楊坤 孟捷 高霞 王婷玉 韓自榮 梁宇花

摘要 目的：研究姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法：將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、姜黃素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組，每組8只。除對照組小鼠外，其余小鼠使用5% DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型。造模第1天開始灌胃給藥，姜黃素組灌胃60 mg/kg姜黃素懸液，阿托伐他汀組灌胃10 mg/kg阿托伐他汀混懸液;聯(lián)合組灌胃60 mg/kg姜黃素懸液和10 mg/kg阿托伐他汀混懸液，對照組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。觀察并記錄各組小鼠DAI評分，比較結(jié)腸長度;ELISA法檢測炎癥介質(zhì)水平和氧化應(yīng)激水平;透射電鏡觀察結(jié)腸組織中自噬體;WB檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與模型組和單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合組小鼠DAI評分明顯降低，結(jié)腸長度明顯增加;血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低，IL-10含量明顯升高;結(jié)腸組織中，髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）水平明顯降低，而超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX-Px）水平明顯升高;可以觀察到的自噬體的數(shù)量增加，p62蛋白表達(dá)水平明顯降低，Beclin1蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。結(jié)論：姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀可以通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，控制氧化應(yīng)激水平，對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠起到治療和保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 姜黃素;阿托伐他汀;聯(lián)合用藥;炎癥反應(yīng);氧化應(yīng)激;自噬;自噬相關(guān)蛋白;潰瘍性結(jié)腸炎

Protective Effects and Mechanisms of Curcumin Combined with Atorvastatin on Ulcerative Colitis in Mice

YANG Kun1，2，MENG Jie1，GAO Xia1，WANG Tingyu1，HAN Zirong1，LIANG Yuhua1

（1 Department of Spleen，Stomach，Hepatobiliary，Oriental Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To study the protective effects of curcumin combined with atorvastatin on ulcerative colitis（UC） in mice and its underlying mechanisms.Methods：The mice were randomly divided into a control group，a model group，a curcumin group，an atorvastatin group and a combination group，with eight mice in each group.Except for the control mice，the other mice used the 5% DSS-induced ulcerative colitis mouse model.On the first day of modeling，rats were intragastrically administered with curcumin 60 mg/kg suspension and atorvastatin 10 mg/kg suspension，respectively.The rats in the combination group were intragastrically administered with 60 mg/kg curcumin suspension and 10 mg/kg atorvastatin suspension，and the mice in the control group and model group were intragastrically administered with normal saline once daily，1 mL each time，for 7 consecutive days.The DAI score of each group was observed and recorded，and the colon length was compared.The levels of inflammatory factors and oxidative stress were detected by ELISA.The autophagosomes in colonic tissues were observed by transmission electron microscopy.The expression of autophagy-related proteins was detected by WB experiment.Results：Compared with the model group and the medication group alone，the DAI score of the mice in the combination group was significantly reduced，and the colon length was significantly increased.The contents of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 were significantly reduced，while the content of IL-10 was significantly increased.The levels of MPO and MDA in the colon tissue were significantly decreased，while the levels of SOD and GSH-Px were significantly increased.The number of autophagosomes increased，the expression level of p62 protein was significantly reduced，and the protein levels of Beclin1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ were significantly increased（Ps<0.05）.Conclusion：Curcumin combined with atorvastatin can control the level of oxidative stress by regulating the expression of autophagy-related proteins，so as to have a therapeutic and protective effect on ulcerative colitis mice.

Keywords Curcumin; Atorvastatin; Combination therapy; Inflammatory reactions; Oxidative stress; Autophagy; Autophagy-related protein; Ulcerative colitis

中圖分類號：R284;R573.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.007

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是目前常見的一種炎癥性腸病，具有病程長，反復(fù)發(fā)作，且長期患病易導(dǎo)致結(jié)腸癌的特點(diǎn)。該病發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎的病情發(fā)展與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平紊亂有關(guān)[1]。姜黃素源于姜科藥用植物姜黃的地下根莖中，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，姜黃素具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤的藥理活性[2]。阿托伐他汀是一種羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，為心血管疾病常用藥，還發(fā)現(xiàn)其具有抗炎等作用[3]。本研究主要通過觀察姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的自噬和氧化應(yīng)激的調(diào)控作用，探討姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用機(jī)制，為姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級，8周齡C57BL小鼠的40只，健康雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物研究所，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0014。保持動物室內(nèi)濕度和溫度恒定，12 h光照/黑暗交替，小鼠可自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物 葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）（MP Biomedicals公司，美國，批號：0216011080）;姜黃素（Sigma-Aldrich公司，美國，貨號：C1386）;阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051408）。

1.1.3 試劑與儀器 小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、小鼠白細(xì)胞介素10（IL-10）、小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），酶聯(lián)免疫試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：SEKM-0034、SEKM-0010、SEKM-0007、SEKM-0002）;LC3A/B抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab128025）;p62（Abcam公司，美國，貨號：ab207305）;Beclin1（Abcam公司，美國，貨號：ab210498）;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab6721）;小鼠髓過氧化物酶（MPO）、小鼠谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）和小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E08723m、CSB-E13068m、CSB-E08556m）;小鼠丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號：1530033666）。透射電鏡（日立公司，日本，型號：H-7650）;高速冷凍離心機(jī)（Thermo公司，美國，型號：Multifuge X1R）;凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國，型號：Image Lab）;高速組織勻漿機(jī)（IKA公司，德國，型號：T10）;石蠟切片機(jī)（上海萊卡儀器有限公司，型號：RM2016）;多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國，型號：ELX800）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 對小鼠進(jìn)行隨機(jī)編號，并使用隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、姜黃素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組，每組8只。對照組小鼠每日正常飲用滅菌蒸餾水，其他組小鼠均每日飲用5% DSS溶液造模。

1.2.2 給藥方法 對照組和模型組小鼠每日灌胃1 mL生理鹽水;姜黃素組小鼠每日灌胃給藥60 mg/kg姜黃素懸液1 mL，阿托伐他汀組每日灌胃給藥10 mg/kg阿托伐他汀混懸液1 mL;聯(lián)合組每日灌胃60 mg/kg姜黃素懸液和10 mg/kg阿托伐他汀混懸液共1 mL，共7 d[4]。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 疾病活動指數(shù)（DAI）評分 每日稱量小鼠體質(zhì)量，觀察其大便稠度和便血情況，并按以下評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評分：體質(zhì)量沒有下降記0分，體質(zhì)量下降1%～5%記1分，體質(zhì)量下降5%～10%記2分，體質(zhì)量下降10%～15%記3分，體質(zhì)量下降超過15%記4分;糞便稠度正常記0分，稀便記2分，腹瀉記4分;糞便正常不見血記0分，隱血記1分，血便記2分，直腸出血記4分[5]。

1.2.3.2 結(jié)腸長度比較 取小鼠結(jié)腸至肛門直腸段，測量并記錄自然長度，進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析[6]。

1.2.3.3 血清炎癥介質(zhì)比較 給藥結(jié)束后取小鼠靜脈血于無菌離心管中，室溫靜置30 min凝固，9 000×g離心10 min，取上層血清，按照檢測小鼠血清樣本中4種細(xì)胞因子的濃度ELISA試劑盒提供的實(shí)驗程序。

1.2.3.4 透射電鏡觀察各組結(jié)腸組織中自噬體?? 取小鼠結(jié)腸組織，使用2.5%戊二醛和2%鋨酸固定，丙酮梯度脫水，包埋。將包埋組織進(jìn)行超薄切片，對超薄切片使用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，洗去多余染液并干燥，使用透射電鏡觀察各組結(jié)腸黏膜細(xì)胞自噬情況[7]。

1.2.3.5 WB檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況 稱取結(jié)腸組織，在冰上用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液研磨勻漿。將勻漿10 000×g離心20 min，收集上清液，測定蛋白濃度。每組均按100 μg的蛋白量進(jìn)行上樣，然后通過SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。室溫下封閉2 h，加入一抗（LC3A/B（1∶1 000）、P62（1∶1 000）、Beclin1（1∶2 000），4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育1 h。ECL試劑盒顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)計算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量[8]。

1.2.3.6 ELISA法檢測結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平?? 將小鼠結(jié)腸組織使用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，勻漿，9 000×g離心10 min，取上清液，使用相應(yīng)ELISA試劑盒測定結(jié)腸組織SOD、MDA、MPO、GSH-Px含量[9]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗：符合正態(tài)分布的，采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗，若方差不齊性則采用Dunnett T3法檢驗，對于不符合正態(tài)分布的，采用秩和檢驗。2組分析采用獨(dú)立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠DAI評分和結(jié)腸長度的比較 與對照組比較，模型組大鼠DAI評分明顯升高，結(jié)腸長度明顯降低（P<0.05）。姜黃素組和阿托伐他汀組DAI評分比模型組明顯降低，結(jié)腸長度較模型組明顯增加（P<0.05）。與模型組、姜黃素組和阿托伐他汀組比較，聯(lián)合組小鼠DAI評分較上述3組均明顯降低，結(jié)腸長度均明顯升高（P<0.05）。見表1。

2.2 各組血清炎癥介質(zhì)比較 模型炎癥介質(zhì)組小鼠血清炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6含量較對照組明顯升高（P<0.05），抗炎因子IL-10含量較對照組明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，姜黃素組和阿托伐他汀組TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯降低（P<0.05），IL-10含量明顯升高（P<0.05）。聯(lián)合組TNF-α、IL-1β和IL-6含量不僅明顯低于模型組，與姜黃素組和阿托伐他汀組比較也明顯降低（P<0.05）;IL-10含量也明顯高于模型組、姜黃素組和阿托伐他汀組（P<0.05）。見表2。

2.3 各組小鼠結(jié)直腸組織中自噬體比較 TEM結(jié)果顯示，對照組結(jié)腸組織中存在大量的自噬體，而模型組幾乎觀察不到可見的自噬空泡。姜黃素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組均可以觀察到自噬體，且聯(lián)合組自噬體數(shù)量較姜黃素組和阿托伐他汀組更多。見圖1。

2.4 各組結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 模型組小鼠p62蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高，而Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ較對照組明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，姜黃素組p62蛋白表達(dá)明顯降低，Beclin1蛋白表達(dá)明顯升高，LC3Ⅱ蛋白和LC3Ⅰ蛋白的比值明顯升高（P<0.05）。阿托伐他汀組與模型組比較各蛋白表達(dá)水平也具有明顯變化，且與姜黃素組變化情況一致，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在聯(lián)合組小鼠結(jié)腸組織中，p62蛋白表達(dá)水平較模型組、姜黃素組和阿托伐他汀組均明顯降低，Beclin1蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均較上述3組明顯升高（P<0.05）。見圖2，表3。

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織中MPO、SOD、MDA和GSH-Px含量比較 模型組小鼠結(jié)腸組織中MPO和MDA含量比較對照組明顯升高（P<0.05），而SOD和GSH-Px含量比較對照組明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，姜黃素組和阿托伐他汀組MPO和MDA含量均明顯降低，而SOD和GSH-Px含量均明顯升高（P<0.05）。與模型組、姜黃素組和阿托伐他汀組比較，聯(lián)合組MPO和MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px含量明顯升高（P<0.05）。見表4。

3 討論

UC是一種腸道炎癥性疾病，典型癥狀包括血性腹瀉，腹痛等，目前認(rèn)為UC發(fā)病機(jī)制與遺傳、免疫反應(yīng)障礙和環(huán)境因素等有關(guān)，該病易反復(fù)發(fā)作且很難徹底根治，對患者生命質(zhì)量造成很大影響。姜黃素是從姜黃的根莖中提取出來的一種天然藥物，具有很高的安全性，是一種藥用植物和食品添加劑，且姜黃素具有良好抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用，近年來越來越廣泛應(yīng)用于炎癥相關(guān)性疾病的治療中[10-11]。在Hanai等[12]關(guān)于姜黃素對UC臨床療效的研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠緩解靜止期UC患者復(fù)發(fā)，且無明顯毒性，具有良好的治療前景。阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過降低炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織和血管內(nèi)皮起到保護(hù)作用[13-14]。由本研究的DAI評分和結(jié)腸長度結(jié)果可以看出，姜黃素和阿托伐他汀均能減輕潰瘍性結(jié)腸炎的程度，并對小鼠結(jié)腸組織起到保護(hù)作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，中西藥聯(lián)合用藥在臨床實(shí)驗中效果顯著，其中姜黃素因其主要作用研究充分，安全性高，且在疾病譜中兼具多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)控相關(guān)致病因子，在中西醫(yī)結(jié)合應(yīng)用中的前景更加廣泛。朱立偉[15]的研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合美沙拉嗪治療輕、中度潰瘍性結(jié)腸炎時，能夠產(chǎn)生更好的臨床療效且不增加不良反應(yīng)的發(fā)生。然而，由于姜黃素水溶性低，口服給藥生物利用度差，使其在臨床應(yīng)用中受到了極大的限制[16]。隨著近年來脂質(zhì)體、納米技術(shù)等藥物遞送途徑的研究以及姜黃素化學(xué)衍生物的合成，姜黃素的生物利用度得到明顯改善，為姜黃素的臨床使用提供了新的前景[17]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有潛在的不良反應(yīng)[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是UC發(fā)生和發(fā)展的重要因素，在炎癥區(qū)域，由于炎癥介質(zhì)的增多和抗炎因子的減少，會刺激機(jī)體產(chǎn)生和釋放大量ROS，而可清除自由基的SOD、GSH-Px等酶活性降低，使ROS不斷積累，從而引起周圍組織的損傷，這是UC的一種潛在致病因素[19]。因此，抑制氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)的過表達(dá)，可作為治療UC的方案。本研究結(jié)果顯示，姜黃素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組均能夠使炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β與IL-6含量明顯降低，并明顯提高抗炎因子IL-10的含量，抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng);同時降低MPO和MDA含量，提高SOD和GSH-Px水平，提高機(jī)體對氧自由基的清除能力;且聯(lián)合組對于UC小鼠的炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激水平的影響與單獨(dú)用藥組比較也具有顯著性差異，說明姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀對UC小鼠的保護(hù)作用更好，這與相關(guān)研究結(jié)果相似[20]。

有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅與細(xì)胞增殖相關(guān)，還能誘導(dǎo)自噬過程[21]。自噬（Autophagy）是真核細(xì)胞在應(yīng)激情況下所產(chǎn)生的一種非損傷性應(yīng)答，通過溶酶體降解亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡[22]。自噬過程是由一系列自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)完成的，其中幾個關(guān)鍵蛋白，如LC3Ⅱ作為自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，參與了自噬體的形成，與自噬體的數(shù)量正相關(guān);Beclin1蛋白是啟動自噬的關(guān)鍵性蛋白，能夠調(diào)節(jié)自噬體膜合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);p62能夠通過與被泛素化的自噬底物蛋白作用，介導(dǎo)線粒體聚合并降解，與自噬水平負(fù)相關(guān)[23]，均是可以反映自噬水平高低的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，正常組小鼠結(jié)腸組織中自噬體含量豐富，而模型組小鼠結(jié)腸組織中幾乎見不到自噬體，這說明自噬體的減少與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展具有一定的關(guān)系。姜黃素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組可以增加小鼠結(jié)腸組織中的自噬體數(shù)量，并使p62蛋白表達(dá)明顯降低，Beclin1蛋白表達(dá)明顯升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平明顯升高，在鄧慧君等[24]的研究中也得到了相似的結(jié)論。本研究結(jié)果表明聯(lián)合組對自噬體數(shù)量的增加和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的作用較單獨(dú)用藥組更為明顯?？梢哉f，姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀可更好地抑制自噬體的減少，增強(qiáng)自噬作用，從而對UC小鼠的結(jié)腸組織起到保護(hù)作用。

綜上所述，姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀可以通過調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎小鼠自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)而增強(qiáng)自噬，同時控制氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)水平，對潰瘍性結(jié)腸炎起到治療作用。本研究首次采用姜黃素聯(lián)合阿托伐他汀對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用進(jìn)行研究，為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供了實(shí)驗依據(jù)。后續(xù)可對姜黃素和阿托伐他汀聯(lián)合作用下對于炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用機(jī)制進(jìn)行研究，另外，對于姜黃素使用的安全劑量以及不同劑型的潛在毒性作用等方面也需要進(jìn)行詳細(xì)研究，為聯(lián)合用藥的臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗依據(jù)。

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（2021-11-25收稿 本文編輯：楊覺雄）