ш蛠啛釒У貐^(qū)最重要的根結(jié)線蟲之一［5］。目前，象耳豆根結(jié)線蟲在亞洲、非洲、歐洲和美洲皆有分布［6］，僅象耳豆根結(jié)線蟲就可導(dǎo)致蔬菜高達(dá)65%的損失，高于迄今為止研究的任何其它根結(jié)線蟲［7-8］。

象耳豆根結(jié)線蟲的生活史與其它種類的根結(jié)線蟲相似［9］，屬于土壤習(xí)居性植物寄生線蟲，生活周期可能因環(huán)境條件的不同而不同，大概是3~6周。土壤中的卵在適宜的環(huán)境條件下孵化成二齡幼蟲（J2）在土壤中移動(dòng)［10］。在土壤中的J2通過(guò)頭部化感器可以感受到土壤中寄主根部分泌出的化學(xué)物質(zhì)，向寄主植物根部趨向性移動(dòng)，并從根尖部位侵入根組織，經(jīng)過(guò)平行于根體軸的方向移動(dòng)后，最終到達(dá)中柱鞘開始寄生。在寄生啟始階段，線蟲將口針刺入中柱鞘分生細(xì)胞注入其食道腺分泌物，這些分泌物不僅誘導(dǎo)線蟲頭部周圍的細(xì)胞膨大形成為其終生提供營(yíng)養(yǎng)的取食位點(diǎn)—巨型細(xì)胞（Giant Cells，GC），并且還會(huì)使線蟲周圍的寄主細(xì)胞分裂加快，導(dǎo)致細(xì)胞壁的分解、細(xì)胞核的擴(kuò)大以及細(xì)胞質(zhì)組成的變化，從而使線蟲侵染部分的根組織膨大，形成明顯的根結(jié)［10-11］。研究表明，根結(jié)線蟲食道腺細(xì)胞分泌物是決定其寄生性和致病性的關(guān)鍵因素，而其中的分泌蛋白則是作用主體成分［12］。隨著根結(jié)線蟲致病性研究的深入，研究者開始接受效應(yīng)子（Effectors）的概念，Hogenhout等［13］將效應(yīng)子定義為“植物病原物分泌的可以改變寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)或小分子物質(zhì)”。線蟲分泌的效應(yīng)子可以促進(jìn)取食位點(diǎn)的建立和幫助線蟲在植物組織中遷移。植物線蟲的頭感器、表皮、排泄系統(tǒng)和食道腺都能產(chǎn)生效應(yīng)子，其中食道腺是植物寄生線蟲主要的合成效應(yīng)子的組織，食道腺細(xì)胞由2個(gè)亞腹食道腺細(xì)胞和1個(gè)背食道腺細(xì)胞組成［14］。有研究認(rèn)為食道腺細(xì)胞的活性在不同發(fā)育階段有一定差異，例如亞腹食道腺在線蟲早期侵染過(guò)程中活性最高，分泌與根的侵入、線蟲遷移相關(guān)基因；而背食道腺在線蟲寄生階段的活性更高，分泌與取食位點(diǎn)形成和維持相關(guān)的基因［15］。根據(jù)目前已有研究可以初步判斷，根結(jié)線蟲分泌效應(yīng)子具有降解或修飾細(xì)胞壁、參與調(diào)控寄主細(xì)胞代謝和信號(hào)途徑和對(duì)抗或抑制寄主防衛(wèi)反應(yīng)等方面的功能［9］。

番茄是受根結(jié)線蟲病危害最嚴(yán)重的作物之一，利用抗性品種是防控番茄根結(jié)線蟲病最環(huán)保和經(jīng)濟(jì)的方法［15］，但目前番茄上可供應(yīng)用的抗線蟲品種匱乏。Mi基因家族作為番茄上目前已報(bào)道發(fā)現(xiàn)的唯一抗線蟲來(lái)源，其中來(lái)源于秘魯番茄（Solanum peruvianum）的Mi?1基因已通過(guò)胚胎拯救的方法轉(zhuǎn)入栽培番茄，該基因可介導(dǎo)對(duì)南方根結(jié)線蟲（M. incognita）、花生根結(jié)線蟲（M. arenar?ia）、爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）等常見根結(jié)線蟲的抗性，目前生產(chǎn)中使用的抗根結(jié)線蟲番茄品種均來(lái)源于此，相關(guān)研究表明象耳豆根結(jié)線蟲能夠克服Mi?1基因的抗性［16］，這不僅增加了番茄根結(jié)線蟲病的防治難度，也使Mi基因的應(yīng)用前景受到挑戰(zhàn)。本團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)Mi?1純合基因型番茄品種VFNT在接種象耳豆根結(jié)線蟲出現(xiàn)親和性反應(yīng)，而接種南方根結(jié)線蟲則產(chǎn)生的非親和性反應(yīng)，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)接種線蟲后2~6 d是親和性與非親和反應(yīng)分化的關(guān)鍵階段［17］。可以推測(cè)象耳豆根結(jié)線蟲侵染后的2~6 d是其克服Mi?1基因抗性相關(guān)效應(yīng)子基因增強(qiáng)表達(dá)階段。鑒于此，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較分析象耳豆根結(jié)線蟲侵染番茄根系2~6 d關(guān)鍵時(shí)期基因表達(dá)情況，篩選差異表達(dá)基因并利用生物信息學(xué)軟件篩選出其中具有信號(hào)肽且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的象耳豆根結(jié)線蟲候選效應(yīng)子，旨在為解析象耳豆根結(jié)線蟲的致病機(jī)理以及靶向防治根結(jié)線蟲病害提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料及線蟲的處理

供試番茄材料為Mi?1純合基因型栽培品種VFNT（Lycopersicon esculentum）［18］，由 云 南 農(nóng) 業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。供試線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii），由本實(shí)驗(yàn)室采集純化，活體保存于易感番茄（Rutgers）根系的種群。參照Abdel-Momen［19］的 方 法 進(jìn) 行 植 物 培育與線蟲接種。主要步驟簡(jiǎn)述如下：將番茄種子用次氯酸鈉消毒洗凈后放置于墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)置于28 ℃度溫箱催芽。2~5 d后將露白的種子移栽到育苗盤于日光溫室內(nèi)進(jìn)行育苗，待幼苗出芽長(zhǎng)至3~4片真葉換大的滅菌花盆進(jìn)行移栽培育，育苗基質(zhì)為腐殖土∶壤土∶石英砂（3∶1∶1）比例混合，使用前高溫滅菌（121 ℃，60 min），保證無(wú)其它微生物和線蟲。番茄苗長(zhǎng)出4~5片真葉時(shí)便可用于接種根結(jié)線蟲。

次氯酸鈉分散法［20］分離從用于擴(kuò)繁的番茄根系上的根結(jié)線蟲卵，置于25 ℃度溫孵化，過(guò)篩收集二齡幼蟲，經(jīng)定量后以每盆植株的接種1000條蟲的蟲量定量接種番茄，按常規(guī)方法進(jìn)行水肥管理。

1.2 總RNA的提取與數(shù)據(jù)組裝

測(cè)序樣品分別在番茄接種象耳豆根結(jié)線蟲的2 dpi（days post-inoculation，dpi）、6 dpi取樣，每處理3次生物學(xué)重復(fù)取樣，選用全式金公司（北京）的試劑TransZol Up提取根系組織總RNA。提取的RNA需進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，用質(zhì)檢合格的RNA樣品用于mRNA文庫(kù)制備。樣品交由武漢康測(cè)科技有限公司采用基于UID建庫(kù)并基于Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建的Illumina PE文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。使用Trimmomatic軟件對(duì)raw data進(jìn)行Clean，去掉接頭、低質(zhì)量的reads后，需要對(duì)clean reads進(jìn)行新一輪質(zhì)控，得到clean reads的數(shù)據(jù)信息，然后再將對(duì)比去除來(lái)自番茄植株reads（Accession：PRJ?NA119，2018），用去除后的clean data與象耳豆根結(jié)線蟲基因組（Accession：PRJEB36431，2020）進(jìn)行序列比對(duì)，獲得全面的轉(zhuǎn)錄本信息以及相應(yīng)的基因信息。

1.3 基因表達(dá)定量和差異表達(dá)分析

針對(duì)基因組注釋的蛋白編碼基因的mRNA的出現(xiàn)次數(shù)（用count表示）進(jìn)行分析，對(duì)基因比對(duì)結(jié)果在不同區(qū)域富集到的片段數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、并以此評(píng)估組內(nèi)及組間樣品基因表達(dá)特征的相關(guān)性，通過(guò)edgeR軟件分析基因在各樣本中的差異表達(dá)情況，以以log2FC的絕對(duì)值>1且FDR<0.05作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)篩選到的差異基因進(jìn)行GO功能注釋以及KEGG富集分析。

1.4 利用生物信息學(xué)軟件對(duì)差異基因進(jìn)行致病相關(guān)基因的篩選與分析

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組比較分析，篩選出象耳豆根結(jié)線蟲特異性上調(diào)的差異基因，并通過(guò)signalP5.0預(yù)測(cè)具有信號(hào)肽的基因，隨后利用TMHMM2.0在線軟件預(yù)測(cè)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的差異基因，篩選出具有信號(hào)肽且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的候選效應(yīng)子，再利用In?terpro及NCBI在線網(wǎng)站對(duì)篩選出的基因進(jìn)行特殊結(jié)構(gòu)域分析及序列比對(duì)分析，最后通過(guò)String在線軟件預(yù)測(cè)候選基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 qPCR驗(yàn)證

利用CTAB方法提取植株2 dpi和6 dpi根部總RNA，利用iScript? gDNA Clear cDNA Synthe?sis Kit（Biorad）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用SYBR Premix EX Taq（Taka?ra）試劑盒進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)，檢測(cè)儀器為Quant?Studio 6 Flex（ABI）熒光定量PCR儀，選用primer5軟件對(duì)從預(yù)測(cè)的效應(yīng)子中選取的5個(gè)基因及內(nèi)參基因Me-actin進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），檢測(cè)所選基因在象耳豆根結(jié)線蟲侵染番茄植株2 dpi、6 dpi的表達(dá)量，以驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

通過(guò)質(zhì)檢發(fā)現(xiàn)樣品RNA量都大于1 μg；樣品OD260/280值大于1.8，說(shuō)明樣品無(wú)污染，電泳結(jié)果顯示樣品RNA條帶清晰、沒有拖帶，說(shuō)明RNA完整性很好，符合建庫(kù)要求。對(duì)6個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)（表2），有效數(shù)據(jù)占原始數(shù)據(jù)的90%以上，為后期轉(zhuǎn)錄組拼接提供了良好條件，除此外堿基質(zhì)量達(dá)到Q20、Q30的百分比均高于98%，質(zhì)控后Cleandate的GC值含量均高于45%。此外樣本的主成分分析發(fā)現(xiàn)（圖1），同一處理的不同樣本之間空間分布差異小，表明具有較好的重復(fù)性，2 dpi與6 dpi兩個(gè)處理之間樣本相互分離表明其基因表達(dá)相差大，有較好的特異性。綜合以上數(shù)據(jù)說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高，可用于深入分析。

圖1 樣品基因表達(dá)水平的主成分分析（PCA）的聚類圖Fig.1 Cluster diagram of principal component analysis （PCA） of gene expression levels of samples

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of transcriptome sequencing results

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

差異表達(dá)基因是指樣品間或者同一樣品經(jīng)過(guò)不同處理后，上調(diào)表達(dá)的基因和下調(diào)表達(dá)基因的匯總。通常從差異倍數(shù)和顯著水平2方面進(jìn)行評(píng)估，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，通過(guò)比較2 dpi（為象耳豆根結(jié)線蟲侵染2 d后的樣品）與6 dpi（為象耳豆根結(jié)線蟲侵染6 d后的樣品）之間的基因表達(dá)水平，通過(guò)鑒定共得到了967個(gè)差異表達(dá)基因（圖2）。其中有647個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，320個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，這些差異基因可能在線蟲寄生過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

圖2 差異基因表達(dá)火山圖Fig.2 Volcano of differentially expressed genes

2.3 差異表達(dá)基因GO注釋分析

對(duì)差異表達(dá)的967個(gè)差異基因進(jìn)行GO功能注釋，共注釋到656個(gè)差異表達(dá)基因，共劃分為162個(gè)功能組，這些功能組都分布在3個(gè)主要類別中，且注釋到的上調(diào)基因數(shù)目多于下調(diào)基因數(shù)目。將差異表達(dá)基因按照參與的生物學(xué)過(guò)程、構(gòu)成細(xì)胞組分、分子功能進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)（圖3）。圖中顯示2 dpi與6 dpi相比，上調(diào)基因被注釋到細(xì)胞組分分類中的差異表達(dá)基因在胞內(nèi)細(xì)胞器（intracellular organelle）、細(xì) 胞 器（organelle）和 蛋 白 質(zhì) 復(fù) 合 體（protein complex）這3個(gè)層級(jí)中的比例較大；在分子功能分類中，比例較為突出的3個(gè)層級(jí)分別是：catalytic activity（催化活性），氧化還原酶活性（oxi?doreductase activity）和脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding）；在生物過(guò)程分類中，比例較為突出的3個(gè)層級(jí)分別是：?jiǎn)斡袡C(jī)物過(guò)程（single-organism process），細(xì)胞組分組織或生物合成（cellular component organiza?tion or biogenesis）、碳水化合物代謝過(guò)程（carbohy?drate metabolic process）。從對(duì)差異上調(diào)基因的GO功能注釋結(jié)果看出，象耳豆根結(jié)線蟲在侵染攜帶Mi-1抗性基因的番茄后極有可能通過(guò)上調(diào)與氧化還原酶活性等相關(guān)基因來(lái)提高對(duì)活性氧耐受力，從而加強(qiáng)其對(duì)寄主的侵染性。

圖3 差異基因GO功能注釋圖Fig.3 Statistics of GO annotation classification of differentially ex?pressed genes

2.4 差異表達(dá)基因KEGG注釋分析

對(duì)差異表達(dá)的967個(gè)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，共有532個(gè)基因得到富集，下調(diào)數(shù)目多于上調(diào)，統(tǒng)計(jì)到在上調(diào)、下調(diào)差異基因中分別顯著富集到51和59條通路，富集基因數(shù)分別為364和168，共涉及到102個(gè)信號(hào)通路。由圖4可見，上調(diào)基因主要富集在碳代謝（Carbon metabolism）、核糖 體（Ribosome）、糖 酵 解/糖 異 生（Glycolysis /Gluconeogenesis）、氨基酸的生物合成（Biosynthe?sis of amino acids）、剪切體（Spliceosome）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）等，其中注釋到最多基因數(shù)的通路為碳代謝和核糖體，而富集程度最大的是谷胱甘肽代謝。

圖4 差異基因KEGG富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis of differential?ly expressed genes

2.5 致病相關(guān)基因的篩選與分析

通過(guò)KEGG、GO功能分析結(jié)果看出，上調(diào)基因中極有可能存在潛在的致病相關(guān)基因，通過(guò)sig?nalP5.0在線軟件預(yù)測(cè)所有上調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)具有信號(hào)肽的差異基因共88個(gè)，利用TMHMM2.0在線軟件預(yù)測(cè)具有信號(hào)肽且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的差異基因共55個(gè)，其中上調(diào)基因中具信號(hào)肽且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的差異基因共29個(gè)。對(duì)預(yù)測(cè)到的29個(gè)致病相關(guān)基因進(jìn)行了基因序列比對(duì)分析及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)（表3）。除此外，通過(guò)String預(yù)測(cè)候選基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖5）發(fā)現(xiàn)，CAD218859.1與CAD2177646.1之間可能存在基因共現(xiàn)性與共表達(dá)的互作類型，CAD2179971.1與基因CAD2177646.1之間也可能存在共表達(dá)的互作類型。

圖5 候選基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)圖Fig.5 Protein interaction network prediction map of candidate genes

表3 篩選到的致病相關(guān)基因信息表Table 3 Information table of pathogenicity?related genes screene

由于通過(guò)在NCBI中進(jìn)行基因序列比對(duì)分析及結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因具有類RxLR結(jié)構(gòu)域，分 別 是CAD2177575.1、CAD2175494.1、CAD2161020.1，且篩選到的基因中只有2個(gè)基因與已報(bào)道的南方根結(jié)線蟲候選效應(yīng)子類似，分別是CAD2205632.1和CAD2171197.1，且這2個(gè)基因差異倍數(shù)較高，綜合分析這5個(gè)基因具有一定的后續(xù)研究?jī)r(jià)值，因此選取這5個(gè)基因進(jìn)行后續(xù)qP?CR驗(yàn)證。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析及基因序列比對(duì)的從預(yù)測(cè)到的29個(gè)致病相關(guān)基因中挑選了5個(gè)基因，使用qPCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，并對(duì)驗(yàn)證的5個(gè)候選致病相關(guān)基因表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析（圖6），CAD2175632.1與CAD2175494基因表達(dá)量驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間為負(fù)相關(guān)關(guān)系，但差異不顯著，qPCR和RNA-seq在基因表達(dá)定量上存在一定差異可能是qPCR的定量只在基因的局部區(qū)域 進(jìn) 行 測(cè) 量 所 致，CAD2205632、CAD2177575、CAD2161020基因表達(dá)量驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間為正的強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，差異不顯著。此外，從圖7中可以看出5個(gè)候選致病相關(guān)基因表達(dá)量都有所上調(diào)，其中6 dpi與2 dpi相比，CAD2177575、CAD2205632的基因表達(dá)量差異極顯著，CAD2171197.1與CAD2175494基因表達(dá)量差異顯著，CAD2161020的基因表達(dá)量差異不顯著。綜上所訴，5個(gè)候選致病相關(guān)基因經(jīng)qPCR驗(yàn)證均為象耳豆根結(jié)線蟲侵染番茄VFNT后在侵染早期表達(dá)量上調(diào)的基因，且與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)具有一定相關(guān)性，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

圖6 5個(gè)候選基因RNA-seq與qPCR驗(yàn)證結(jié)果的相關(guān)性熱圖Fig.6 Correlation heatmap between RNA-seq and qPCR valida?tion results of five candidate genes

圖7 轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測(cè)的5個(gè)候選致病相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證Fig.7 qPCR verification of five pathogenicity-related gene predict?ed in transcriptome

3 討論

由于植物寄生線蟲效應(yīng)子蛋白在線蟲與寄主互作中的重要作用，挖掘線蟲基因組中的效應(yīng)蛋白編碼基因成為了研究線蟲與寄主互作的重要途徑。隨著近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，也開發(fā)了各種研究技術(shù)來(lái)篩選與鑒定線蟲效應(yīng)蛋白，包括生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等。例如Lee等［21］利用對(duì)南方根結(jié)線蟲分別接種甘薯感病和抗病品種的根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，確定了可能觸發(fā)特定信號(hào)通路變化的候選致病基因；Pogorelko等［22］使用了感染丁香假單胞菌和熒光假單胞菌的本氏煙草植株以確定大豆孢囊線蟲中干擾植物免疫反應(yīng)的甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶類效應(yīng)蛋白，最終篩選鑒定出3個(gè)抑制ETI反應(yīng)的效應(yīng)蛋白，7個(gè)抑制PTI反應(yīng)的效應(yīng)蛋白；史倩倩基于南方根結(jié)線蟲基因組信息，結(jié)合生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了110個(gè)具有信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)的候選效應(yīng)子［23］。此外，一些具有特殊結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白也?？赡転殛P(guān)鍵致病基因，例如具有RxLR結(jié)構(gòu)域、SPRY結(jié)構(gòu)域、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、RD激酶結(jié)構(gòu)域、FLAK結(jié)構(gòu)域等［24-26］。其中具有RxLR結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子，可以抑制由PTI/ETI引發(fā)的HR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)免疫抑制作用，張文玥等［25］通過(guò)基于南方根結(jié)線蟲野生型和Me3毒性群體基因組重測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組分析，初步預(yù)測(cè)其存在24個(gè)候選的類RxLR效應(yīng)子基因并進(jìn)行了初步功能驗(yàn)證。所以本試驗(yàn)基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析篩選致病相關(guān)基因時(shí)除信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)以外還進(jìn)行了其它結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)及基因序列比對(duì)，從篩選的29個(gè)候選致病相關(guān)基因中，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因也具有RxLR結(jié)構(gòu)域，其它候選基因還具有泛素折疊類似結(jié)構(gòu)域、纖維素酶結(jié)構(gòu)域等與致病相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，通過(guò)NCBI序列比對(duì)分析還發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)基因與已經(jīng)報(bào)道的南方根結(jié)線蟲候選效應(yīng)子具有一定的相似度。

前期研究進(jìn)行了針對(duì)親和線蟲（象耳豆根結(jié)線蟲）和非親和線蟲（南方根結(jié)線蟲）接種含有Mi?1抗性基因的番茄植株VFNT的組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在2 dpi時(shí)兩者幾乎無(wú)差別，而非親和互作6 d時(shí)不能像親和互作一樣在根組織內(nèi)形成巨型細(xì)胞，根外形成明顯膨大的根結(jié)［17］，根據(jù)Jones等［27］提出的植物免疫反應(yīng)zigzag模型，可以推測(cè)此時(shí)間段內(nèi)象耳豆根結(jié)線蟲分泌的某些特有的效應(yīng)子能夠使線蟲成功避開寄主植物的抗性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主植物的寄生。本研究針對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲侵染番茄VFNT關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，對(duì)效應(yīng)蛋白相關(guān)基因進(jìn)行初步預(yù)測(cè)篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在侵染關(guān)鍵階段差異上調(diào)的基因共有656個(gè)，GO注釋和KEGG注釋都說(shuō)明上調(diào)基因功能與象耳豆根結(jié)線蟲致病力具有一定關(guān)系，例如GO功能注釋中氧化還原酶活性相關(guān)基因的顯著上調(diào)，同先前的研究顯示象耳豆根結(jié)線蟲對(duì)過(guò)氧化氫的耐受力強(qiáng)于南方根結(jié)線蟲的研究結(jié)果一致［17］。此外，在KEGG代謝通路分析中發(fā)現(xiàn)，富集程度最大為谷胱甘肽代謝，有研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽（GSH）氧化和還原的形式對(duì)線蟲侵染植物必不可少，因?yàn)樗{(diào)節(jié)巨型細(xì)胞的代謝活動(dòng)［18］。其它注釋和富集到的功能未見特殊功能富集，但上調(diào)的候選致病相關(guān)基因可挖掘性強(qiáng)，極有可能存在影響象耳豆根結(jié)線蟲發(fā)育和侵染的關(guān)鍵基因，因此研究針對(duì)侵染關(guān)鍵時(shí)期所有上調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。

當(dāng)然在轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)植物寄生線蟲效應(yīng)蛋白編碼基因進(jìn)行初步預(yù)測(cè)的方法也有其局限性［28］，因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)有的效應(yīng)子不具有典型的信號(hào)肽，例如Huang等［29］就發(fā)現(xiàn)50%的褐飛虱唾液腺蛋白基因不具有信號(hào)肽序列。除此以外，這些轉(zhuǎn)錄本的基因序列并不完整，還需通過(guò)RACE等技術(shù)進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增進(jìn)行進(jìn)一步的研究，并且后續(xù)還需對(duì)候選致病相關(guān)基因進(jìn)行原位雜交、基因沉默等試驗(yàn)對(duì)其功能進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，隨著響應(yīng)國(guó)家減肥減藥雙減政策要求和糧食生產(chǎn)需求，番茄生產(chǎn)系統(tǒng)中防治對(duì)經(jīng)濟(jì)具強(qiáng)破壞性影響的象耳豆根結(jié)線蟲，了解其寄生致病分子機(jī)制，開發(fā)有效防治新手段極具研究?jī)r(jià)值。

4 結(jié)論

研究通過(guò)象耳豆根結(jié)線蟲侵染攜帶Mi?1抗性基因的番茄植株關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合生物信息學(xué)軟件對(duì)上調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行初步篩選，篩選出29個(gè)具有信號(hào)肽且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的候選致病相關(guān)基因，從中挑選出保守結(jié)構(gòu)域與致病相關(guān)的基因以及與已報(bào)道的南方根結(jié)線蟲效應(yīng)子具有一定同源性的基因進(jìn)行qPCR試驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)證5個(gè)候選基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組一致，皆為上調(diào)，且與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也具有一定相關(guān)性，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的具有可信度的同時(shí)，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)挑選候選致病相關(guān)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證提供了研究思路。本研究基于轉(zhuǎn)錄組篩選出的候選致病相關(guān)基因可能在象耳豆根結(jié)線蟲侵染抗病植株過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，為研究象耳豆根結(jié)線蟲致病基因提供了新思路及新可能。