黎玉環(huán) 熊光潤 鄭永強(qiáng) 李 敏

（宜昌市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，宜昌 443000）

腦卒中是由于血管堵塞或破裂導(dǎo)致大腦供血不足引起腦損傷的一種急性腦血管疾病[1]，包括缺血性和出血性兩大類，其中缺血性腦卒中占80%以上[2]。缺血性腦卒中是一個(gè)復(fù)雜的生理病理過程，線粒體損傷、興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等均會(huì)導(dǎo)致腦缺血損傷[3]?，F(xiàn)階段治療急性腦出血的主要手段是在合適時(shí)間窗內(nèi)溶栓，但此方案可能會(huì)進(jìn)一步加重腦缺血所致的炎癥及谷氨酸興奮毒性，導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷[4]。近十幾年來，隨著對(duì)缺血性腦損傷的不斷探索，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，多種分子與缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)[5]。磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的促炎、促腫瘤通路，被先前的研究發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生理過程參與不同的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[6]。MicroRNA-200c（miR-200c）作為小非編碼RNA家族的一員，被證實(shí)與代謝性疾病以及惡性腫瘤疾病的進(jìn)展有關(guān)[7]。李蓋天[8]的研究表明，過表達(dá)miR-200c可通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并影響胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素等藥物的抵抗性。然而，目前尚不清楚miR-200c調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路在腦缺血再灌注損傷過程中的作用機(jī)制。本研究探討側(cè)腦室注射miR-200c對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護(hù)作用，并研究其潛在調(diào)控機(jī)制，為腦缺血再灌注損傷提供更多治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

40只雄性SD大鼠由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（鄂）2017-0065]，體質(zhì)量220～260 g。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫的飼養(yǎng)籠中，保持相對(duì)濕度為55%左右，給予充足的光照和經(jīng)紫外線消毒后的水源，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)審查及批準(zhǔn)。倫理編號(hào)：YC.20210114S0321510

1.2 模型制作及分組

40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、miRNC組和miR-200c組，每組10只。除假手術(shù)組外，模型組、miR-NC和miR-200c組均采用線栓法構(gòu)建腦缺血再灌注損傷模型，具體操作如下：首先用10%的水合氯醛以腹腔注射的方式將各組大鼠進(jìn)行麻醉，由頸部正中切開皮膚，分離肌肉組織后暴露頸動(dòng)脈，夾緊頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，中間剪斷將直徑為0.26 mm的魚線沿頸內(nèi)動(dòng)脈方向輕柔插入，當(dāng)遇到阻力時(shí)停止，并在頸內(nèi)動(dòng)脈近心端結(jié)扎動(dòng)脈，縫合切口，線頭留置約3 cm于體外。缺血2 h后拔出魚線約10 min以達(dá)到再灌注的目的。假手術(shù)組大鼠插線深度維持在10 mm以下，其他處理與上述一致。手術(shù)過程順利且出現(xiàn)大鼠死亡，當(dāng)大鼠清醒后出現(xiàn)爬行追尾情況，提尾時(shí)左前肢內(nèi)收屈曲視為模型制作成功，手術(shù)結(jié)束后，各組大鼠仍保持單籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 側(cè)腦室注射載體

模型制作成功3 d后，假手術(shù)組大鼠不做任何處理，其余各組大鼠用10%水合氯醛以腹腔注射的方式將各組大鼠進(jìn)行麻醉，將各組大鼠以俯臥位固定于腦立體定位儀上，切開頭皮，暴露頭骨，由前囪向右方及后方各平移3.5 mm，于顱骨處開孔后進(jìn)針3.8 mm，模型組、miR-NC組和miR-200c組分別經(jīng)側(cè)腦室注射生理鹽水、miR-NC和miR-200c，劑量均為2 μL，注射速率為0.25 μL/min，注射完畢后停留約10 min后緩慢拔出注射器，以防外溢，封閉顱骨處開孔。消毒后縫合頭皮，小鼠清醒后仍保持單籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

模型制作成功24 h后依據(jù)改良的Longa法[9]對(duì)各組大鼠神經(jīng)行為功能進(jìn)行評(píng)分，總分為0～5分，得分越高，神經(jīng)功能缺陷越嚴(yán)重。0分：大鼠行為正常，不存在神經(jīng)功能缺陷；1分：大鼠右前爪無法完全伸展；2分：大鼠表現(xiàn)為向右單側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠表現(xiàn)為向右單側(cè)傾倒及翻轉(zhuǎn)；4分：大鼠不能行走或爬行，喪失意識(shí)；5分：大鼠死亡。

1.5 腦組織含水量

模型制作成功24 h處死小鼠，切除小腦、腦干，清洗后稱重大腦濕重，干燥后稱大腦干重，按照干濕重比值計(jì)算腦組織含水量。

1.6 腦梗死體積

模型制作成功24 h后取腦組織保存于-20℃冷凍30 min，采用2，3，5－三苯基氯化四氮唑染色法測(cè)定各組大鼠腦梗死體積，將冰凍過的腦組織制成厚度約為2 mm的冠狀片，采用2%的2，3，5－三苯基氯化四氮唑溶液（上海齊源生物科技有限公司；貨號(hào)：26-729）進(jìn)行染色，福爾馬林固定后拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件按照“腦梗死體積=（病灶體積/腦總體積）× 100%”計(jì)算各組大鼠的腦梗死體積。

1.7 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)

取各組大鼠腦組織，眼科剪剪碎后組織液進(jìn)行裂解，TRIzol提取腦組織內(nèi)的總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，GeneAmp PCR儀（美國ABI公司；型號(hào)：9700型）檢測(cè)各組大鼠腦組織中以U6作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參后miR-200c的相對(duì)mRNA表達(dá)水平，設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共循環(huán)40次，95℃ 60 s、95℃ 30 s、95℃ 30 s解離。miR-200c上游引物：5'-CGTCTT ACCCAGCAGTGTTT-3'，下游引物：5'-ATACTGCC GGGTAATGATGGA-3'。

1.8 氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測(cè)

采用分光光度法[10]測(cè)定大鼠腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPX）的水平。首先將各組大鼠腦組織從-20℃的冰箱內(nèi)取出，低溫條件下以生理鹽水稀釋，混勻后3 000 r/min高速離心20 min，收集上清液。以黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)上清液中SOD含量，硫代巴比妥酸法檢測(cè)上清液中MDA含量，化學(xué)比色法檢測(cè)上清液中GSH-PX含量，嚴(yán)格按照說明書要求操作。以上試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.9 炎癥因子水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法[11]測(cè)定大鼠腦組織中炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平。取1.8中收集的腦組織上清液，采用IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒分別檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，嚴(yán)格按照說明書要求操作。以上試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.10 神經(jīng)細(xì)胞凋亡及PI3K/Akt/mTOR通路檢測(cè)

收集各組大鼠腦組織，在預(yù)冷的緩沖液中進(jìn)行勻漿，高速離心后收集上清液。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，裂解液充分裂解后將各組蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為等量，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，與凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（recombinant Bcl2 associated X protein，Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic protease-3，caspase 3）、PI3K、Akt和mTOR等一抗兔抗大鼠（1∶1 000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔（1∶10 000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）共同孵育1 h，采用GelDoc-2000 Imagine軟件進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，以β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參對(duì)各組蛋白條帶進(jìn)行定量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次實(shí)驗(yàn)中采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較以單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量、腦梗死體積

與假手術(shù)組相比，其他3組神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量和腦梗死體積均顯著升高（P＜0.05），miR-200c組神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量和腦梗死體積顯著低于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量、腦梗死體積差異（n=10，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量、腦梗死體積差異（n=10，±s）

*P＜0.05 vs假手術(shù)組； #P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs miR-NC組

組別神經(jīng)功能評(píng)分（分）腦含水量（%）腦梗死體積（%）假手術(shù)組072.43±1.590模型組3.02±0.68*87.68±2.43*32.07±4.33*miR-NC組2.89±0.71*85.94±2.26*30.88±3.56*miR-200c組2.04±0.36*#△75.36±1.63*#△16.49±2.11*#△P＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 大鼠腦組織中miR-200c表達(dá)

與假手術(shù)組、模型組和miR-NC組相比，miR-200c組miR-200c表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠腦組織內(nèi)miR-200c表達(dá)

2.3 神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)

與假手術(shù)組相比，其他3組Bax、caspase 3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；miR-200c組Bax、caspase 3蛋白表達(dá)顯著低于模型組和miR-NC組，Bcl2蛋白表達(dá)顯著高于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)差異

2.4 氧化應(yīng)激反應(yīng)

與假手術(shù)組相比，其他3組SOD和GSH-PX含量顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；miR-200c組SOD和GSH-PX含量較模型組和miR-NC組顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)差異（n=10，±s，pg/mL）

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)差異（n=10，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs假手術(shù)組； #P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs miR-NC組

組別SODMDAGSH-PX假手術(shù)組135.62±15.33123.15±28.71121.23±16.08模型組 27.84±4.57* 1683.27±251.46* 32.46±5.12*miR-NC組 28.11±5.85* 1705.16±214.85* 30.87±4.95*miR-200c組 69.77±7.94*#△ 724.81±148.74*#△ 69.18±7.47*#△P＜0.001＜0.001＜0.001

2.5 炎癥因子水平

與假手術(shù)組相比，其他3組IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著增多（P＜0.05），miR-200c組IL-6、IL-1β、 TNF-α含量顯著低于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（表3）。

表3 各組大鼠炎癥指標(biāo)差異（n=10，±s，pg/mL）

表3 各組大鼠炎癥指標(biāo)差異（n=10，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs假手術(shù)組； #P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs miR-NC組

組別IL-6IL-1βTNF-α假手術(shù)組12.46±1.4718.45±2.1516.31±1.25模型組34.27±4.02*42.16±4.45*37.34±3.84*miR-NC組35.43±3.72*41.73±4.29*38.02±3.75*miR-200c組25.04±2.61*#△29.05±3.22*#△22.45±2.86*#△P＜0.001＜0.001＜0.001

2.6 PI3K/Akt/mTOR通路分子表達(dá)

與假手術(shù)組相比，其他3組PI3K/Akt/mTOR通路被顯著抑制（P＜0.05），miR-200c組PI3K/Akt/mTOR的活化水平顯著高于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠PI3K/Akt/mTOR通路分子表達(dá)差異

3 討論

本研究采用線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察側(cè)腦室注射miR-200c對(duì)模型大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制，結(jié)果顯示模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量和腦梗死體積顯著升高，表明該方法建模成功。側(cè)腦室注射miR-200c后，miR-200c通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路顯著改善模型大鼠的腦損傷，為腦缺血再灌注損傷的診斷和治療提供新的分子靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，miR-200c通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路顯著減輕腦組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮顯著的腦保護(hù)作用。與既往國外文獻(xiàn)結(jié)論并不完全一致，Tang等[12]研究表明，緩激肽1受體拮抗劑可阻斷緩激肽1受體，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞微囊泡miR-200c向神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)傳遞，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。究其原因，可能與miR-200c靶向的下游分子不同有關(guān)，本研究中miR-200c作用于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，上調(diào)其表達(dá)，減少促氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA的含量，增加抗氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和GSH-PX的含量，同時(shí)抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平，改善神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量和腦梗死體積，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase 3的表達(dá)，上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13]，為腦缺血再灌注導(dǎo)致的腦損傷提供新的有效治療和改善方案，對(duì)于腦卒中患者的臨床治療而言意義重大。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)參與影響細(xì)胞生成、分化、增殖、遷移、侵襲和凋亡的經(jīng)典通路，參與多種惡性腫瘤疾病、急慢性炎癥疾病和損傷疾病的發(fā)生發(fā)展[14-15]。有研究顯示，miR-200c可通過調(diào)控PI3K/Akt通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲，與乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[16]。關(guān)于miR-200調(diào)控PI3K/Akt在神經(jīng)元及腦組織中發(fā)揮的效應(yīng)也有國外學(xué)者曾報(bào)道過。Du等[17]研究表明，miR-200c-3p在癲癇大鼠海馬組織中高表達(dá)，miR-200c-3p通過激活A(yù)kt信號(hào)通路降低海馬組織中炎癥介質(zhì)的含量，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制癲癇大鼠馬海神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)元損傷，這與本研究結(jié)果較為相符。本研究結(jié)果也顯示，側(cè)腦室注射miR-200c通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的磷酸化水平，顯著抑制腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量和腦梗死體積。其機(jī)制可能與miR-200c對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路的調(diào)控作用有關(guān)，miR-200c通過酪氨酸激酶激活PI3K的磷酸化，并在丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1的作用下活化Akt信號(hào)[18]，再與磷酸化的結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2結(jié)合，增強(qiáng)腦中富含的Ras同源蛋白活性，上調(diào)mTOR的磷酸化水平[19]，發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步說明miR-200c上調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)級(jí)聯(lián)在腦缺血再灌注腦保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，miR-200c可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，顯著抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦含水量和腦梗死體積，發(fā)揮顯著的腦保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示miR-200c和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在腦缺血再灌注患者的治療中擁有廣闊應(yīng)用前景，臨床可考慮將PI3K/Akt/mTOR通路作為改善缺血性腦卒中的重要靶點(diǎn)，以減少患者腦卒后腦損傷。