黃方杰，蘇仕新，成玉嫦

[1.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)甲乳外科,廣東 深圳 518000；2.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)腎內(nèi)科,廣東 深圳 518000]

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，具有較高的病死率[1]。早期乳腺癌臨床癥狀不明顯，容易造成誤診、漏診，導(dǎo)致錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)[2]。探究臨床診斷及病理監(jiān)測的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)乳腺癌的治療及預(yù)后具有重要意義。miRNA為非編碼的小分子RNA，其通過結(jié)合靶基因的3’UTR區(qū)影響mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制蛋白質(zhì)翻譯，是理想的腫瘤標(biāo)記物。miR-129家族成員在人類癌癥中發(fā)揮著重要作用[3]，且與多種惡性腫瘤(如宮頸癌、食管癌、直腸癌等)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)miR-129在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，可能與乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲有關(guān)[5]。然而，目前關(guān)于miR-129在乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移中的作用尚不明確，因此本研究選取人乳腺癌SKBR3、AU565細(xì)胞系作為研究對(duì)象，探討miR-129對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并研究其潛在的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

SKBR3和AU565細(xì)胞系由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供，所有細(xì)胞株均在37 ℃、10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的PRMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。采用等分冷凍法進(jìn)行保存，可供6個(gè)月內(nèi)使用。

1.2 試劑與儀器

檸檬酸鈉溶液購自北京普析生物科技有限公司；PBS購自濰坊中匯化工有限公司；乙醇購自濟(jì)南樂俊化工有限公司；氯仿購自上海淵諾試劑有限公司；異丙醇購自天津大茂試劑有限公司；胎牛血清購自北京亞米生物科技有限公司；去離子水由天津科技大學(xué)制備。Control-mimic、miR-129-mimic、miR-mimic-shRNA質(zhì)粒、miR-129引物及U6引物均由南京金斯瑞合成。

Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)、ECL顯色液購自Agencourt AMPure XP；RNA提取試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；離心機(jī)購自上海盧湘儀器有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒、流式細(xì)胞儀、恒溫培養(yǎng)箱、凝膠成像系統(tǒng)及全自動(dòng)酶標(biāo)儀均購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SKBR3或AU565細(xì)胞系均勻鋪在6孔板中，待生長密度達(dá)60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為Control-mimic組、miR-129-mimic組、miR-129-mimic+miR-mimic-shRNA組。利用Lipofectamine 2000試劑盒將SKBR3、AU565細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染Control-mimic、miR-129-mimic和miR-129-mimic+miR-mimic-shRNA，所有轉(zhuǎn)染步驟均按照試劑盒說明書執(zhí)行，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.3.2 RT-PCR檢測細(xì)胞系中miR-129的表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞中的RNA，采用microRNA莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，條件設(shè)置為：預(yù)變性90 ℃、5 min，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，延伸70 ℃、30 s，共 40個(gè)循環(huán)，以上所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。miR-129上游引物序列為3’-GATACTCACTTTTTGCGGTCT-5’，下游引物序列為3’-GTGCAGGGTCCGAGGT-5’；U6上游引物序列為3’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-5’，下游引物序列為 3’-CAGGGGCCATGCTAATCTT-5’。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞以3×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種150 μL細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后加入質(zhì)粒處理，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱過夜。培養(yǎng)結(jié)束后，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀檢測各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞生長速率。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用PBS將細(xì)胞制成混懸液，各取5×105個(gè)細(xì)胞置于6孔板中孵育，確保細(xì)胞融合率達(dá)到100%，用槍頭在培養(yǎng)皿中進(jìn)行劃痕，PBS洗滌后，置于不含血清的PRMI-1640培養(yǎng)基中，拍照記錄初始劃痕寬度，然后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，再次拍照記錄培養(yǎng)后劃痕寬度，兩次劃痕的差值即為細(xì)胞的遷移距離。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 采用預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室，取200 μL細(xì)胞鋪于Transwell小室的上室，在下室加入500 μL含15%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，使用甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后，每個(gè)小室取5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞侵襲能力。

1.3.6 靶向基因預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng) 采用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測miR-129與Twist1的3’-UTR端是否存在結(jié)合位點(diǎn)。使用Promega熒光素酶檢測試劑盒對(duì)Control-mimic組與miR-129-mimic組細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測：12孔板每孔加入細(xì)胞裂解液250 μL，室溫振蕩15 min，吸取20 μL細(xì)胞裂解液，加入100 μL雙熒光素酶底物后立即放入生物發(fā)光檢測儀檢測Firefly熒光強(qiáng)度。在原管加入100 μL Stop&Glo Reagent，輕柔混勻后立即檢測Renilla熒光強(qiáng)度。

1.3.7 Western blot檢測miR-129對(duì)Twist1蛋白的影響 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑(Roche Molecular Biochemicals)的細(xì)胞裂解液(20 nm Tris-HCl pH 7.4,5 mmol/L EDTA,1% Trition X-100,150 mmol/L NaCl,1% DTT)進(jìn)行裂解，提取總蛋白，進(jìn)行SAS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，然后分別用相應(yīng)的一抗、二抗對(duì)PVDF膜進(jìn)行孵育，充分洗滌后加入ECL底物顯色液，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。采用ImageJ測定Control-mimic組與miR-129-mimic組中Twist1蛋白的灰度值并統(tǒng)計(jì)表達(dá)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-129的表達(dá)水平檢測

相比于Control-mimic組，miR-129-mimic組SKBR3細(xì)胞和AU565細(xì)胞中miR-129的表達(dá)水平顯著上調(diào)(t=3.45、3.21，P<0.05)，見圖1。

2.2 miR-129-mimic抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖

SKBR3和AU565細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-mimic后，miR-129-mimic組細(xì)胞的增殖能力顯著低于Control-mimic組(P<0.01)；miR-129-mimic+miR-mimic-shRNA組逆轉(zhuǎn)了miR-129-mimic導(dǎo)致的細(xì)胞增殖能力降低(P<0.01)，但與Control-mimic組相比，其增殖能力無明顯變化(P>0.05)，見圖2。

2.3 miR-129-mimic抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲

與Control-mimic組比較，miR-129-mimic組中SKBR3和AU565細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-129具有抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的作用，見圖3。

*：與Control-mimic組比較，P<0.05

a：SKBR3細(xì)胞增殖能力；b：AU565細(xì)胞增殖能力 **：與miR-129-mimic組比較，P<0.01

a：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果；b：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 *：與Control-mimic組比較，P<0.05;**:與Control-mimic組比較，P<0.01

2.4 miR-129靶向調(diào)控Twist1

生物信息學(xué)軟件分析顯示，miR-129與Twist1的3’-UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-129-mimic組中WT-3’Twist-UTR的熒光素酶活性明顯低于Control-mimic組(P<0.01)；而miR-129-mimic組中Mut-3’Twist-UTR的熒光素酶活性與Control-mimic組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

2.5 上調(diào)miR-129對(duì)Twist1蛋白的影響

在SKBR3、AU565細(xì)胞中，與Control-mimic組比較，miR-129-mimic組SKBR3細(xì)胞和AU565細(xì)胞中Twist1蛋白水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖6。

**：與Control-mimic組比較，P<0.01

**：與Control-mimic組比較，P<0.01

3 討論

我國乳腺癌患者約占全球乳腺癌患者的12%[6]。乳腺癌侵襲性強(qiáng)、惡性程度高，并且其組織學(xué)異質(zhì)性大，患者預(yù)后往往不夠理想[7]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因治療成為了乳腺癌治療的新方向[8]。但乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展受多種分子機(jī)制的影響，因此，研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)其治療具有重要意義。

miRNAs是一類長度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與內(nèi)源性mRNA堿基配對(duì)抑制靶基因的表達(dá)來發(fā)揮其生物學(xué)功能，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。miR-129為一種常見的miRNAs，可影響炎癥因子及血管上皮細(xì)胞的生成，且對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等過程均具有一定的調(diào)控作用[10]。有研究表明miR-129在膀胱癌、肝細(xì)胞癌及甲狀腺癌中呈低表達(dá)[11]。本研究中miR-129-mimic組SKBR3和AU565細(xì)胞D的增殖能力明顯低于Control-mimic組，說明miR-129在一定程度上能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞的遷移與侵襲是影響惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵，出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞遷移的乳腺癌患者往往具有較高的耐藥性，治療較為復(fù)雜，生存期短。腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲與上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞失去極性，表現(xiàn)出一定的遷移性，進(jìn)而侵襲正常組織[12-14]。賀炳勝等[15]研究表明，miR-129能夠在一定程度抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲，進(jìn)而抑制病情的進(jìn)展，延長患者的生存期。本研究結(jié)果顯示，miR-129-mimic能夠使人乳腺癌細(xì)胞SKBR3、AU565的遷移及侵襲能力明顯下降，說明miR-129在一定程度上能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，對(duì)腫瘤的發(fā)展起到一定的調(diào)控作用。

研究表明miR-129對(duì)乳腺癌存在多種調(diào)控途徑。miR-129可通過調(diào)控Notch信號(hào)通路影響乳腺癌腫瘤干細(xì)胞自我更新的能力，也可靶向CAMK2N1干預(yù)乳腺癌細(xì)胞增殖[16-17]。但miR-129對(duì)乳腺癌遷移與侵襲的作用機(jī)制尚不明確，且其靶點(diǎn)尚未發(fā)現(xiàn)。本研究通過生物信息學(xué)方法證實(shí)了miR-129與Twist1的3’-UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，且miR-129中Twist1的熒光素酶活性明顯下降；進(jìn)一步通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-129-mimic的SKBR3和AU565細(xì)胞中Twist1表達(dá)水平降低。因此推測miR-129通過靶向調(diào)節(jié)Twist1發(fā)揮生物學(xué)作用。

綜上所述，miR-129與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其能夠在一定程度上靶向調(diào)節(jié)Twist1進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，是乳腺癌診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。