俞耀文，戴國慶, ，華浩立，俞 杰, ，ZHYLKO Viachaslau

（1.浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州310015；2.白俄羅斯國立大學國際薩哈羅夫環(huán)境研究所，明斯克州明斯克220070）

桃花是薔薇科落葉喬木桃樹的花，具有美容養(yǎng)顏和保健之功效，在食藥領域應用廣泛。研究表明，桃花中含有黃酮、多酚、多糖、類胡蘿卜素、多種維生素、氨基酸及微量元素等多種化學成分[1-3]，營養(yǎng)與藥用價值較高。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、降血糖、治療骨質疏松、抗輻射等多種藥理作用[4-6]，工業(yè)應用前景廣闊。根據文獻報道[2,7]，桃花中含有阿福豆苷（afzelin）、槲皮苷（quercitrin）、柚皮素（naringenin）以及三葉豆苷（trifolin）等多種黃酮化合物，說明桃花中黃酮類物質豐富[8]。

近年來，學者們主要采用以乙醇為溶劑的浸提法[7-8]，并結合超聲波輔助[9]、大孔樹脂純化[10]以及索氏提取[11]等方法，研究了桃花總黃酮的提取工藝。雙水相提取技術是一種新型的萃取分離技術[12]，根據物質在互不相溶兩相間溶解性的差異，實現(xiàn)目標成分的萃取和分離，被廣泛用于生物化學和生物化工產品的分離純化[13]。目前，雙水相萃取技術已有效應用于黃酮類化合物[14-16]等天然產物的提取。但雙水相體系在桃花總黃酮中的提取研究尚未見報道。

因此，本研究采用乙醇-硫酸銨雙水相體系提取桃花總黃酮，以黃酮的得率為指標，考察了硫酸銨質量分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間等因素的影響，采用響應面分析法優(yōu)化了提取工藝，并研究了黃酮提取物的抗氧化活性，以期為桃花的綜合利用以及黃酮化合物等天然產物的深度開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桃花 產地為安徽省亳州市；蘆丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、硫酸銨、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、七水合硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；雙氧水（30%質量濃度）上海凌峰化學試劑有限公司；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、抗壞血酸（VC） 上海麥克林生化科技有限公司；濃鹽酸 西隴科學股份有限公司；蒸餾水 實驗室自制。

CPA225D分析天平 德國賽多利斯集團公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；DZF型真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；SK220H型超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司；TDZ5-WS式低速自動平衡離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桃花原料預處理 將桃花剝去花托和萼片，置于真空干燥箱（60 ℃，2 h）烘干，然后放入研缽中研磨至粉狀，過60目篩。過篩后的桃花粉末避光冷藏（8 ℃）。

1.2.2 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖制作 用Albertson濁點法[17]測定并制作乙醇-硫酸銨體系相圖。準確稱取4.5 g硫酸銨于錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌至硫酸銨完全溶解，靜置。用滴定管向錐形瓶中緩慢滴加無水乙醇并震蕩錐形瓶，直到混合溶液出現(xiàn)渾濁為止，記錄此時消耗的無水乙醇體積。用滴定管向上述混合體系中滴加蒸餾水并振蕩錐形瓶，直至體系重新變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)，記錄此時消耗的蒸餾水體積。不斷重復上述操作，記錄所加入的乙醇體積和水體積，計算狀態(tài)改變時體系中硫酸銨和乙醇的質量分數(shù)，并繪制雙水相相圖。

1.2.3 桃花總黃酮提取工藝 乙醇-硫酸銨雙水相提取桃花總黃酮工藝如下[15]：準確稱取一定量硫酸銨，置于燒杯中，并加入適量的乙醇溶液（質量分數(shù)為40%），在超聲作用下，攪拌至顆粒完全溶解，靜置直到溶液分相。按液料比準確稱取一定量的桃花粉末，加入燒杯中，在恒溫加熱磁力攪拌器上加熱一定時間后，倒入10 mL的離心管中，并在2500 r/min的條件下離心5 min，取上相澄清液作為待測液。

1.2.4 桃花總黃酮的測定 實驗以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法，選用510 nm為檢測波長，測定桃花中總黃酮[18]。

1.2.4.1 蘆丁標準曲線的繪制 稱取10 mg蘆丁于50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解，用60%濃度的乙醇定容至刻度，搖勻后，得到質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。取6只標記好的10 mL容量瓶，分別加入0、1、2、3、4、5 mL蘆丁標準溶液，加水至5 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后靜置5 min，加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL，加水稀釋至刻度線，搖勻后靜置10min。以第一管為對照組，在510 nm處測定吸光度值。以濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。得到蘆丁濃度與吸光度的線性回歸方程：y=8.92857x+0.00429，R2=0.999。

1.2.4.2 桃花總黃酮得率測定 準確吸取2.5 mL待測液，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻，靜置，并從中準確吸取2.5 mL加入25 mL容量瓶中。然后，加入5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，溶液無明顯變化；再加入10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，溶液變棕黃色；再加入4%的氫氧化鈉溶液10 mL，溶液變?yōu)榫萍t色，加水定容至25 mL，搖勻，靜置15 min。然后測定吸光度。

根據蘆丁標準曲線，測量提取液中的黃酮濃度，然后根據式（1）計算桃花總黃酮得率。

式中：C—上相提取液的黃酮濃度，mg/mL；V—上相提取液的體積，mL；n—稀釋倍數(shù)；m—稱取的桃花粉末質量，mg；Y—桃花總黃酮得率，%。

1.2.5 單因素實驗 硫酸銨質量分數(shù)對黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定液料比為35:1（mL/g），提取溫度為50 ℃，提取時間為30 min，分別設置硫酸銨的質量分數(shù)為11%、13%、15%、17%、19%，檢測黃酮得率。

液料比對黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定硫酸銨質量分數(shù)為15%，提取溫度為50 ℃，提取時間為30 min，分別設置液料比為20:1、25:1、30:1、35:1、40:1（mL/g），檢測黃酮得率。

提取溫度對黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定硫酸銨質量分數(shù)為15%，液料比為30:1（mL/g），提取時間為30 min，分別設置提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，檢測黃酮得率。

提取時間對黃酮得率的影響：按照1.2.3的方法，固定硫酸銨質量分數(shù)為15%，液料比為30:1（mL/g），提取溫度為50 ℃，分別設置提取時間為15、20、25、30、35 min，檢測黃酮得率。

1.2.6 響應曲面試驗設計 在單因素實驗基礎上，進行響應曲面試驗設計，選擇硫酸銨質量分數(shù)、提取時間、液料比、提取溫度這4個因素作為自變量，以黃酮得率為響應值。運用Box-Bchnken中心組合設計方案[19]，利用Design-Expert8.0軟件對實驗數(shù)據進行回歸分析。實驗因素水平見表1。

表1 響應面分析試驗因素水平Table 1 Code and level of factors for the response surface analysis experiment

1.2.7 抗氧化實驗研究 通過對DPPH·、OH·、以及自由基的清除能力測定實驗，并分別以VC為對照，研究桃花總黃酮的抗氧化性能。

1.2.7.1 樣品溶液制備 按照1.2.6的方法所選出的優(yōu)化條件，提取桃花總黃酮，然后加入一定量的無水乙醇稀釋，得到黃酮質量濃度為0.112、0.224、0.336、0.448、0.56、0.672 mg/mL的待測樣品溶液，分別記為1、2、3、4、5、6號，密閉冷藏（8 ℃）。

1.2.7.2 桃花總黃酮對DPPH·清除能力 參考文獻[20]方法，并稍作修改。用80%的乙醇溶液配制0.15 mmol/L的DPPH溶液100 mL，避光保存。分別吸取1、2、3、4、5、6號樣品溶液各2 mL，置于10 mL的離心管中，各加入DPPH溶液2 mL，搖勻后，靜置30 min。同時，以無水乙醇代替DPPH溶液，作為對照組；以無水乙醇代替待測液，作為空白組。均在517 nm處測定吸光度，并根據式（2）計算自由基清除率。

式中：I—自由基清除率，%；A0—加入DPPH溶液和無水乙醇的吸光度；Ai—加入DPPH溶液和粗提液的吸光度；Aj—加入無水乙醇和粗提液的吸光度。

1.2.7.3 桃花總黃酮對OH·清除能力 參考文獻[21]方法，并稍作修改。精確吸取9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液2 mL，置于10 mL的離心管中，然后分別加入1、2、3、4、5、6號樣品溶液各2 mL，再分別加入9 mmol/L水楊酸溶液2 mL和8.8 mmol/L的雙氧水溶液2 mL，搖勻后，靜置30 min。同時，以蒸餾水代替雙氧水溶液，作為對照組；以蒸餾水代替待測液，作為空白組。均在510 nm處測定吸光度，根據式（2）計算自由基清除率。

1.3 數(shù)據處理

采用Origin數(shù)據處理軟件進行單因素實驗數(shù)據分析和圖表制作，采用Design-Expert 8.0軟件進行響應面試驗設計分析。

2 結果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖

乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖如圖1所示。曲線上的點為臨界點，在曲線上方為兩相區(qū)，其中上相為富乙醇相，而下相則為富鹽相，黃酮類物質多具有二苯基色原酮的黃酮母體結構，極性較小，從而富集于上相[15]，而如多糖等極性較大的物質則多富集于下相，因而可使桃花中的黃酮得以分離。因此，在實驗時，乙醇和硫酸銨的質量分數(shù)應落于曲線之上，并取上相澄清液作為待測液進行研究。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖Fig.1 Phase diagram of aqueous two-phase system of ethanol and ammonium sulfate

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 硫酸銨質量分數(shù)對黃酮得率的影響 如圖2所示，隨著硫酸銨質量分數(shù)的增加，黃酮得率先增加而后降低，當硫酸銨質量分數(shù)為15%時，黃酮得率達到最大值?？赡艿脑蚴?，隨著硫酸銨質量分數(shù)的增加，硫酸銨對雙水相體系中水分子的束縛能力增強[23]，使得上相中乙醇的質量分數(shù)增大，從而有利于促進黃酮物質的溶出，當硫酸銨質量分數(shù)進一步增加時，硫酸銨在上相中的濃度也隨之增加，從而不利于黃酮物質的萃取。因此，選取硫酸銨質量分數(shù)為15%進行后續(xù)實驗研究。

圖2 硫酸銨質量分數(shù)對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on the extraction rate of flavonoids

2.2.2 液料比對黃酮得率的影響 如圖3所示，隨著液料比的增加，黃酮得率先增加后降低，在液料比為30:1（mL/g）時達到最大值。可能原因是，溶劑用量的增加使得細胞內外的質量濃度差變大，傳質推動力、內擴散的速率增大，從而有利于黃酮的溶出。但隨著液料比進一步增加，溶劑量增多雜質成分溶出增多，影響黃酮類物質的浸出，從而導致其得率降低[19]。因此，30:1（mL/g）為黃酮提取的較佳料液比，由于35:1（mL/g）時黃酮得率大大降低，故選擇20:1～30:1（mL/g）進行后續(xù)實驗。

圖3 液料比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

2.2.3 提取溫度對黃酮得率的影響 如圖4所示，隨著提取溫度的升高，黃酮得率先快速增加而后逐步降低，當提取溫度為50 ℃時，達到最大值。可能的原因是，當溫度升高時，黃酮的溶出率也相應增大，因此得率升高。但當溫度過高時，黃酮類化合物的分子結構有可能會被破壞[22]，從而導致得率降低。因此，黃酮提取的較佳溫度為50 ℃。

圖4 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.2.4 提取時間對黃酮得率的影響 如圖5所示，隨著提取時間的增加，黃酮得率先增加而后降低，當提取時間為25 min時，黃酮得率達到最大值?？赡艿脑蚴?，隨著提取時間的增加，黃酮化合物的溶出量逐步增加，當提取時間為25 min時，黃酮類化合物已基本溶出，繼續(xù)加熱可能會破壞黃酮的內部結構，從而導致黃酮得率降低。因此，較佳的提取時間為25 min。

圖5 提取時間對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids

2.3 響應面優(yōu)化試驗

根據Box-Benhnken設計原理，進行了4因素3水平共29個響應面分析試驗，具體結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Designandresults for response surface test

2.3.1 模型建立和顯著性分析 利用Design-Expert 8.0軟件對響應面實驗數(shù)據進行分析和多元回歸擬合，建立以黃酮得率為函數(shù)的二次回歸方程，并對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。黃酮得率（Y）與硫酸銨質量分數(shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）的二次回歸方程為：

從表3可知，本實驗所選用回歸模型具有極好的顯著性（P＜0.01），模型決定系數(shù)R2=0.9785%，擬合度較高，校正系數(shù)R2adj=0.9570，說明該模型方程能夠解釋95.70%的響應值變化。失擬項P=0.2248＞0.05，表明該模型失擬項不顯著，模型整體的絕對誤差較小，說明通過響應面分析模擬選擇得率與各因素之間的函數(shù)作用關系具有一定的科學合理性[24]。根據F值可知，各因素對桃花總黃酮得率的影響程度由大到小依次為B＞C＞D＞A，即液料比＞提取溫度＞提取時間＞硫酸銨質量分數(shù)。此外，A、B、C、D、AB、A2、B2、C2、D2對黃酮得率影響極顯著（P＜0.01），AD對黃酮得率影響顯著（P＜0.05）。

表3 響應面試驗回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for response surface test

殘差的正態(tài)分布規(guī)律如圖6所示。由圖6可知，實驗中的實際測定值與預測值之間吻合性良好，二者的散點分布概率幾乎為直線，說明測定結果整體標準偏差的平均值相較于得率可忽略不計[24]。

圖6 殘差的正態(tài)分布規(guī)律圖Fig.6 Normal distribution of residuals

2.3.2 響應面交互作用分析 通過響應面分析軟件對各個因素之間的交互作用進行分析，繪制了各因素交互作用的等高線圖和響應曲面圖（圖7～圖12）。等高線的性狀可以反映各因素間交互作用的強弱關系[19]。硫酸銨質量分數(shù)和液料比的等高線呈橢圓形，其交互作用最為顯著，其次為硫酸銨質量分數(shù)和提取時間。硫酸銨質量分數(shù)和提取溫度、液料比和提取溫度、液料比和提取時間以及提取溫度和提取時間的交互作用不顯著。這與表3的顯著性分析結果一致。

圖7 硫酸銨質量分數(shù)和液料比交互作用對黃酮得率的影響Fig.7 Interaction of mass fraction of ammonium sulfate and solid-to-liquid ratio on the yield of flavonoids

圖8 硫酸銨質量分數(shù)和提取溫度交互作用對黃酮得率的影響Fig.8 Interaction of mass fraction of ammonium sulfate and extraction temperature on the yield of flavonoids

圖9 硫酸銨質量分數(shù)和提取時間交互作用對黃酮得率的影響Fig.9 Interaction of mass fraction of ammonium sulfate and extraction time on the extraction rate of flavonoids

圖10 液料比和提取溫度交互作用對黃酮得率的影響Fig.10 Interaction of solid-to-liquid ratio and extraction temperature on the yield of flavonoids

圖12 提取溫度和提取時間交互作用對黃酮得率的影響Fig.12 Interaction of extraction temperature and extraction time on the yield of flavonoids

2.3.3 驗證性實驗 響應面試驗預測的最佳提取條件為：硫酸銨質量分數(shù)為15.18%、液料比為27.75:1（mL/g）、提取溫度為51.11 ℃、提取時間為26.11 min?？紤]到實驗室實際操作，將硫酸銨質量分數(shù)調整為15.2%，液料比調整為27.8:1（mL/g），提取溫度調整為51 ℃，提取時間調整為26 min。在此條件下，黃酮得率理論值可達45.64%。重復三次實驗，黃酮得率分別為45.65%、45.61%、45.70%，平均值為45.65%，與理論值十分接近，實驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地預測黃酮得率。

圖11 液料比和提取時間交互作用對黃酮得率的影響Fig.11 Interaction of solid-to-liquid ratio and extraction time on the yield of flavonoids

此外，和文獻[11]報道相似，本實驗桃花總黃酮得率較高，可能和植物所在的不同時期有關[25]。實驗中所使用的原料為桃花花苞，采收時處于生長期，推測其生長狀態(tài)良好，營養(yǎng)成分吸收充足[26]。

2.4 桃花總黃酮抗氧化實驗結果

2.4.1 對DPPH·的清除能力 由圖13可知，隨著濃度的增加，VC清除DPPH·能力逐步升高，當濃度為0.336 mg/mL時，清除率已達到95.63%，繼續(xù)增大濃度清除率無明顯變化。隨著濃度的增加，桃花總黃酮對清除DPPH·的能力逐步增加，當樣品濃度為0.56 mg/mL時，其對DPPH·的清除率為94.21%，接近VC水平，說明桃花總黃酮對DPPH·有較強的清除能力，與文獻[27-28]研究黃酮抗氧化的結論相似。

圖13 桃花黃酮對DPPH·的清除能力Fig.13 DPPH· scavenging ability of peach blossom flavonoids

2.4.2 對OH·清除能力 如圖14所示，隨著濃度的增加，VC清除OH·能力逐步升高，當濃度為0.448 mg/mL時，清除率幾乎可達100%[22]。在所考察的濃度范圍內，桃花總黃酮對OH·的清除能力隨濃度的增加呈明顯上升趨勢，當樣品濃度為0.672 mg/mL時，清除率可達91.23%，說明其對OH·有較強的清除能力，與文獻[22,29]研究黃酮抗氧化的結論相似。

圖14 桃花黃酮對OH·的清除能力Fig.14 Scavenging ability of Flavonoids from peach blossom to OH·

圖15 桃花黃酮對的清除能力Fig.15 Scavenging ability of peach blossom flavone to O-2·

植物黃酮的抗氧化能力是存在植物體內所有黃酮化合物共同作用的結果[31]。黃酮結構上為多羥基酚類物質，具有很強的供氫能力，并且可直接參與自由基的清除[32]。本實驗結果表明桃花黃酮對DPPH·、OH·和O2-·具有較強的清除能力，可作為一種潛在的天然抗氧化劑。

3 結論

采用乙醇-硫酸銨雙水相體系來提取桃花中總黃酮。在單因素實驗的基礎上，以硫酸銨質量分數(shù)、提取時間、液料比、提取溫度4個影響因素為自變量，以黃酮得率為指標，通過響應曲面法設計優(yōu)化總黃酮的提取工藝。最佳工藝參數(shù)為：硫酸銨質量分數(shù)15.2%、液料比27.8:1（mL/g）、提取溫度為51 ℃、提取時間26 min。在此條件下，黃酮得率理論值可達45.64%，驗證值為45.65%，與理論值十分接近?？寡趸瘜嶒灲Y果表明，桃花總黃酮對DPPH·、OH·和O2-·表現(xiàn)出較強的清除能力，當濃度為0.56 mg/mL時，DPPH·清除率為94.21%，當濃度為0.672 mg/mL時，OH·和清除率分別為91.23%和80.65%，表明其具有良好的抗氧化性能。該試驗結果可為桃花中黃酮等活性物質的進一步研究開發(fā)提供參考，具有一定的理論研究及工業(yè)應用價值。