薛亞軍，黃文華，杜雅彥,3，周奕君，董星星，魏育濤,4

心臟周圍脂肪堆積是公認(rèn)的易引起冠心病(coronary artery disease, CAD)、心房纖顫和心力衰竭等心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的危險因素[1-2]。心外膜脂肪組織(epicardial adipose tissue, EAT)與心肌組織共享冠脈血供[3-4]。巨噬細(xì)胞在CAD患者EAT組織中表現(xiàn)出M1極化和分泌大量炎癥因子。EAT能促進(jìn)CAD發(fā)生發(fā)展，EAT有望作為診斷和治療CAD的靶標(biāo)[1,5-6]。

Kruppel樣因子(Kruppel-like factors, KLFs)屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族[7]，其在基因表達(dá)和調(diào)控中發(fā)揮著不同作用[8]。其中KLF7可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和脂肪細(xì)胞因子分泌[9-10]。但是，KLF7在CAD患者EAT炎癥中的作用尚未見報道。該研究通過體內(nèi)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察KLF7對脂肪細(xì)胞分化的作用，旨在探討KLF7在CAD的發(fā)生發(fā)展中的作用，為闡明CAD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供初步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究納入2018年1月-2019年10月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科行非體外循環(huán)冠狀動脈搭橋術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)的30例CAD患者。其余30例行房間隔缺損修復(fù)或瓣膜置換手術(shù)而無冠狀動脈狹窄的患者作為對照組，患者資料列于表1。

1.1.1診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照我國衛(wèi)生部發(fā)布的《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)》(2010年版)以及2011年美國心臟聯(lián)合會(American Heart Association，AHA)冠心病診療指南。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)組：① 年齡 40～75(63.8±4.2)歲 ；② 符合CAD的診斷標(biāo)準(zhǔn)需行CABG患者；③ 民族為漢族。對照組：① 年齡在40～75(66.5±7.3)歲；② 冠狀動脈造影陰性且需行瓣膜置換手術(shù)(瓣膜為退行性變)患者；③ 民族為漢族。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ① 合并有糖尿病或糖耐量異常者；② 其他類型心臟病，如風(fēng)濕性心臟病患者；③ 患有惡性腫瘤者；④ 近期有創(chuàng)傷、外科手術(shù)者；⑤ 急、慢性感染者；⑥ 長期肝、腎等臟器疾病及其它內(nèi)分泌疾病。

1.2 儀器與試劑人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞和3T3-L1前脂肪細(xì)胞均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。RNA提取試劑和qRT-PCR 反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa 公司(日本)。Western blot試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1臨床資料 包括患者年齡、性別、身高、體質(zhì)量、病程、大生化、心肌酶、超敏C反應(yīng)蛋白、心臟彩超及頸動脈彩超等。

1.3.2樣本采集 麻醉后1 h，從左心室前壁(與患病段相鄰)收集EAT雙眼樣品(平均重量0.5～1.0 g)。將所有樣品立即保存在RNA穩(wěn)定劑中，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究符合石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院醫(yī)學(xué)倫理委員會程序并通過審批(編號：2014-072-01)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng) 在含有10%FBS(美國Gibco公司)，青霉素(100 μg/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基(美國HyClone公司)中培養(yǎng)THP-1細(xì)胞及3T3-L1前脂肪細(xì)胞，在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃的含5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱。將THP-1細(xì)胞以2×105個/孔細(xì)胞的密度接種在12孔板中，并使用100 μg/ml phorbol-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(美國Invitrogen公司)持續(xù)培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞與20 ng/ml 干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)(美國Gibco公司)和10 ng/ml LPS(美國Sigma-Aldrich公司)孵育24 h以誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞。

1.3.4qRT-PCR檢測相關(guān)因子 根據(jù)制造商的說明書，使用TRIzol(美國賽默飛世爾科技公司)提取CAD EAT，非CAD EAT和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組的總RNA。使用NanoDrop 1000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)測量RNA的純度和濃度。使用帶有基因組脫氧核糖核酸(gDNA)(美國TaKaRa Bio公司)的PrimeS-cript RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，每個樣品分離出500 ng總RNA。使用7500實(shí)時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)及QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行定量實(shí)時PCR(qRT-PCR)。EAT中KLF7、APN、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平，M1型巨噬細(xì)胞中APN、MCP-1、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)，以及3T3-L1前脂肪細(xì)胞中APN、KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA及脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物PPARγ、C/EBPα、FABP4，表1列出了引物序列。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用比較循環(huán)時間法計算靶基因轉(zhuǎn)錄物的相對量。通過比較臨界閾值方法計算每個組織和對照樣品的相對表達(dá)水平。

1.3.5Western blot檢測相關(guān)因子蛋白表達(dá) 將30～50 μg的總蛋白質(zhì)在100℃下加熱10 min，使用10%凝膠上的SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。遵循一抗通過與綴合有HRP的適當(dāng)?shù)亩狗跤⑼ㄟ^使用Pierce Fast.Western Blot Kit(美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測。該研究中使用的抗體是β-肌動蛋白(ZSGBBIO，CHINA)KLF7(美國Abcam公司)，檢測兩組中KLF7、NF-κB信號通路關(guān)鍵因子以及脂肪分化細(xì)胞標(biāo)志因子蛋白表達(dá)水平。

1.3.6KLF7小干擾RNA(siRNA)的轉(zhuǎn)染 siRNA由Gene-Pharma(上海)設(shè)計和合成。按照說明書將KLF7 siRNA或陰性對照通過Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染。24 h后通過qRT-PCR評估轉(zhuǎn)染的KLF7 siRNA的水平來驗(yàn)證轉(zhuǎn)染。表1列出了本研究中使用的siRNA序列。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料和生化指標(biāo)兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)以及甘油三酯(triglycerides，TG)等差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但超敏C反應(yīng)蛋白CAD組較non-CAD組升高，脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)降低(P<0.05)(表2)。

2.2 KLF7在CAD患者EAT中的表達(dá)水平檢測KLF7 mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對照組EAT中的表達(dá)(P<0.001)，見圖1A。通過Western blot驗(yàn)證KLF7蛋白表達(dá)(P<0.05)，見圖1B。

表1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物序列列表

表2 兩組一般資料和生化指標(biāo)

2.3 EAT炎癥信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平在EAT中，CAD組APN表達(dá)水平低于non-CAD組，IL-6、TNF-α、JNK和NF-κB mRNA表達(dá)水平高于non-CAD組(P<0.05)，見圖2。

2.4 EAT中的巨噬細(xì)胞的鑒別為了確定巨噬細(xì)胞類型在EAT炎癥過程中的重要性，使用炎性細(xì)胞標(biāo)記CD68來檢測巨噬細(xì)胞的存在。CAD患者EAT中CD68的mRNA水平高于non-CAD組(圖3)。

2.5 KLF7在人類THP-1衍生的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)并由炎癥刺激誘導(dǎo)課題組用特定的KLF7 siRNA(siRNA 1-2)或si-NC瞬時轉(zhuǎn)染THP-1衍生的M1型巨噬細(xì)胞。如圖4A所示，與si-NC相比，si-KLF7-1和si-KLF7-2能夠降低KLF7的表達(dá)，si-KLF7-2組最低。為了驗(yàn)證KLF7 mRNA的轉(zhuǎn)染效率，測定在轉(zhuǎn)染相同量si-KLF7由THP-1衍生的M1型巨噬細(xì)胞裂解物中KLF7的蛋白表達(dá)。結(jié)果與本研究在mRNA水平上顯示的結(jié)果相同(圖4B)。LPS以時間依賴和劑量依賴的方式影響KLF7 mRNA的表達(dá)(圖4C、D)。LPS以時間依賴性和劑量依賴性方式進(jìn)一步誘導(dǎo)KLF7的表達(dá)(圖4E)。KLF7在人類THP-1衍生的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，并在體外由炎性刺激誘導(dǎo)，這表明它可能調(diào)控這些刺激巨噬細(xì)胞激活的相關(guān)因子。

圖1 KLF7在兩組EAT中的表達(dá)

圖2 炎癥信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)差異

圖3 EAT中巨噬細(xì)胞CD68的表達(dá)與non-CAD組比較：****P<0.000 1

圖4 KLF7在THP-1衍生的M1型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

2.6 KLF7促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化成熟分別將KLF7模擬物和NC(對照組)轉(zhuǎn)染到3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，于轉(zhuǎn)染后每天檢測FLF7表達(dá)，其表達(dá)趨勢見圖5A。轉(zhuǎn)染處理24 h后檢測APN、IL-6、MCP-1 mRNA及脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志物過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)mRNA的相對表達(dá)水平，顯示KLF7模擬物組中APN表達(dá)降低，IL-6、MCP-1、PPARγ、C/EBPα和FABP4表達(dá)升高(P<0.05)(圖5B)。

3 討論

CAD在世界范圍內(nèi)發(fā)病率很高。CAD可導(dǎo)致心肌缺血、心肌梗塞、心力衰竭、并最終導(dǎo)致死亡。CAD是一種嚴(yán)重的慢性疾病，其特征是冠狀動脈進(jìn)行性動脈粥樣硬化閉塞，導(dǎo)致心肌供需之間不匹配[11]。動脈粥樣硬化被描述為中型動脈內(nèi)膜的低度炎癥狀態(tài)，可因?yàn)楸娝苤奈ｋU因素(例如高血壓、糖尿病、肥胖癥和血脂異常)而產(chǎn)生。EAT被認(rèn)為是一種在心包內(nèi)的異位脂肪[12]。EAT分泌的脂肪因子可以直接從血管周圍脂肪擴(kuò)散到血管內(nèi)膜，引起炎癥發(fā)生，最終發(fā)展為動脈粥樣硬化[13]。脂肪組織駐留的免疫細(xì)胞幾乎包括所有類型的免疫細(xì)胞，即巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。

圖5 KLF7促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化成熟

Kruppel樣因子(Kruppel-like factors, KLFs)屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，KLFs可調(diào)節(jié)哺乳動物組織中的多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、分化、存活以及組織發(fā)育[14]。KLFs還控制免疫細(xì)胞的功能，例如巨噬細(xì)胞，它們參與了心血管疾病和代謝疾病的炎癥過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CAD患者EAT組織中miR-455b-3p通過下調(diào)APN的表達(dá)從而促進(jìn)EAT炎癥因子釋放。本研究顯示，CAD患者EAT組織中KLF7 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于non-CAD組，炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6 JNK、NF-κB mRNA表達(dá)水平也高于non-CAD組，而具有抗炎作用的APN卻低于non-CAD組，以上結(jié)果提示炎癥狀態(tài)與KLF7的表達(dá)水平相關(guān)。本研究進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)誘導(dǎo)人類THP-1衍生的巨噬細(xì)胞，顯示LPS以時間依賴性和劑量依賴性方式誘導(dǎo)KLF7的表達(dá)。通過體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)KLF7能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。EAT在炎癥狀態(tài)下，可能通過影響KLF7的表達(dá)，進(jìn)而引起脂肪組織炎癥因子轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化成熟，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。