高志城 周敏 張任廣

摘 要：目的：建立適用于定量測(cè)定維生素片中泛酸含量的微生物法。方法：植物乳桿菌（ATCC8014）繁殖速度與泛酸的含量呈正比關(guān)系，且在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，對(duì)培養(yǎng)后菌懸液的吸光度與泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，定量測(cè)定出維生素片中的泛酸含量。結(jié)果：微生物法測(cè)定泛酸的線性范圍為0～98.0 ng，其標(biāo)準(zhǔn)曲線多變量相關(guān)系數(shù)為0.991 29，測(cè)定維生素片中的泛酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.23%，回收率為91.4%～103.4%。結(jié)論：微生物法測(cè)定維生素片中的泛酸含量操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：微生物法;泛酸;維生素片;植物乳桿菌

Determination of Pantothenic Acid in Vitamin Tablets by Microbiological Method

GAO Zhicheng， ZHOU Min， ZHANG Renguang

（Institute of Analysis， Guangdong Academy of Sciences （China National Analytical Center， Guangzhou）， Guangzhou 510000， China）

Abstract： Objective： A microbiological method for quantitative determination of pantothenic acid in vitamin tablets was established.Method： The growth rate of Lactobacillus plantarum （ATCC 8014） was in direct proportion to the content of pantothenic acid，and showed a linear relationship within a certain concentration range. According to the comparison between the absorbance of bacterial suspension after culture and the working curve of pantothenic acid standard， the content of pantothenic acid in vitamin tablets was determined quantitatively. Results： The linear range of the microbiological method was 0～98.0 ng and the multivariate correlation coefficient of the standard curve was 0.991 29. The relative standard deviation （RSD） of the determination of pantothenic acid content in vitamin tablets was 2.23% and the recovery rate was 91.4%～103.4%. Conclusion： The microbiological method for the determination of pantothenic acid in vitamin tablets is simple， reliable and repeatable.

Keywords： microbiological method; pantothenic acid; vitamin tablets; lactobacillus plantarum

泛酸常用的檢測(cè)方法有微生物法[1]、微孔板試劑盒法[2]以及儀器分析法。儀器分析法包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、火焰原子吸收法[4]、超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法[5]等。微生物法測(cè)定泛酸具有更高的靈敏度和更低的檢出限，微生物法的實(shí)際應(yīng)用更普遍，且是我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于食品中泛酸含量的推薦測(cè)定方法。本研究參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》

（GB 5009.210—2016）方法，通過(guò)改善相關(guān)試驗(yàn)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)以及加標(biāo)回收試驗(yàn)，建立適用于測(cè)定維生素片中泛酸含量的微生物法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株為植物乳桿菌（ATCC8014，廣東省微生物菌種保藏中心）;泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（純度94.3%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國(guó)）;泛酸測(cè)定用培養(yǎng)液（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV-2700型，島津儀器蘇州有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取22.60 mg泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按標(biāo)準(zhǔn)

GB 5009.210—2016制成泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

（39.2 μg/mL）、泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（0.98 μg/mL）和

泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（19.6 ng/mL）。標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 接種液的制備

菌種復(fù)蘇為將用磁珠保存的植物乳桿菌（ATCC8014）直接劃線于MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上，36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。將活化后的植物乳桿菌從瓊脂平板上挑取一環(huán)接種于乳酸菌肉湯中，36 ℃培養(yǎng)

24 h。試驗(yàn)前一天，取2 mL泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和4 mL泛酸測(cè)定用培養(yǎng)液混勻，分裝于2支5 mL試管中，塞好棉塞，于121 ℃高壓滅菌5 min后，即為種子培養(yǎng)基。冷卻后用移液槍將活化后的菌懸液0.5 mL轉(zhuǎn)種至2支種子培養(yǎng)基中，于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出后3 000 r/min離心10 min，棄上清液，無(wú)菌操作下用已預(yù)先滅菌的生理鹽水淋洗2次，3 000 r/min離心10 min，棄上清液。再加入3 mL滅菌生理鹽水，振蕩混勻，稀釋，使用分光光度計(jì)，于550 nm處，以生理鹽水為對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定菌液的透光率為60%～80%，制成接種液。

1.3.3 樣品前處理

稱取適量試樣0.2～2.0 g至100 mL錐形瓶中，加入80 mL乙醇溶液，超聲振搖提取4 h以上，用水定容至100 mL。樣品超聲后先用0.2 μm無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾，根據(jù)試樣中泛酸含量，用水對(duì)試樣提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋（F），使稀釋后試樣提取液中泛酸濃度約為20 ng/mL。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備

取試管分別加入泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0 mL、

0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL、4.00 mL、4.50 mL和5.00 mL于試管中，補(bǔ)水至5.0 mL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)系列管中0 ng、9.8 ng、19.6 ng、29.4 ng、39.2 ng、49.0 ng、58.8 ng、68.6 ng、78.4 ng、88.2 ng和98.0 ng的泛酸，再加入

5.0 mL泛酸測(cè)定用培養(yǎng)液，混勻，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

1.3.5 待測(cè)液的制備

分別取待測(cè)液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL和4.0 mL

加入培養(yǎng)管中，補(bǔ)水至5 mL，再加入泛酸測(cè)定用培養(yǎng)液5 mL，反應(yīng)體系為10 mL，混勻，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

1.3.6 滅菌及接種培養(yǎng)

將所有的標(biāo)準(zhǔn)系列管以及試樣系列管塞好棉塞，121 ℃高壓滅菌5 min（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求15 min，滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色過(guò)深會(huì)對(duì)培養(yǎng)后的測(cè)量有一定的影響），滅菌后降溫到高壓滅菌鍋可以打開(kāi)時(shí)，立刻將標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣系列管拿出，置于預(yù)先準(zhǔn)備好的冰水中迅速冷卻。用移液器向每支測(cè)定管中各加50 μL接種液，用渦旋振蕩器充分振蕩混勻后，（37±1） ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h，直至達(dá)到最大混濁度，即再培養(yǎng)2 h后吸光度值無(wú)明顯變化。準(zhǔn)備一支標(biāo)準(zhǔn)0管（含0 ng泛酸）不接種作為0對(duì)照管。

1.3.7 系列管測(cè)定

將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣系列管取出，用厚度為1 cm的比色杯于550 nm處，以未接種0對(duì)照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，依次測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣系列管的吸光度值。測(cè)定時(shí)，每支試管用漩渦振蕩器混合均勻后，立即將試管內(nèi)培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)，在波長(zhǎng)為550 nm進(jìn)行測(cè)定，待讀數(shù)穩(wěn)定30 s后，讀出吸光度值A(chǔ)，每支試管的穩(wěn)定時(shí)間要相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 泛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以泛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值為縱坐標(biāo)，根據(jù)多變量方程，擬合微生物法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=-1.784 54×

10-6X3+1.482 96×10-5X2+0.035 501 1X-0.070 036 3，多變量相關(guān)系數(shù)為0.991 29。由于微生物生長(zhǎng)的特殊性，隨著泛酸濃度的增加，吸光度值的增加會(huì)越來(lái)越慢，而不是呈直線式增長(zhǎng)。因此，采用多變量方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，更符合試驗(yàn)菌株的實(shí)際生長(zhǎng)情況，可得到更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 方法的重復(fù)性試驗(yàn)

用微生物法對(duì)同一維生素片測(cè)定6次，泛酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，6次測(cè)定的泛酸含量平均值為753 mg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.23%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.3 方法的回收率試驗(yàn)

稱取已知泛酸含量的維生素片進(jìn)行回收率試驗(yàn)，先對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行前處理，按表2精確地加入濃度為39.2 μg/mL的泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.6的方法培養(yǎng)后，測(cè)定泛酸的含量。3個(gè)不同濃度水平下的回收率為91.4%～103.4%，平均回收率為97.2%，說(shuō)明該方法具有較高的回收率，可以滿足多種維生素片中泛酸含量的測(cè)定需求。

2.4 討論

由于微生物法的靈敏度較高，對(duì)試驗(yàn)人員和試驗(yàn)用器具的要求較嚴(yán)格，在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中要注意以下2點(diǎn)。①滅菌時(shí)，由于維生素測(cè)定用培養(yǎng)基的特殊性，滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，要嚴(yán)格按照培養(yǎng)基配制說(shuō)明操作，滅菌結(jié)束后一旦達(dá)到高壓滅菌鍋可以打開(kāi)的溫度，應(yīng)立即取出試驗(yàn)系列管放入冰水浴中冷卻，盡量避免有色物質(zhì)產(chǎn)生。②使用分光光度計(jì)來(lái)調(diào)整接種液濃度，同時(shí)也對(duì)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行控制。接種液濃度過(guò)高、培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致菌體凝聚、沉淀，用漩渦振蕩器無(wú)法將其打散，用分光光度計(jì)測(cè)量時(shí)無(wú)法得到均勻的菌懸液，造成結(jié)果偏差大，因此可通過(guò)降低接種液濃度和縮短培養(yǎng)時(shí)間以解決菌懸液凝聚的問(wèn)題，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)改善菌種復(fù)蘇的條件、確定適宜的接種液濃度、選擇合適的維生素片中泛酸測(cè)定用培養(yǎng)基以及縮短標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣系列管的滅菌時(shí)間等措施，得到了滿意的試驗(yàn)結(jié)果，解決了試驗(yàn)過(guò)程中菌種活力不夠、菌體凝集沉降、有色物質(zhì)產(chǎn)生等導(dǎo)致的試驗(yàn)數(shù)據(jù)不穩(wěn)定、重復(fù)性差的問(wèn)題，為建立維生素片中泛酸含量的測(cè)定提供了有效的理論依據(jù)。但本研究還存在一些問(wèn)題。由于整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，為避免菌種質(zhì)量帶來(lái)不良影響，每次試驗(yàn)都用新的磁珠保存的植物乳桿菌，而非采用之前保存的菌懸液，整個(gè)檢驗(yàn)周期需5～6 d。如果可以直接低溫冷凍保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基中，保證菌種的活力就可以縮短菌種復(fù)蘇時(shí)間，從而縮短檢測(cè)周期，3～4 d就可以得到結(jié)果。微生物法具有較高的靈敏度和較低的檢出限，在檢驗(yàn)泛酸含量較低的樣品時(shí)，優(yōu)于高效液相色譜法。本研究提高了微生物法測(cè)定泛酸的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，為泛酸含量的實(shí)際檢測(cè)工作提供了有效參考和數(shù)據(jù)支持。

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