暢引東，賈仡偉，何瑞，張萌，2，孟廣軍，李新鳳，張作剛*，王建明*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；2.山西省植物保護(hù)植物檢疫中心，山西 太原 030001）

MicroRNA（miRNA）是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的一類重要內(nèi)源性非編碼小分子，大約由19~30個(gè)核苷酸組成。它通常靶向一個(gè)或多個(gè)mRNAs，通過抑制翻譯或者降解靶標(biāo)mRNAs來調(diào)節(jié)基因表達(dá)［1-2］。真菌中miRNA相關(guān)研究起步較晚。溫劍等基于成熟miRNA序列在不同物種內(nèi)具有保守性及其前體結(jié)構(gòu)具有發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)的特性［3-5］，運(yùn)用RNA組學(xué)方法、生物信息學(xué)技術(shù)和熒光定量PCR方法率先在真菌釀酒酵母基因組中鑒 定 出32個(gè)microRNA-like RNAs（milRNAs）［6］。此后，研究人員基于高通量測序結(jié)果運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)參考miRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase）中其它物種miRNA數(shù)據(jù)，對(duì)一些真菌菌種進(jìn)行milRNA的預(yù)測，并進(jìn)一步采用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northern雜交等方法對(duì)預(yù)測的milR?NAs進(jìn)行驗(yàn)證和功能研究［7］。Fulci等［8］發(fā)現(xiàn)Neu?rospora crassa中siRNA和milRNA在基因表達(dá)調(diào)控方面都具有重要作用。Zhou Jiahong等［9］首次報(bào)道在植物病原真菌中核盤菌的milRNA與核盤菌的菌核形成和致病過程相關(guān)。Zhou Quan等［10］研究發(fā)現(xiàn)綠僵菌中milRNA參與調(diào)控菌絲生長和產(chǎn)孢的過程。Guo Maowei等［11］研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌中Fgmil-2通過反向調(diào)控其靶基因FgbioH1調(diào)控生物素的合成，從而影響病原菌營養(yǎng)生長、致病性及毒素生成等。馮浩等［7］研究發(fā)現(xiàn)蘋果黑腐皮殼菌中Vm-milR37通過調(diào)控谷胱甘肽過氧化物酶基因VmGP從而增強(qiáng)蘋果樹腐爛病菌的致病力。植物miRNA不僅在植物細(xì)胞中起重要作用，在遭受病原菌侵染時(shí)還會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入真菌細(xì)胞介導(dǎo)跨界抗病性［12］。植物miRNA跨界出擊抗病，病原菌miRNA也會(huì)跨界反擊植物的免疫響應(yīng)。馮浩團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)蘋果黑腐皮殼菌Vm-milR1可通過抑制寄主免疫相關(guān)受體蛋白激酶基因表達(dá)，進(jìn)而抑制寄主免疫反應(yīng)促進(jìn)病菌侵染［13］。這一系列研究成果證實(shí)了真菌milRNA不僅對(duì)其自身靶標(biāo)基因的調(diào)控機(jī)制，有些還可跨界發(fā)揮調(diào)控功能。真菌milRNA研究將會(huì)為闡明真菌生物學(xué)過程的分子機(jī)理提供新的方向。

尖孢鐮孢菌是一種重要的植物病原真菌，具有豐富的遺傳多樣性和復(fù)雜的致病性差異［14-16］。近年來有關(guān)該菌種的milRNA研究也逐步展開，但迄今為止，milRNA在鐮孢菌與寄主互作中的功能和調(diào)控機(jī)制報(bào)道較少。Chen Rui等［17］對(duì)尖孢鐮孢菌番茄?；途阭ilRNAs和靶標(biāo)基因進(jìn)行了預(yù)測，但未對(duì)其調(diào)控功能進(jìn)行研究。Jiang Xuefei等［18］通過比較尖孢鐮孢菌西瓜?；途z和小分生孢子的深度測序sRNA文庫篩選出差異表達(dá)milRNAs，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)milRNAs精確調(diào)控毒素基因表達(dá)。Ji Huimin等［19］發(fā)現(xiàn)尖孢鐮孢菌番茄?；途暝谇秩炯闹鞣堰^程中Fol-milR1跨界進(jìn)入寄主細(xì)胞干擾番茄免疫防御體系，從而利于順利侵入寄主。Li Minhui等［20］首次在尖孢鐮孢菌古巴?；途曛邪l(fā)現(xiàn)1個(gè)包括FoQDE2、milRNA-87及其靶基因FOIG_15013的關(guān)鍵致病軸心，施用外源siRNA可抑制milRNA表達(dá)，從而減輕病害癥狀。上述研究表明尖孢鐮孢菌中存在豐富的mil?RNA值得進(jìn)一步研究。

隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，現(xiàn)已建成龐大的基因和蛋白數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)分析可以進(jìn)一步揭示基因間調(diào)控關(guān)系［21-22］。借助于STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析工具［23］、DAVID在線分析工具［24-25］和Cytoscape軟件［26］等生物信息學(xué)工具可以對(duì)蛋白互作信息、基因功能、基因參與的代謝路徑等多方面的信息進(jìn)行預(yù)測分析，還可以結(jié)合多種屬性的互作信息構(gòu)建出復(fù)雜的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，再結(jié)合目標(biāo)基因的表達(dá)水平分析結(jié)果，將會(huì)更進(jìn)一步的闡釋miRNA和靶基因間的調(diào)控機(jī)制［27-28］。

本研究擬結(jié)合前人的研究結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析、DAVID在線分析等生物信息學(xué)手段對(duì)尖孢鐮孢菌番茄?；途阭ilRNAs及其靶基因在侵染寄主條件下的基因表達(dá)情況和蛋白互作關(guān)系進(jìn)行研究，以揭示milRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步明確尖孢鐮孢菌侵染寄主分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：尖孢鐮孢菌番茄?；椭虏【?/p>

供試植株：番茄品種中蔬四號(hào)幼苗

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pri?milRNA和milRNA靶基因引物設(shè)計(jì)與篩選

引物設(shè)計(jì)：參照Chen Rui等［17］預(yù)測的尖孢鐮孢菌番茄?；途阭ilRNAs信息，使用NCBI基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁工具在尖孢鐮孢菌番茄?；腿蚪M數(shù)據(jù)中確定primary-milRNAs（pri-milR?NAs）的位置。依據(jù)pri-milRNA的序列特征，找出pri-milRNA的序列范圍。隨后選取pri-milRNA序列和milRNA靶基因序列依據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物有限公司合成。隨后將引物分別以尖孢鐮孢菌番茄?；途旰头延酌绲腞NA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，通過4%瓊脂糖凝膠電泳和觀察熔解曲線對(duì)引物進(jìn)行特異性檢測。

1.2.2 pri?milRNAs及milRNAs靶基因的基因表達(dá)分析

參照杜賓等［29］所描述的方法，將供試菌株接種于番茄幼苗；分別對(duì)接種后0.5、6、12、48 h的番茄植株根部進(jìn)行取樣。依照RNasio Plus（9108，Takara）的步驟提取總RNA并用qRT-PCR試劑SYBR? Premix Ex Taq II kit（RR470， Takara）反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。以合成單鏈cDNA為模板，以尖孢鐮孢菌tef基因作為內(nèi)參，選用SYBR Pre?mix Ex Taq II試劑盒（RR820，Takara）分別對(duì)供試的pri-milRNAs和milRNAs靶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，測定病原與寄主互作條件下目的基因的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)采用兩步法，其條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，62 ℃退火15 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)的62 ℃退火延伸時(shí)收集熒光；在循環(huán)結(jié)束時(shí)從65 ℃開始繪制溶解曲線直到95 ℃，每次增加0.5 ℃，保持5 s，同時(shí)收集熒光。每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共設(shè)2次生物學(xué)重復(fù)?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)分析根據(jù)目的基因和各個(gè)內(nèi)參基因的閾值循環(huán)（Ct），用2-ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，利用Excel 2010和SPSS11.0軟件進(jìn)行處理及單因素方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

1.2.3 milRNAs與其靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析基于Chen Rui等［17］預(yù)測的milRNAs靶基因信息，在STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站對(duì)靶基因的互作信息進(jìn)行挖掘，獲得一定范圍內(nèi)靶基因的蛋白互作信息和相關(guān)的基因信息。將獲取的蛋白互作信息導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合milRNAs及其靶基因的調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建milRNAs與靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再利用Cyto?scape軟件中的分子復(fù)合物檢測算法（MCODE）進(jìn)行互作基因的功能模塊分析［30］。通過DAVID在線分析軟件對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的基因信息進(jìn)行功能富集分析［24-25］，結(jié)合上述研究進(jìn)一步分析菌株milRNA及其靶基因所涉及的生物學(xué)過程及基因功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 pri?milRNA和milRNA靶基因引物設(shè)計(jì)與篩選

pri-milRNAs的位置及設(shè)計(jì)的引物信息如表1所示。

表1 pri?milRNA位置和引物Table 1 pri?milRNA position and its primers

11個(gè)milRNA靶基因信息和設(shè)計(jì)的milRNA靶基因引物信息見表2。

表2 milRNA靶基因引物Table 2 Primers of milRNA target gene

供試引物經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳和引物的熔解曲線結(jié)果詳見圖1和圖2，在番茄幼苗cDNA模板中因無擴(kuò)增產(chǎn)物生成未列出。從圖1的電泳結(jié)果中可以看出，fox_milR?NA_1a，e，g的pri-milRNA引物M1、M2和M3的擴(kuò)增結(jié)果有雜帶，fox_milRNA_3a和fox_milRNA_5的pri-milRNA引物M6和M9沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；靶基因FOXG_04240和FOXG_16460的引物T1和T8的擴(kuò)增結(jié)果有雜帶，靶基因FOXG_08797、FOXG_15485和FOXG_15486引 物T6、T10和T11沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；其它pri-milRNAs引物和靶基因引物的擴(kuò)增條帶與目的條帶大小一致。

圖1 pri-milRNAs和靶基因引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified results of primers for pri-miRNAs and their target genes

從圖2中可看出，fox_milRNA_1a，e，g的primilRNA引物M1、M2和M3的熔解曲線雜亂，特異性不好；fox_milRNA_3a和fox_milRNA_5的pri-milRNA引物M6和M9沒有熔解曲線，表明無擴(kuò)增產(chǎn)物生成；靶基因FOXG_04240和FOXG_16460的引物T1和T8的熔解未形成單峰，特異性不 好；靶 基 因FOXG_08797、FOXG_15485和FOXG_15486引物T6、T10和T11沒有熔解曲線，表明無擴(kuò)增產(chǎn)物生成；其它pri-milRNAs引物和靶基因引物的熔解曲線明顯為單峰，特異性較好。

圖2 pri-milRNA和靶基因引物的熔解曲線Fig.2 Melting curves of primers for pri-miRNAs and their target genes

綜上所述，部分milRNAs的pri-milRNAs的基因序列相似性極高（fox_milRNA_1a，e，g），所設(shè)計(jì)的引物特異性較差。還有一些基因，設(shè)計(jì)的引物未能擴(kuò)增出目的條帶。因此，只選擇部分primilRNAs及其靶基因引物M4、M5、M7、M8、M10、T2、T3、T5和T7進(jìn)行下一步基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，初步確定milRNAs基因與其靶基因的調(diào)控關(guān)系。

2.2 pri?milRNAs及milRNA靶基因的基因表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測尖孢鐮孢菌番茄?；途昵秩炯闹髟缙诔跫?jí)milRNA及其靶基因的表達(dá)情況（圖3）。

pri-milRNAs與靶基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果中反映出供試的尖孢鐮孢菌番茄?；途阭ilR?NAs及其靶基因的調(diào)控關(guān)系（圖3）。在病原菌侵染番茄后，pri-milRNA_2a的相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；pri-milRNA_2b的相對(duì)表達(dá)量隨著侵染時(shí)間而逐漸上升，在12 hpi時(shí)達(dá)到高峰，隨后顯著下降；milRNA_2a和milRNA_2b靶基因FOXG_03470的相對(duì)表達(dá)量隨著侵染時(shí)間推移而逐漸下降，在48 hpi時(shí)其表達(dá)量上升。pri-milRNA_3b在病原寄主互作后的相對(duì)表達(dá)量呈上升狀態(tài)，而milRNA_3b靶基因FOXG_04910的相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。pri-milRNA_4在病原菌與寄主互作6 hpi的相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，在12 hpi相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，milRNA_4靶基因FOXG_08812在病原和寄主互作后基本未表達(dá)。pri-milRNA_6在病原菌與寄主互作6 hpi時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，隨后顯著下降，而milRNA_6靶基因FOXG_00067的相對(duì)表達(dá)量值在12 hpi時(shí)最高。由此可推斷，試驗(yàn)選取的milR?NAs與靶基因間基本呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖3 尖孢鐮孢菌番茄專化型菌株侵染番茄時(shí)相關(guān)基因的定量表達(dá)Fig.3 The quantitative expression of related genes of FOL during infection

2.3 milRNA與其靶基因的生物信息學(xué)分析

選取的milRNA靶基因經(jīng)STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)同源比對(duì)分析，獲得靶基因及其蛋白互作相關(guān)基因蛋白注釋信息和蛋白互作信息（表3）。

由表3中可知，已有的11個(gè)靶基因中包括1個(gè)奎尼酸透性酶編碼基因FOXG_09739、1個(gè)甘氨酸脫羧酶復(fù)合體H蛋白編碼基因FOXG_03470，其余為2個(gè)預(yù)測蛋白和7個(gè)為保守假定蛋白編碼基因。其中，這些蛋白中僅有甘氨酸脫羧酶復(fù)合體H蛋白（FOXG_03470）和3個(gè)保守假定蛋白（FOXG_04240、FOXG_15485、FOXG_15486）能夠同其它類型蛋白緊密地參與到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

將預(yù)測的蛋白互作信息導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再利用MCODE算法對(duì)構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊分析，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出milRNA_1、milRNA_2、milRNA_3和milRNA_8的靶基因之間的互作聯(lián)系較為緊密。其中，milRNA_1的靶基因FOXG_04240和milRNA_2的靶基因FOXG_03470能夠與諸多的基因進(jìn)行互作，可假定為該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。該預(yù)測的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中共有3個(gè)核心模塊，其中模塊1包含31個(gè)基因，涉及325個(gè)互作關(guān)系（MCODE score 21.67），模塊2包含10個(gè)基因，涉及25個(gè)互作關(guān)系（MCODE score 5.78），模塊3包含4個(gè)基因，涉及6個(gè)互作關(guān)系（MCODE score 4）（表3）。模塊1與模塊3間的互作較為緊密。milRNA_4、milRNA_6和milRNA_7與其它的milRNAs及其靶基因間的互作聯(lián)系并不緊密，其靶基因?yàn)楸Ｊ丶俣ǖ鞍缀皖A(yù)測的蛋白。

圖4 milRNA與靶基因間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein interaction network of milRNA and its target genes

表3 milRNA靶基因及互作相關(guān)聯(lián)基因信息Table 3 Informations of milRNA target genes and interacted genes

將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中涉及的基因數(shù)據(jù)輸入DA?VID在線分析軟件進(jìn)行基因功能分析，可知該網(wǎng)絡(luò)主要涉及的分子功能為氧化還原酶活性和GTP結(jié)合；生物學(xué)過程為小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。模塊1主要涉及的分子功能為氧化還原酶活性。模塊3主要涉及的分子功能為氨甲基轉(zhuǎn)移酶活性、氨基轉(zhuǎn)移酶活性和谷氨酰胺連接酶活性。

續(xù)表

3 討論

miRNA的生物合成最初是由依賴DNA的RNA聚合酶II（Pol II）從基因組DNA中轉(zhuǎn)錄出初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄本（primary miRNA transcript，primiRNA）［19，31］。隨 后，pri-miRNA經(jīng) 包 含 有Dro?sha、RNA聚 合 酶III、DICER-LIKE1和RNAbinding partner DGCR8等多個(gè)分子物質(zhì)的微處理復(fù)合體加工為miRNA［31-32］。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs和其pri-miRNAs在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)［33-34］，這表明通過研究pri-miRNA和miRNA靶基因的表達(dá)水平是初步驗(yàn)證預(yù)測miR?NA功能的一個(gè)很好嘗試。本研究通過對(duì)尖孢鐮孢菌番茄?；途昵秩痉亚昂髉ri-milRNAs及相關(guān)靶基因的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，以初步明確milRNAs與靶基因間的調(diào)控關(guān)系，并對(duì)靶基因的功能進(jìn)行分析。綜合來看，所涉及的milR?NAs與其靶基因之間在一定程度上均呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證了Chen Rui等［17］的靶基因預(yù)測結(jié)果。病原菌fox_milRNA_2a和fox_milRNA_2b可能通過調(diào)控靶基因FOXG_03470的不同位點(diǎn)來調(diào)控該基因。該基因編碼甘氨酸裂解酶系H蛋白（表3），通過該甘氨酸裂解酶復(fù)合物進(jìn)行甘氨酸脫羧，將甘氨酸裂解為二氧化碳、氨和亞甲基（GO：0019464）。該基因在侵入寄主初期可能是分別受到fox-milRNA_2a和fox_milRNA_2b的調(diào)控微量表達(dá)，隨后呈逐漸上升趨勢(shì)，表明該基因菌株的初侵染過程中起到重要的作用。fox_milRNA_3b的靶基因FOXG_04910編碼保守的假定蛋白（表3），其參與的生物學(xué)過程為調(diào)節(jié)Rho蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率、速率和程度（GO：0035023），而Rho類基因在菌株生長中起重要作用［35］。該基因可能受fox_milRNA_3b調(diào)控，在病原菌寄主互作0.5 h時(shí)FOXG_04910基因大量表達(dá)，隨著fox_milRNA_3b相對(duì)表達(dá)量增長，F(xiàn)OXG_04910基因表達(dá)量下將，由此推斷該基因可能與病原菌侵染寄主時(shí)信號(hào)識(shí)別有關(guān)。fox_milRNA_4、fox_milRNA_6的靶基因FOXG_00812、FOXG_00067分別為預(yù)測蛋白和保守假定蛋白（表3），F(xiàn)OXG_00812在菌株與寄主互作早期的表達(dá)量較低，而FOXG_00067的基因表達(dá)量隨著侵染時(shí)間延長而逐漸上升，說明其可能與菌株的生長相關(guān)。目前，這2個(gè)基因的生物學(xué)功能尚未公布，基因的具體功能有待于進(jìn)一步的研究。

病原菌與寄主的互作是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，需要眾多基因來共同協(xié)作完成。因此，基于STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)可通過病原菌已知蛋白間的相互作用探尋目標(biāo)蛋白互作信息是可行的［36］。諸多的研究結(jié)果表明，STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)所預(yù)測的相關(guān)基因功能在基因功能應(yīng)用中具有較高的可信性［37-38］。本研究中，部分milRNAs及其靶基因因引物設(shè)計(jì)問題，未能通過基因表達(dá)驗(yàn)證兩者的靶標(biāo)關(guān)系。但在基于Chen Rui等預(yù)測的milRNAs靶基因信息所建立的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，fox_milRNA_1、fox_milRNA_2、fox_milRNA_3和fox_milRNA_8的靶基因間的互作較為緊密（圖3）；該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)由3個(gè)核心模塊組成，模塊1中基因主要涉及的分子功能為氧化還原酶活性，模塊3中基因涉及的分子功能為氨甲基轉(zhuǎn)移酶活性動(dòng)、氨基轉(zhuǎn)移酶活性和谷氨酰胺連接酶活性。該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)主要涉及的生物學(xué)過程為小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中fox_milRNA_1、fox_mil?RNA_2的靶基因FOXG_04240和FOXG_03470能夠與多個(gè)基因進(jìn)行互作，可假定為該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因，兩者與病原菌侵染早期的信號(hào)識(shí)別密相關(guān)。因此，未來進(jìn)一步對(duì)尖孢鐮孢菌番茄?；途曛衅渌黰ilRNAs及其靶基因的調(diào)控關(guān)系作進(jìn)一步的研究的同時(shí)，明確milRNAs與靶基因間的調(diào)控關(guān)系將會(huì)為未來尖孢鐮孢菌致病機(jī)理研究指明新的方向。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過分子試驗(yàn)和生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)尖孢鐮孢菌侵染番茄時(shí)存在milRNAs及其下游靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中基因相對(duì)表達(dá)分析證明fox_milRNA_2、fox_milRNA_3、fox_mil?RNA_4和fox_milRNA_6與其靶基因可能存在靶標(biāo)關(guān)系；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，fox_milRNA_1、fox_milRNA_2、fox_milRNA_3和fox_milRNA_8的靶基因間的互作較為緊密，其中靶基因FOXG_03470在菌株初侵染過程中起到重要的作用，F(xiàn)OXG_04910可通過調(diào)節(jié)Rho基因影響菌株的生長，推斷其可能跟菌株與寄主的信號(hào)識(shí)別和菌株在寄主中定植有關(guān)，為進(jìn)一步深入探索尖孢鐮孢菌milRNA相關(guān)功能提供一個(gè)新思路。