張 磊， 劉礫子， 黃顯章， 高 麗， 李 超， 周 彪

(1.青海省干旱淺山造林試驗站 青海 西寧 810008；2.南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調節(jié)重點試驗室 河南 南陽 473004)

西紅花為鳶尾科番紅花的干燥柱頭，香氣馥郁。其性平、味甘，歸心、肝經(jīng)，有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的作用，適用于經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀滯、熱毒、抑郁、驚厥等[1，2]。研究表明西紅花所含有的主要活性物質為苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ，其中苦番紅花素是其苦味的物質基礎，而西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ是其色澤的基礎，這3個成分通常被用來衡量其質量優(yōu)劣[2-11]?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版(一部)以苦番紅花素含量、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量之和作為評價指標，對其品質進行了初步分析[1]。

西紅花主要產(chǎn)于伊朗、印度、西班牙。西紅花在1700多年前通過印度傳入西藏，所以被稱為“藏紅花”。上海崇明、浙江、江蘇、河南南陽和許昌等地已形成了一定的種植規(guī)模。近些年，青海開始引進種植，但是其有效成分含量尚未有相關試驗。本試驗基于藥典方法，測定青海產(chǎn)西紅花中3個有效成分的含量，初步評價其質量，以期為青海產(chǎn)西紅花的質量控制提供基礎數(shù)據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

本試驗所用的主要儀器信息見表1。

表1 試驗所用儀器相關信息

1.2 材料

3個對照品均由成都格利普生物科技有限公司提供：苦番紅花素(純度>98.79%、批號19092701)，西紅花苷-Ⅰ(純度>98.00%、批號17121301)，西紅花苷-Ⅱ(純度>98.00%, 17121107)。乙腈(色譜純、天津市科密歐化學試劑有限公司)，水(純凈水、華潤怡寶飲料有限公司)，其他均為分析純。3批西紅花樣品均產(chǎn)自青海，經(jīng)本課題組黃顯章教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent EclipseXDB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；在表2中給出了梯度洗脫的特定條件。在表2所示色譜條件下進樣，3個有效成分的峰型較好，雜峰干擾小，分離度優(yōu)良。苦番紅花素在15 min左右出峰，西紅花苷-Ⅰ在31 min左右出峰，西紅花苷-Ⅱ在37 min左右出峰。

表2 色譜條件

2.2 對照品溶液的制備

準確稱取各對照品的粉末，加入25 mL棕色容量瓶，加入稀釋的乙醇，使其混合均勻，獲得混合對照品溶液(苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的濃度依次為240 μg·mL-1、320 μg·mL-1、240 μg·mL-1)。封口膜密封，避光保存。對照品色譜圖如圖1所示。

1.苦番紅花素；2.西紅花苷-Ⅰ；3.西紅花苷-Ⅱ

2.3 供試品溶液的制備

將干燥的西紅花樣品粉碎，過三號篩。然后，準確稱量10 mg的粉體，然后倒入50 mL棕色容量瓶，加適量稀釋的乙醇，冰浴超聲20 min。冷卻到室溫后，加入稀釋的乙醇至刻度，搖勻，用一次性無菌注射器抽取樣品溶液，使用0.22 μm過濾器過濾至樣品瓶中，即得。樣品色譜圖如圖2所示。

1.苦番紅花素；2.西紅花苷-Ⅰ；3.西紅花苷-Ⅱ

2.4 線性關系考察

取配制的對照品溶液0.05 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入稀釋的乙醇，以獲得不同濃度的對照溶液，然后進行樣品分析。標準曲線是以有效組分的濃度為橫坐標，以其峰面積為縱坐標。結果顯示：3種有效組分的峰面積均與其濃度有較好的線性關系(見表3)。

表3 線性關系考察結果

2.5 精密度試驗

用一組對照溶液進行6次測試，獲得各有效組分峰面積的 RSD。3個有效成分峰面積的RSD依次為：苦番紅花素為0.30%、西紅花苷-Ⅰ 為1.14%、西紅花苷-Ⅱ 為1.91%。結果顯示，該測試設備具有較高的精度。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精確稱取10 mg西紅花的粉末，按2.3節(jié)中列出的步驟配制試樣溶液，依次在0、2、4、6、8、12 h測定含量，求各有效成分峰面積的RSD值。由結算結果可知，3種活性組分峰面積的RSD依次為：苦番紅花素0.29%、西紅花苷-Ⅰ 1.47%、西紅花苷-Ⅱ 0.64%，表明供試品溶液避光保存12 h內各指標成分穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

將6份10 mg的西紅花粉末精密稱重，按2.3節(jié)中列出的方法配制試樣溶液，進儀器測試，求各有效成分含量的RSD。結果顯示所測樣品中3個有效成分含量的RSD依次為：苦番紅花素1.98%、西紅花苷-Ⅰ 1.06%、西紅花苷-Ⅱ 1.75%，表明本研究具有較好的重現(xiàn)性。

2.8 加樣回收率試驗

取6份5 g左右的西紅花粉末精確稱重，將其置于50 mL容量瓶中，加入適當?shù)膶φ杖芤海⒂贸暡ㄟM行處理，然后進樣檢測，并計算其回收率(見表4)。3個有效成分的平均回收率和RSD分別為：苦番紅花素98.71%、1.38%，西紅花苷-Ⅰ 98.91%、1.91%，西紅花苷-Ⅱ 100.10%、1.51%，表明該方法準確度良好。

表4 加樣回收率試驗結果

2.9 樣品含量測定

分別稱取收集的3批青海產(chǎn)西紅花樣品粉末約10 mg，按2.3節(jié)中列出的方法配制試樣溶液，然后進行樣品分析，計算3個有效成分的含量及RSD(見表5)。

表5 青海產(chǎn)3批西紅花藥材中3個有效成分的含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長和波長切換時間點的選擇

3種主要組分的最大吸收波長不同(苦番紅花素：254 nm；西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ：440 nm)，不能用某單一波長同時檢測3個有效成分[12，13]，故選擇采用波長切換法同時測定3個有效成分的含量。通過試驗可知，苦番紅花素最先出峰，在15 min左右出峰，西紅花苷-Ⅰ在31 min左右出峰，在15～31 min范圍內的中間時間點切換波長比較適宜，因此選擇23 min作為波長切換時間點，即0～23 min，254 nm；23～50 min，440nm。

3.2 流動相的選擇

結合參考文獻[14-25]和藥典[1]，最終選擇梯度洗脫法同時測定西紅花中3個有效成分的含量。在優(yōu)選的條件下，本試驗所需的3個有效成分峰均能與雜質分離，峰型良好，分離度高。

3.3 提取溶劑和時間的選擇

本研究采用超聲波法提取西紅花樣品中的有效成分，對不同濃度的甲醇、乙醇進行了比較，并研究了超聲時間對提取效率的影響[18-29]。結果顯示，效果最佳的條件是：溶劑為稀乙醇，超聲處理時間為20 min。故本試驗以稀乙醇為溶劑，超聲20 min處理樣品以獲得供試品溶液[18-26]。

3.4 西紅花樣品中3個有效成分含量分析

2020年版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定西紅花藥材中苦番紅花素的含量不得少于5.0%，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總量不得少于10.0%[1]。青海3批西紅花樣品中3個有效成分含量都超過了藥典的最低限定，各批次之間的含量差別較小。值得注意的是，3批西紅花中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總量均超過藥典標準的2倍，二者含量之所以較高，可能與青海番紅花的種植方式、土壤、氣候等環(huán)境因素相關，其積累與變化規(guī)律還需深入試驗[14-29]。

西紅花是一個傳統(tǒng)藥食兩用物質，具有多種生理功能，有著很好的應用前景[11]。一方面，它可用于醫(yī)治心腦血與神經(jīng)系統(tǒng)退行方面的疾病；另一方面，在食品加工中，它被用作茶飲品、色素、香料等。2015年版藥典只把西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ作為西紅花藥材質量控制的指標成分是有一定局限性的。然而西紅花所含化學成分十分復雜，其質量的優(yōu)劣是多個成分綜合表現(xiàn)出來的整體效應。為了系統(tǒng)地對西紅花藥材進行質量評價，有必要將西紅花的苦味成分(主要是苦番紅花素)的含量測定納入西紅花藥材質量評價的指標體系中。2020年版藥典規(guī)定了西紅花藥材中苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總量的最低限度。因此，本試驗依據(jù)2020年版藥典，以苦番紅花素、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ為指標成分，同時測定了青海產(chǎn)西紅花中3個有效成分的含量。結果表明，青海產(chǎn)西紅花質量優(yōu)良，為青海發(fā)展西紅花產(chǎn)業(yè)奠定了理論基礎。