張貴會 歐陽輝 黃 榆 余雄偉 李述剛

(1. 扎魯特旗市場檢驗檢測中心，內蒙古 通遼 029100 ; 2. 合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230601; 3. 湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068; 4. 武漢旭東食品有限公司，湖北 武漢 430000)

南瓜(PumpkinCushaw)屬葫蘆科，一年生蔓生草本植物，富含功能性脂質，是一種優(yōu)質的油料資源，同時含有總酚、植物甾醇、維生素、礦物質等多種生物活性成分[1]，因具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血壓、緩解前列腺和抗癌等健康保護價值而被廣泛關注[2]。

熱加工是常見的堅果品質提升加工方式，不同的熱加工處理對堅果脂質和蛋白質有不同程度的影響，會改變堅果的食用品質[3]。目前，堅果常用的熱加工方式主要是烤箱烤制，其傳熱效率較低、熱量損失和能源消耗較高，不利于堅果加工產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。與烤箱烤制相比，微波具有高效省時、操作簡單和安全無毒害等特點，在堅果加工領域中的應用逐漸擴大[4]。空氣油炸作為一種新型、健康的油炸方式，通過熱空氣中的油滴包裹原料，使其不斷運動促進兩相之間均勻接觸，逐漸脫水后產(chǎn)生油炸制品特有的形態(tài)?？諝庥驼ê笪锪涎趸饔幂^小，能夠減少有害物質的生成、保留物料必需的植物化學物質和營養(yǎng)，深受眾多消費者的喜愛[5-7]。此外，南瓜籽因富含蛋白質與不飽和脂肪酸，在加工過程中極易受到光、氧、熱等環(huán)境影響而發(fā)生品質劣變。目前關于空氣油炸和微波對南瓜籽脂質、風味、蛋白質結構和消化特性的研究尚未見報道。研究擬以酸價、過氧化值、脂肪酸組成、蛋白質結構特征、消化特性和揮發(fā)性成分等為指標，考察空氣油炸和微波處理對南瓜籽仁品質的影響，以期為南瓜籽烘焙加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜籽:新疆產(chǎn)地；

氫氧化鈉、鹽酸、福林酚、碳酸鈉、溴化鉀、無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：高級純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

差示掃描量熱儀：DSC1型，梅特勒—托利多國際有限公司；

掃描電子顯微鏡：SU-8010型，日本日立公司；

高速冷凍離心機：Micro-21R型，美國Thermo Fisher公司；

氣相質譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國安捷倫科技有限公司；

傅里葉變換紅外光譜：Nicoletis-50型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

電泳儀：DYY-8C型，北京六一生物科技有限公司；

熒光分光光度計：F-4600型，日本日立公司；

微波爐：MM721NG1-PW型，佛山美的集團股份有限公司；

空氣油炸鍋：FL26-VF171型，山東九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 選擇無病蟲害和機械損傷的南瓜籽脫殼取仁后，隨機分成3組，其中2組分別進行微波烘烤和空氣油炸處理，1組為對照組，每份樣品200 g。

(1) 微波處理南瓜籽：采用微波爐700 W處理0，1，3，5，7，9 min，真空包裝袋密封并于-20 ℃保存。

(2) 空氣油炸南瓜籽：采用空氣油炸鍋160 ℃處理0，3，4，5，6，7 min，真空包裝袋密封并于-20 ℃保存。

1.3.2 基本成分測定

(1) 蛋白質含量：參照GB 5009.5—2016。

(2) 脂肪含量：參照GB 5009.6—2016。

(3) 水分含量：參照GB 5009.3—2016。

(4) 多糖含量：采用苯酚—硫酸法。

(5) 總酚含量：采用福林酚法。

(6) 黃酮含量：參照SZDB/Z 349—2019。

1.3.3 微觀形貌測定 通過掃描電子顯微鏡，分別測定未處理、微波處理5 min和空氣油炸4 min后南瓜籽的表面及橫截面形貌。

1.3.4 油脂脂肪酸組成測定 參照Wang等[8]的方法。采用Agilent7890A-5975C氣相質譜聯(lián)用儀進行測定，使用NIST 2017質譜庫，匹配度≥85%鑒定脂肪酸組分，并以峰面積歸一化法進行脂肪酸定量。

1.3.5 酸價和過氧化值測定

(1) 酸價：參照GB 5009.229—2016。

(2) 過氧化值：參照GB 5009.227—2016。

1.3.6 油脂揮發(fā)性物質測定 根據(jù)Wang等[9]的方法。色譜柱升溫程序：柱溫箱初始溫度40 ℃，5 ℃/min升溫至200 ℃，保持2 min，5 ℃/min升溫至230 ℃。質譜檢測器條件：電子電離(EI)模式下，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍40～450。使用NIST 2017質譜庫，匹配度≥85%鑒定揮發(fā)性化合物。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定 用無水乙醇配制不同質量濃度(10～80 mg/mL)的南瓜籽油溶液，取200 μL油樣與3 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合，暗處反應30 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液，測定517 nm 處吸光度，并按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

R1——DPPH自由基清除率，%；

A——上清液吸光值；

1.3.8 ABTS自由基清除能力測定 將7.0 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混勻，暗處反應16 h，用去離子水稀釋上述混合液稀釋到734 nm處測量的吸光度為0.70±0.05。用無水乙醇配制不同質量濃度(10～80 mg/mL)的南瓜籽油溶液，取200 μL 油樣與3 mL稀釋后的ABTS+溶液混勻，暗處反應30 min，測定734 nm處吸光度，以去離子水作為對照，按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

R2——ABTS自由基清除率，%；

A——上清液吸光值；

A1——去離子水吸光值。

1.3.9 蛋白質提取 參照王煒清等[10]的方法。

1.3.10 蛋白質理化特性測定

(1) 分子量：配制1 mg/mL的樣品溶液，分離膠為12%，濃縮膠為4%[11]，電壓為130 V，電泳時間為50 min，用考馬斯亮藍R-250染色，并用10%乙酸和5%乙醇脫色。

圖6給出了t=45 s時刻不同傾角和漿液擴散方位角時的漿液壓力離注漿孔距的變化曲線。對圖6進行分析可知：裂隙傾角和漿液擴散方位角對漿液壓力的空間分布特征產(chǎn)生顯著影響，呈現(xiàn)明顯的空間非線性、非均勻性特征。

(2) 巰基含量：采用DNTB比色法[11]。

1.3.11 蛋白質結構特性測定

(1) 傅里葉紅外光譜：根據(jù)Lin等[12]的方法。

(2) 內源性熒光光譜：根據(jù)Wu等[13]的方法。激發(fā)波長283 nm，發(fā)射波長300～400 nm。

1.3.12 蛋白質消化特性測定

(1) 消化率：采用OPA法[14]。

(2) 消化產(chǎn)物：根據(jù)Li等[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，通過方差分析(AVOVA)和鄧肯多重比較，確定不同加工方式是否存在差異，采用SPSS 17.0分析軟件分析數(shù)據(jù)，采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 南瓜籽種仁理化成分分析

由表1可知，熱處理后南瓜籽水分含量隨加熱時間的延長逐漸降低，含油率逐漸上升，其中空氣油炸對南瓜籽水分含量及油脂含量影響更迅速，可能是由于空氣炸鍋內形成循環(huán)熱流能夠傳遞更多熱量，并迅速帶走南瓜籽中的水分。同時，水分蒸發(fā)伴隨油脂滲入，水分快速蒸發(fā)時，油脂會隨之滲入水分蒸發(fā)后的空隙中，從而提高脂肪含量。多糖、多酚和黃酮含量隨處理時間的延長呈先增大后降低趨勢，并分別在4，5 min時達到最大值。這可能是因為隨著加熱時間的延長，水分振動越劇烈，對細胞組織和結構造成破壞，油脂從細胞間溢出同時伴隨大量細胞內容物的滲出導致其含量增大[16]；此外，高溫條件下發(fā)生的生化反應如美拉德反應促進了生物活性物質的生成，同時影響了物質的存在狀態(tài)(由結合態(tài)轉為游離態(tài))，提高了多糖、多酚和黃酮含量，但長時間加熱，活性物質將發(fā)生熱降解使得含量下降[17]。綜上，微波處理5 min和空氣油炸4 min可以提高南瓜籽營養(yǎng)成分的釋放并促進多糖、多酚和黃酮含量的上升，且空氣油炸加熱效率明顯優(yōu)于微波處理。

表1 微波處理與空氣油炸對南瓜籽基本理化成分的影響?

2.2 南瓜籽種仁微觀結構變化

由圖1可知，未處理南瓜籽細胞結構較為整齊，分布致密，而空氣油炸和微波處理后，南瓜籽細胞結構被破壞，出現(xiàn)較大孔隙，表面組織由有序的四邊形變?yōu)闊o序的不規(guī)則形狀，對比橫截面圖可知，南瓜籽內部細胞致密結構被破壞，細胞壁出現(xiàn)皺縮甚至破裂。這可能是由于高溫處理后，南瓜籽水分損失較快，蒸發(fā)時快速流動導致細胞出現(xiàn)多孔，同時其多孔結構受到毛細管收縮應力的作用而產(chǎn)生皺縮現(xiàn)象。這進一步驗證了熱處理引起南瓜籽細胞結構破壞可能是導致水分、含油量等理化指標變化的重要原因。

從左至右依次為對照組、空氣油炸、微波處理；從上至下依次為表面200×、表面500×、截面200×、截面500×

2.3 對南瓜籽脂質的影響

2.3.1 油脂脂肪酸組成 由表2可知，熱處理對南瓜籽脂肪酸組成影響不顯著：空氣油炸處理后，辛酸和葵酸已無法檢測到，可能是由于空氣油炸時的局部高溫使油脂逐漸降解；微波處理后南瓜籽油的油酸、亞油酸含量分別下降了0.26%，0.52%，而空氣油炸后含量分別上升了0.79%，0.23%，可能是因為南瓜籽中部分水分蒸發(fā)后，形成了允許油炸油滲透到空隙中的孔隙，油炸油和南瓜籽油相互交換，與Valdés等[18]的結果一致。微波處理對油脂脂肪酸組成的影響不大，未處理和微波處理后的南瓜籽油的脂肪酸組成均滿足國標要求，其不飽和脂肪酸含量始終維持在80%左右。綜上，空氣油炸和微波處理不僅能夠有效促進南瓜籽中脂質的釋放，并對南瓜籽油不飽和脂肪酸含量影響較小，不會降低油脂品質。

表2 空氣油炸和微波處理對南瓜籽油脂肪酸組成的影響

2.3.2 油脂酸價和過氧化值 由圖2(a)可知，空氣油炸和微波處理會導致酸價輕微增大，從0.54 mg/g分別增至0.76，0.68 mg/g，可能是由于油脂含有的極性脂肪酸分子熱處理后產(chǎn)生熱效應，從而導致磷脂和三酰基甘油被分解為自由基和游離脂肪酸[19]。由圖2(b)可知，空氣油炸和微波處理后過氧化值增大，從2.07 meq/kg分別增至3.13，2.64 meq/kg，可能是因為高溫能加速自由基的生成，導致過氧化值增大，但仍低于商業(yè)食用植物油的一般推薦值(<20 meq/kg)[20]。綜上，微波處理和空氣油炸不會破壞南瓜籽油的新鮮度。熱處理后南瓜籽脂質均發(fā)生不同程度的氧化，其中空氣油炸南瓜籽氧化程度相較于微波處理更高，可能是由于空氣油炸溫度更高以及多酚等抗氧化物質含量的下降程度更高，導致其脂質氧化程度較高。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.3 抗氧化能力 由圖3可知，3種南瓜籽油脂的DPPH自由基、ABTS自由基清除率均隨樣品濃度的增大而提高，且相同質量濃度下，DPPH自由基、ABTS自由基清除率表現(xiàn)為空氣油炸與微波處理的大于對照組，并存在一定差異，其中微波處理后油脂的自由基清除率在10～80 mg/mL范圍內最大，當樣品質量濃度為80 mg/mL 時，DPPH自由基和ABTS自由基清除率分別為64.88%，92.96%，表現(xiàn)出最強的抗氧化能力，這在一定程度上可以解釋微波處理南瓜籽仁酸價和過氧化值較低的原因?？寡趸芰Σ町惪赡苁怯捎跓崽幚砗?，具有抗氧化性的酚類等物質隨油溢出[21]及內源性酶活性變化[22]所致。綜上，油炸在一定程度上可以提高食物的抗氧化性，與Kita等[23-24]的結論一致。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 油脂揮發(fā)性物質

由表3可知，空氣油炸和微波處理后南瓜籽油脂揮發(fā)性物質種類增多，均檢出14種主要揮發(fā)性成分，包括烷烴類、烯烴類、酮類、芳香烴類、醛類、醇類、雜環(huán)類7類化合物，新鑒定出苯甲醛、3-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪和2-戊基呋喃5種成分，且其含量均呈上升趨勢。吡嗪類具有焙烤堅果的典型香氣，主要為美拉德反應產(chǎn)物[25]。2-戊基呋喃具有豆香、清香及蔬菜芳香[26]。戊醛、己醛、壬醛含量呈增加趨勢，主要來自于脂質氧化，呈現(xiàn)脂肪、烘烤堅果味。醇類物質的降解可能是氧化轉化成了醛類物質[27]。乙酸幾乎存在于所有的植物種子中，具有醋酸味[28]。微波處理和空氣油炸后南瓜籽中揮發(fā)性物質變化表明熱處理過程中南瓜籽發(fā)生了脂質氧化與美拉德反應，進而改變了南瓜籽風味。此外，由于空氣油炸的氧化程度更深、加熱溫度更高，導致生成更多的脂質氧化產(chǎn)物和美拉德反應產(chǎn)物，如3-甲基-吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-戊基呋喃等雜環(huán)類化合物含量占比13.42%，顯著高于微波處理的(9.34%)，形成較強的堅果烘烤味。賴惠敏等[29]發(fā)現(xiàn)不同加熱方式對火麻仁中醛類和雜環(huán)類化合物種類和含量的上升有顯著促進作用。綜上，相較于未處理的南瓜籽，熱加工處理顯著改善了南瓜籽的風味特，且空氣油炸對南瓜籽風味的改善效果高于微波處理。

表3 空氣油炸和微波處理對南瓜籽油揮發(fā)性成分的影響?

2.5 對南瓜籽蛋白質的影響

2.5.1 蛋白質理化特性 由圖4(a)可知，各樣品中共觀察到4組條帶，其分子量分別為10～15，35，55，250 kDa，空氣油炸和微波處理后，10～15 kDa的條帶輕微變淺，說明空氣油炸和微波處理使這種蛋白組分結構發(fā)生了輕微聚集。Rebello等[30]研究表明，高溫擠壓會導致部分蛋白質之間通過二硫鍵聚集成大分子蛋白。由此推測空氣油炸和微波處理后的南瓜籽中蛋白質也發(fā)生了相似的聚集物，使得南瓜籽蛋白質10～15 kDa亞基顏色變淺。

由圖4(b)可知，空氣油炸和微波處理后，巰基含量增大，分別達16.61，17.67 μmol/g。這是因為空氣油炸和微波處理產(chǎn)生的高溫使蛋白質發(fā)生熱變性，結構展開，隱藏在內部的巰基暴露。但空氣油炸過程中更高的溫度會誘導蛋白質氧化，分子氧與游離巰基形成的硫醇自由基能夠誘導氧化繼續(xù)進行，導致巰基含量降低[31]。此外，蛋白質氧化過程中會發(fā)生巰基/二硫鍵的交換反應，多肽分子間或分子內二硫鍵的形成也會導致巰基的降低使其巰基含量低于微波處理后的[26]。綜上，加熱導致的二硫鍵的形成是造成南瓜籽蛋白聚集的重要因素。

圖4 空氣油炸和微波處理對南瓜籽蛋白質分子量分布、巰基含量的影響

2.5.2 蛋白質結構特性 由表4可知，對照組的β-折疊含量最高(61.14%)，其次是無規(guī)則卷曲(20.15%)、β-轉角(12.95%)及α-螺旋(5.77%)?？諝庥驼ê臀⒉ㄌ幚砗?，α-螺旋、β-折疊含量降低，無規(guī)則卷曲含量升高，表明熱處理后，蛋白質有序的結構變?yōu)闊o序、舒展的結構，因為熱處理可以通過增加蛋白質分子的動能，引起極性基團的振動，從而進一步影響二級結構的變化[27]。綜上，熱加工處理后部分蛋白質大分子鏈發(fā)生一定程度的降解，從而導致南瓜籽蛋白質二級結構發(fā)生無序化轉變。此外，由于在較長時間的微波處理過程中，微波輻射(微波非熱效應)和介電加熱(快速加熱效應)會影響基團的振動強度、鍵能和分布，造成南瓜籽中極性分子相互摩擦并迅速產(chǎn)生熱能，導致分子構象產(chǎn)生較大的變化[32]。

圖5 空氣油炸和微波處理對南瓜籽蛋白質

由圖5可知，所有樣品均在335 nm處出現(xiàn)最大吸收波長?？諝庥驼ê臀⒉ㄌ幚砗螅瑹晒鈴姸染l(fā)生不同程度下降，分別下降至712.6，403.7。其中，空氣油炸樣品下降程度最低，可能是因為加熱處理后，色氨酸等疏水基團與其他側鏈氨基酸結合，蛋白質分子聚集、交聯(lián)，空間結構變化導致發(fā)光基團周圍極性環(huán)境變化，氨基酸殘基被掩埋，同時熱處理后蛋白質柔性增加，發(fā)色團暴露于溶劑中，導致熒光猝滅從而引起熒光強度降低[33]，與Zheng等[34]的結論類似。同時，空氣油炸過程中過度的高溫可能使色氨酸殘基暴露過多，從而引起熒光強度增大，使其熒光強度高于微波處理后的。

2.5.3 蛋白質消化特性

(1) 消化率：由圖6可知，南瓜籽蛋白質經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，消化率表現(xiàn)出相似趨勢，胃蛋白酶消化階段在120 min時趨于平緩，胰蛋白酶消化階段在60 min時趨于平緩，可能是由于蛋白質的消化率與蛋白質溶解度成正比。Zhu等[35]研究表明，60～80 ℃熱加工處理1～5 min，可提高蛋清蛋白的消化率；Wang等[36]發(fā)現(xiàn)熱加工處理能夠提高谷蛋白的消化率。與對照組相比，空氣油炸和微波處理均提高了蛋白質的消化率，且微波處理的最高，可能歸因于蛋白質在熱處理過程中結構發(fā)生改變[37]，且熱處理溫度過高會使酶失活。據(jù)報道[20]，蛋白質有序結構的減少和無序結構的增加表明更多可展開結構和更高結構柔性的形成，可能有助于提高蛋白質的消化率。因此，空氣油炸和微波處理對南瓜籽消化率具有顯著提升作用。

圖6 空氣油炸和微波處理對南瓜籽蛋白質胃蛋白酶、胰蛋白酶消化的影響

(2) 消化產(chǎn)物：由圖7可知，GDEQQWEEEQEEEQER是對照組蛋白質消化產(chǎn)物中序列最長、得分最高(94.9)的多肽，質荷比為1 039.42?？諝庥驼ê臀⒉ㄌ幚砗?，消化產(chǎn)物中豐度最高的多肽發(fā)生改變，且其序列號均為IVQVDEDFEVLLPEKDEEER，質荷比分別為101.01，100.71，氨基酸組成數(shù)由16增加至20。韋恩圖顯示空氣油炸和微波處理后，對照組蛋白質消化產(chǎn)物共鑒定出80種獨有肽段，空氣油炸和微波處理分別為120，115種，表明空氣油炸和微波處理改變了蛋白質消化產(chǎn)物的種類，并提高了蛋白質消化率。

圖7 空氣油炸和微波處理對南瓜籽蛋白質消化產(chǎn)物的影響

3 結論

研究表明，空氣油炸和微波處理對南瓜籽基本理化特性影響顯著(P<0.05)，適當?shù)目諝庥驼ê臀⒉ㄌ幚砜梢燥@著提高南瓜籽油氧化穩(wěn)定性并改善其風味及消化特性。當空氣油炸4 min和微波處理5 min時，多糖、多酚和黃酮含量達到最大；脂質僅發(fā)生輕微氧化，其不飽和脂肪酸含量變化較小，保持在80%左右，同時生成了具有烘烤堅果味的吡嗪、呋喃類物質，抗氧化能力有所增強；蛋白質結構發(fā)生改變，消化率明顯提升，消化產(chǎn)物種類發(fā)生改變，分別產(chǎn)生120，115種獨有肽段。后續(xù)可以借助風味組學和肽組學技術，針對加工處理對南瓜籽仁風味和營養(yǎng)的分子機制展開深入研究。