沈曉靜，黃璐璐，聶凡秋，王 青，楊俊滔，顏成慧，姜薇薇,

（1.云南農業(yè)大學理學院，食品科學技術學院，云南昆明 650201；2.云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明醫(yī)科大學，云南昆明 650500；3.隆陽區(qū)壩灣民族中學，云南保山 678000）

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物，主要分布在南美、中美洲、非洲和亞洲等國家，全球超過80個國家種植[1]。根據《中華本草》記載，咖啡具有醒神、利尿、健胃的功效，主治精神倦怠、食欲不振，常作為醒神、利尿和健胃藥使用?，F(xiàn)代研究表明，咖啡中含有生物堿、酚酸類、黃酮類、萜類等多種活性成分，具有肝臟保護、神經保護、抗氧化、抗糖尿病等多種藥理活性[2-3]。

我國咖啡種植以小?？Х葹橹髑?9%以上分布在云南。云南小粒咖啡內含物質豐富，除咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿等成分外，還含有包括mascarosides I～II[4]，paniculoside VI[4]、cofaryloside I[4]、villanovane Ⅰ[4]、caffarolides A～H[5]、caffruenol A-B[6]、caffruones A-D[6]和caffruolide A-B[7]等在內的一些新型萜類化合物。其中，caffarolides C、D和F被證實具有一定的體外激活血小板聚集活性[5]；caffruenol AB和caffruolide A-B具有抑制脂多糖誘導的264.7巨噬細胞NO產生的作用[7]。隨著對咖啡的深入研究，咖啡的附加值不斷提高。近年來，基于咖啡副產品中含有豐富的酚酸、類黃酮、萜類、生物堿等生物活性成分，可作為抗氧化、保護肝臟和神經等天然可持續(xù)活性成分來源，使得咖啡副產品的研究越來越受到研究者的關注[8-10]。Campa等報道了咖啡葉中含有酚類化合物[11]；Chen對咖啡葉中豐富的生物堿、黃酮、酚酸、萜類等的化學成分和抗氧化、抗炎、抗菌等藥理活性進行了綜述[12]，并研究了咖啡葉加工方式和葉齡對其化學成分和活性的影響[13]。另外，付曉萍等[14-15]發(fā)現(xiàn)云南小?？Х裙さ拇痔嵛飳κ軗p人臍靜脈內皮細胞有一定的保護和恢復作用，還具有潛在的抗氧化效果，并發(fā)現(xiàn)其中的主要花青素為矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷。

咖啡花作為咖啡種植產業(yè)中的主要副產物通常被丟棄。然而，已有的研究發(fā)現(xiàn)咖啡花化學成分豐富，Stashenko等[16]采用GC-MS分析了小?？Х然ㄖ械膿]發(fā)和半揮發(fā)成分成分，結果共確定了150個化合物，以正十五烷含量最高，香葉醇次之。此外，Nguyen等[17]對咖啡花中的活性成分進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)咖啡花中酚類化合物含量高，因此咖啡花可作為獲取天然抗氧化活性成分的原料。另外，咖啡花中還含有咖啡因、葫蘆巴堿?？Х纫蚓哂薪档突忌窠浲诵行约膊〉娘L險[18-19]；葫蘆巴堿則可預防糖尿病和腎損傷，同時還具有治療神經退行性疾病的作用[20-21]。Pinheiro等[22]通過HPLC分析了不同干燥和提取方式下咖啡花中的葫蘆巴堿、綠原酸、沒食子酸和咖啡因4種活性成分的含量，其中以咖啡因和葫蘆巴堿含量最高；并采用ABTS和DPPH實驗評估了抗氧化活性，證實了咖啡花具有抗氧化活性并可作為制作茶飲料潛在的原料。目前對咖啡花的研究報道尚少，但從已有的報道可以看出，咖啡花作為潛在的生物活性化合物來源，具有廣闊的應用前景。

多糖（polysaccharides）是由10個以上單糖經糖苷鍵結合而成的大分子化合物，廣泛存在于動物、植物和微生物中。多糖結構復雜，具有不同的構象和相對分子質量，以及鏈內和鏈間氫鍵的二級結構?，F(xiàn)代研究表明，多糖具有抗氧化[23-24]、抗衰老[25]、免疫調節(jié)[26]、抗炎[27]、抗腫瘤[28]等藥理活性。多糖的生物活性與其純度、化學結構、溶解度等有關。近年來，多糖的生物活性成為天然藥物的研究熱點，也是發(fā)掘新型藥物和開發(fā)功能性食品的渠道，因此多糖在醫(yī)藥領域和食品領域具有重要地位。我國云南是咖啡種植的主要產區(qū)，咖啡花具有潛在的開發(fā)價值，但是目前對云南咖啡花的開發(fā)研究較少，咖啡花潛在的價值未能挖掘。因此本文以云南小?？Х然樘骄繉ο螅_展對其活性多糖的研究，旨在深入挖掘云南小?？Х鹊木C合利用價值。

本文以多糖得率為評價指標，對采自云南省保山市的咖啡花進行多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化能力進行測定，為進一步的開發(fā)具有生物活性的多糖提供基礎數據，并為進一步開發(fā)和研究云南小粒咖啡和提高其附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡花 云南省保山市；無水乙醇 天津化學試劑有限公司；蒽酮 純度98.0%，國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸、鹽酸 重慶川東化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、蘆丁 純度98.0%，上海瑞永生物科技有限公司；水溶性維生素E 純度98.0%，合肥博美生物科技有限公司；六水合三氯化鐵 分析純，西隴科學股份有限公司；過硫酸鉀 分析純，天津市大茂化學試劑廠；PBS緩沖液、醋酸鈉緩沖液 廈門海標科技有限公司。

FA2104N型電子天平、722-分光光度計 上海箐華科技有限公司；KQ-250DB超聲儀、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；旭曼-1000Y多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；800電動離心機 金壇市富華儀器有限公司；VFD-3000真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 咖啡花多糖的提取 參考鄭婷婷等[29]的方法，并加以修改。將采自云南保山市的咖啡花在室溫下陰干后，采用粉碎機粉碎并過80目篩后備用。稱取咖啡花粉末2.0 g，加入20.0 mL純水，浸泡30 min，40 ℃下100 W超聲30 min，冷卻至室溫，經真空抽濾后保留濾液。在濾液中加入乙醇至濃度為80%進行沉淀，靜置12 h。4000 r/min離心10 min后棄去上清液，沉淀加水溶解后-80 ℃下凍干，得粗多糖。配制5 mg·mL-1的咖啡花多糖溶液，備用。

1.2.2 多糖標準曲線的制備和咖啡花多糖含量的測定 參考蒽酮-硫酸法[30]繪制葡萄糖標準曲線。分別配制0.0、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 μg/mL葡萄糖標準溶液。精密吸取不同濃度的上述葡萄糖標準溶液1.00 mL，加入1.00 mL純水，置于25 mL具塞試管。加入5.0 mL 2.1 mg·mL-1蒽酮-硫酸溶液搖勻，冰水浴冷卻，沸水浴加熱7 min，迅速置于冰水浴中冷卻至室溫。以去離子水作為空白對照，在625 nm處進行比色測定吸光度A。以無水葡萄糖含量為橫坐標（0.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg），吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程為：Y=0.0051X-0.0092（R2=0.9970）（式中：Y為吸光值，X為葡萄糖量，μg）。

精密吸取一定體積上述配制的5 mg/mL的咖啡花多糖溶液于25 mL具塞試管，加入純水補至2.00 mL。加入5.0 mL 2.1 mg·mL-1蒽酮-硫酸溶液搖勻，冰水浴冷卻，沸水浴加熱7 min，迅速置于冰水浴中冷卻至室溫。以去離子水作為空白對照，在625 nm處進行比色測定吸光度A。根據葡萄糖標準曲線方程計算咖啡花多糖得率，每個樣品重復3次，結果以平均值表示，計算公式如下：

式中：X為V體積咖啡花多糖溶液中多糖含量，μg；V為多糖溶液測定的體積，mL；5為配制的咖啡花多糖溶液濃度5 mg·mL-1；m1為凍干咖啡花粗多糖總質量，g；ms為稱取咖啡花樣品的質量，g。

1.2.3 單因素實驗 在超聲輔助提取咖啡花多糖的過程中，影響多糖得率的重要因素主要有超聲溫度、超聲時間、液料比、超聲功率、浸泡時間和醇沉濃度，分別對各個因素進行試驗。

超聲溫度選取40、50、60、70、80 ℃五個水平；超聲時間選取30、60、90、120、150 min五個水平；液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g五個水平；超聲功率選取100、125、150、175、200 W五個水平；浸泡時間選取30、60、90、120、150 min五個水平；乙醇濃度選取75%、80%、85%、90%、95%五個水平，分別進行單因素實驗。當篩選其中一個參數時，其余因素分別為：超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、液料比10:1 mL/g、超聲功率 100 W、浸泡時間30 min以及醇沉濃度80%。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗 根據Box-Benhnken試驗設計原理，以咖啡花多糖得率為響應變量，從單因素試驗結果中選取3個多咖啡花多糖得率影響最大的因素，見表1。以咖啡花多糖得率為指標優(yōu)化超聲溫度、超聲時間和超聲功率。

表1 響應面分析因素和水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.2.5 抗氧化能力實驗

1.2.5.1 DPPH自由基清除實驗 參考文獻[31]描述的方法進行DPPH自由基清除實驗。取3.9 mL 0.075 mmol/L DPPH反應液與100 μL不同濃度多糖溶液混合。室溫下暗處反應30 min，于515 nm下分別測量吸光值，以蘆丁為陽性對照，DPPH自由基清除率計算式為：I%=[（A0–As）/A0]×100（式中：As為樣品溶液的吸光度；A0為未加樣品溶液的吸光度），抗氧化活性以50%抑制率（IC50）表示。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除實驗 參考文獻[32]描述的方法進行ABTS+自由基清除實驗。分別取2 mL的多糖溶液加入到2 mL ABTS+自由基溶液中，均勻混合后，室溫反應6 min，測定734 nm下紫外吸收，蘆丁為陽性對照。ABTS+自由基清除能力計算公式如下：I（%）=[（A0–As）/A0]×100（式中：As為樣品溶液的吸光度；A0為未加樣品溶液的吸光度）標準曲線是通過測定不同濃度Trolox標準溶液繪制（I%=0.0247C-0.0046，R2=0.9937），樣品的ABTS抗氧化活性表示為mmol Trolox/g。

1.2.5.3 FRAP法 參考文獻[33]描述的方法進行FRAP抗氧化能力測定。取5.0 mL TPTZ、5.0 mL 20 mmol/L FeCl3和50 mL醋酸鈉緩沖溶液（300 mmol/L，pH3.6）配制成FRAP工作液；100 μL樣品與300 μL水和3.0 mL FRAP工作液混合，放置于37 ℃的水浴鍋中反應30 min；于595 nm下測定吸光度。以FeSO4為標準品制作標準曲線（A=0.572C-0.008，R2=0.9974），蘆丁為陽性對照，根據標準曲線計算還原能力，以mmol FeSO4/g多糖表示。

1.3 數據處理

所有試驗均重復三次，取平均值。采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

單因素實驗結果如圖1所示。超聲溫度對咖啡花多糖得率的影響：超聲溫度40～80 ℃，多糖得率為1.0048%～1.7982%。在40～70 ℃范圍內，咖啡花多糖得率隨超聲溫度的升高而逐漸升高，至70 ℃時達到最大，超過70 ℃后得率開始下降。這可能是由于在高溫條件下咖啡花多糖的結構遭到破壞而造成多糖得率下降，這在文獻[29,34-35]也有相似報道。超聲溫度選擇為70 ℃。

圖1 單因素實驗結果Fig.1 Results of single factor experiments

超聲時間對咖啡花多糖得率的影響：超聲時間30～150 min，多糖得率為1.0369%～1.5853%，多糖得率隨超聲時間的增加而升高，至90 min時達到最大，90 min后，隨超聲時間的增加，得率開始下降。這是由于短時間的超聲提取不利于多糖的充分溶解，而長時間的超聲提取又會使多糖降解反而導致得率下降，這在文獻[29,34-35]也有相似報道。因此，超聲時間選擇為90 min。

液料比對咖啡花多糖得率的影響：料液比對多糖得率的影響較小，液料比10:1～30:1 mL/g時多糖得率為1.1790%～1.3357%。多糖得率隨液料比的升高而升高，至25:1 mL/g時達到最大，25:1 mL/g后，隨液料比的升高，得率反而下降。溶劑較少會導致多糖不能充分的溶出而使多糖得率較低；較多的溶劑又會使多糖溶解而不易沉淀析出，同時也會因溶劑吸收超聲波輻射而導致得率降低，這在文獻[29,34-35]也有相似報道?？紤]到液料比對得率的影響較小，為了節(jié)省試劑用量，因此，液料比選擇為10:1 mL/g。

超聲功率對咖啡花多糖得率的影響：超聲功率選取100～200 W，多糖得率為1.1185%～1.8583%，多糖得率隨超聲功率的增大而升高，至175 W時達到最大，175 W后，隨超聲功率的增大，得率反而下降。超聲功率增加可以有效地破壞細胞和組織使多糖溶解于溶劑中，因此增大超聲功率有利于多糖的析出；但是，較大的超聲波所產生的破碎效應和熱效應同時會增加咖啡花中的雜質溶出，熱效應又使多糖成分破壞從而引起多糖得率降低，這在文獻[36-37]也有相似報道。因此，超聲功率選擇為175 W。

浸泡時間對咖啡花多糖得率的影響：浸泡時間對多糖得率的影響較小，浸泡時間30～150 min，多糖得率為1.1827%～1.4609%。30～90 min范圍內，多糖得率隨浸泡時間的增加而升高，至90 min時達到最大，90 min后，隨浸泡時間的增加，得率略有下降，且趨于平緩。浸泡時間的延長可利于多糖在超聲過程中的析出，并減少能耗。但是過長的浸泡并不能帶來較高的得率，過長的浸泡也會使其他成分析出影響多糖得率。這與文獻[38]報道相似?？紤]到浸泡時間的影響較小，為了節(jié)省時間，浸泡時間選擇為30 min。

醇沉濃度對咖啡花多糖得率的影響：醇沉濃度對多糖得率的影響較小，醇沉濃度75%～95%，多糖得率為0.9703%～1.2806%。多糖得率隨乙醇濃度的升高而升高，至85%時達到最大，85%后，隨乙醇濃度的升高，得率反而下降。水提醇沉是利用多糖不溶于醇的性質而使其沉淀析出。當隨著乙醇的加入量增加，多糖因不溶于乙醇而沉淀析出，得率增大，當醇沉濃度超過85%以后，并不能提高多糖得率，反而造成試劑的浪費。這與文獻[38]報道相似。為簡化操作，本文采用直接加入乙醇調節(jié)醇濃度的方法進行沉淀，同時，由于80%與85%多糖得率差別不大，但可節(jié)約試劑減少浪費。因此，醇沉濃度選擇為80%。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果 超聲溫度、超聲時間和超聲功率影響較大，因此在上述單因素實驗基礎上，對超聲溫度、超聲時間和超聲功率三個條件進行響應面法優(yōu)化，結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

以多糖得率（Y）為考察響應指標，建立其與超聲溫度、超聲時間和超聲功率三個因素的回歸模型，得到二次回歸方程為：

2.2.2 方差的顯著性檢驗 對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表3。

表3 多糖得率方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of yield of polysaccharides

由表3方差分析結果得，總模型顯著（P＜0.0001），該模型達到極顯著水平，表明不同因素間的差異顯著；根據回歸方程一次項系數絕對值大小可知，各因素對總多糖得率的影響順序為：A＞B＞C，即超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率。失擬項P=0.5764＞0.05，失擬項檢驗不顯著，說明未知因素對試驗結果的影響較小，殘項主要由隨機誤差引起，表明模型選擇適當正確。AB的影響顯著（P＜0.05），A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.01），在整個模型中，模型中的調整系數R2Adj=0.9277，說明92.77%的響應值變化可以通過模型進行解釋，決定系數R2=0.9684，表明模型可信度高，且模型與實驗擬合良好，可用此模型進行分析與預測[39-42]。

2.2.3 響應曲面及等高線 各因素交互作用對咖啡花多糖得率影響的響應面圖見圖2。由超聲溫度和超聲時間兩者的交互作用可知，二者交互作用顯著；當超聲溫度不變時，咖啡花多糖的得率隨超聲時間的增加先上升后下降；當超聲時間不變時，咖啡花多糖得率隨超聲溫度的升高先增大后減小。由超聲溫度和超聲功率兩者的交互作用可知，當超聲溫度不變時，咖啡花多糖的得率隨超聲功率的增加先上升后下降；當超聲功率不變時，咖啡花多糖得率隨超聲溫度的升高先增大后減小。由超聲時間和超聲功率兩者的交互作用可知，當超聲時間不變時，咖啡花多糖的得率隨超聲功率的增加先上升后下降；當超聲功率不變時，咖啡花多糖得率隨超聲時間的升高先增大后減小。

圖2 各因素交互作用對多糖得率影響的三維曲面和等高線Fig.2 Three-dimensional surface plot and contour map for the interactive effects of four extraction parameters on yield of polysaccharides

因此，以多糖得率作為評價標準，通過對超聲時間、超聲溫度和超聲功率三個條件的響應面法優(yōu)化結果為：超聲溫度69.56 ℃、超聲時間92.99 min和超聲功率174.01 W，預測此條件下2.290%。根據實際情況操作選取超聲溫度69.5 ℃、超聲時間93.00 min和超聲功率175W、浸泡時間30 min、液料比10:1 mL/g和乙醇濃度80%進行4次平行試驗，平均得率為2.292%±0.061%?；窘咏囼炈@得的理論值，表明預測值和真實值之間有很好的擬合性，因此本研究中利用響應面獲得的優(yōu)化工藝參數準確可靠[43]。

2.3 抗氧化能力實驗結果

DPPH實驗是一種高效、靈敏的植物抗氧化能力評價模型，被測樣品的自由基清除能力與其潛在的提供質子能力相關；ABTS實驗被廣泛用于估計植物樣品的抗氧化能力，其可以測試樣品中的親脂性和親水性成分的抗氧化活性；FRAP法通過將Fe3+-TPTZ還原為Fe2+-TPTZ來評估天然產物的還原能力[44-45]?？Х然ǘ嗵强寡趸瘜嶒灲Y果見表4，咖啡花多糖對DPPH自由基、ABTS+自由基均表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性，但與蘆丁相比，其抗氧化活性較低。

表4 咖啡花多糖的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activities of polysaccharides from coffee flowers

3 結論

本實驗以云南小?？Х然樵希捎贸曒o助提取云南小?？Х然ǘ嗵牵ㄟ^對超聲時間、超聲溫度、液料比、超神功率、浸泡時間和醇沉濃度6個因素考察的基礎上，發(fā)現(xiàn)超聲時間、超聲溫度和超聲功率對咖啡花多糖的提取具有重要的影響。再通過響應面優(yōu)化超聲時間、超聲溫度和超聲功率，確定咖啡花多糖的最佳工藝條件為：超聲溫度69.5 ℃，超聲時間93 min，超聲功率175 W，液料比10:1 mL/g，浸泡時間30 min，乙醇濃度80%。該條件下多糖得率為2.292%±0.061%。該方法能有效提高咖啡花多糖的得率，同時縮短了提取時間和減少乙醇的使用量。抗氧化實驗結果表明，咖啡花多糖顯示弱抗氧化能力。本研究將為進一步的開展咖啡花多糖分離純化以及活性功能研究提供參考，也將為咖啡的進一步開發(fā)利用提供理論依據和支撐。