劉家林,熊 歡,田春英,馬 琴,鄧 靜,游章強*

(1.綿陽師范學(xué)院生態(tài)安全與保護(hù)四川省重點實驗室，四川綿陽 621006；2.甘肅祁連山國家級自然保護(hù)區(qū)，甘肅張掖 734000)

0 引言

巖羊(Pseudoisnayaur)又名青羊，石羊，崖羊和藍(lán)羊，屬于偶蹄目(Artiodactyla)，牛科(Bovidae)，巖羊?qū)?Pseudois).巖羊體背淺灰色，腹部及臀部為白色，雄性頭部長有大型的角，長達(dá)60 cm，兩角的基部比較靠近，僅有一條縫隙，雌性角短[1]，雄性體型稍微比雌性大[2].雄性巖羊全身毛色大致為青灰色，四肢外側(cè)的毛呈現(xiàn)為黑色，背上有一條暗色中線，耳內(nèi)側(cè)、上下唇、頜及兩側(cè)顏色為灰白色；雌性巖羊的毛色較淺，巖羊幼仔的毛色隨著年齡的增長加深[3]，巖羊主要食禾本科莎草科和薔薇科植物[4].巖羊主要分布于青藏高原及其周圍相鄰的山域[5]，是雪豹(Pantherauncia)、狼(Canislupus)、紅狐(Vulpesvulpes)和棕熊(Ursusarctos)等大型食肉動物的捕食對象[6].關(guān)于巖羊的研究目前主要集中在生境選擇、種群生態(tài)學(xué)、行為生態(tài)學(xué)和種群遺傳學(xué)等領(lǐng)域[1]，遺傳和圈養(yǎng)種群腸道菌群研究等[7-8]，關(guān)于祁連山巖羊種群腸道菌群落的研究未見報道.巖羊是重要的經(jīng)濟(jì)物種，由于其數(shù)量多，分布較廣泛，受人類活動及生境破碎化的影響[9]，近年來種群數(shù)量逐年下降，現(xiàn)已被國家重點保護(hù)野生動物名錄列為Ⅱ級保護(hù)動物[10].哺乳動物腸道菌群主要有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)及厚壁菌門(Firmicutes)等6大門類[11]，這些微生物與宿主互利共生、相互影響、相互作用，與宿主一同構(gòu)成了復(fù)雜的腸道菌類生態(tài)系統(tǒng)[12].大量研究表明，腸道菌群與動物的免疫調(diào)控，物質(zhì)代謝，營養(yǎng)吸收等生理活動有關(guān).穆洋等[13]的研究表明，通過對雞的腸道微生物的調(diào)節(jié)能提高雞的血清免疫球蛋白等免疫物質(zhì)，可以增強雞的免疫力；在物質(zhì)代謝方面，薄亭貝等[14]的研究表明，通過對布氏田鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的分析，發(fā)現(xiàn)腸道菌群通過cAMP-PKA-pCREB信號通路影響宿主進(jìn)行能量調(diào)節(jié)和產(chǎn)熱；在營養(yǎng)吸收方面，張亞南等[15]的研究表明，腸道微菌群通過腸-腦軸傳導(dǎo)系統(tǒng)，將飽感轉(zhuǎn)遞給中樞系統(tǒng)從而調(diào)控食欲.

本研究通過無損傷取樣法和16S rRNA擴(kuò)增子測序分析法，對甘肅省祁連山國家級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)巖羊腸道微生物組成和多樣性的季節(jié)差異進(jìn)行了比較分析，通過研究分析巖羊腸道菌群，彌補了甘肅省祁連山野生巖羊的腸道微生物研究空白，為巖羊的管理與保護(hù)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本采集信息

根據(jù)該區(qū)域的氣候和植被類型特征，本研究將采樣時間分別定義為草青季(2019年5月上旬)和草枯季(2018年10月上旬).采樣期間，沿保護(hù)區(qū)日常巡護(hù)路線步行尋找?guī)r羊糞樣，發(fā)現(xiàn)新鮮糞樣后，采集人戴上一次性手套，采集糞樣堆里中間顆粒裝入實驗室已滅菌過后的15 mL離心管進(jìn)行密封保存，每個糞堆只采集一個樣本，并記錄每次采樣糞堆的GPS位點，并及時將糞樣置于液氮中保存.本次實驗分別在草青季和草枯季各采取了15個樣本，并選擇保存較好的各10個，用干冰盒快遞運送至上海美吉生物有限公司進(jìn)行測序.

1.2 糞便16S rDNA測序及分析流程

采用DNA提取試劑盒(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)提取樣本總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，于-20 ℃保存.以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA V3-V4區(qū)引物：338F(5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3＇)，806R(5＇-GCACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司).PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，13個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測初步定量，使用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，構(gòu)建高通量測序文庫，IlluminaMiseq上機測序.

1.3 數(shù)據(jù)分析

樣品經(jīng)Illumina MiSeq進(jìn)行雙端測序獲得的原始序列經(jīng)除去接頭序列后的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入QIIME2[16](version 2020.2)進(jìn)行一系列的分析.利用DADA2[17]Divisive amplicon denoising algorithm(via q2-dada2)對原始測序序列進(jìn)行過濾、質(zhì)控、除去嵌合體、合并雙端序列、去噪為擴(kuò)增序列變體Amplicon sequence variant (ASV).采用Feature-classifier[18](via q2-feature-classifier)中classify-sklearn基于Na?ve Bayes方法以Silva(version 138 https://www.arb-silva.de/)數(shù)據(jù)庫為參考對一系列的擴(kuò)增序列變體進(jìn)行物種注釋，獲得ASV在分類水平：門(Phylum)，綱(Class)，目(Order)，科(Family)，屬(Genus)的注釋信息.

在門和屬級水平上，統(tǒng)計樣品的物種豐度和多樣性.使用QIIME2進(jìn)行多樣性分析，其中α多樣性分析(包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Coverage指數(shù))，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)計算菌群豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)計算菌群多樣性，Coverage指數(shù)是指各樣品文庫的覆蓋率.β多樣性分析對ASV特征表進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principle coordination analysis，PCoA)，研究不同組間或樣品間的菌群相似性和分類學(xué)差異性.采用Kolmogorov-Smirnov檢驗法對兩組樣本相對豐度數(shù)據(jù)分布型進(jìn)行檢驗，利用獨立樣本t檢驗，檢驗?zāi)c道菌群組成和多樣性的季節(jié)差異.利用LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size 線性判別分析)[19]分析巖羊腸道群落的差異性物種.

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

基于Illumina MiSeq測序平臺對細(xì)菌16S rRNA基于V3～V4片段測序分析，20份樣品測得1 302 393條有效序列，經(jīng)過對原始測序序列進(jìn)行過濾、質(zhì)控并除去嵌合體后得到224 910條序列，序列平均長度463.04 bp，共獲得5 813個擴(kuò)增序列變體(ASV).將所獲得的ASV與數(shù)據(jù)庫(Silva 138)進(jìn)行注釋分析，在20個巖羊糞便中，檢測到的微生物共屬于17個門、34個綱、81個目、132個科、204個屬.通過繪制稀釋曲線來評判測序數(shù)據(jù)是否足以反映樣本種的物種多樣性(圖1).隨著測序深度的不斷增加，曲線趨向平緩，表明測序深度能夠覆蓋樣品中的絕大多數(shù)物種，能夠反映所有樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性.本次測序，所有樣品的測序深度覆蓋率既Coverage指數(shù)在99.86%～99.90%左右，進(jìn)一步表現(xiàn)出了測序深度足以檢測糞便樣本中的微生物群落信息.

圖1 α多樣性稀釋曲線

2.2 群落組成分析

草青季巖羊的腸道菌群落中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門Firmicutes(44.27%)、放線菌門Actinobacteriota(25.21%)、擬桿菌門Bacteroidota(23.26%)；草枯季優(yōu)勢菌門為放線菌門Actinobacteriota(64.39%)，厚壁菌門Firmicutes(16.27%)，擬桿菌門Bacteroidota(8.57%)，變形菌門Proteobacteria(6.46%).在屬級水平上，草青季巖羊的腸道菌群落中優(yōu)勢菌屬為節(jié)桿菌屬Arthrobacter(20.54%)，Rikenellaceae_RC9_gut_group(5.56%)，UCG-005(5.19%)，Christensenellaceae_R-7_group(4.16%)；草枯季巖羊的腸道菌群落中優(yōu)勢菌屬為節(jié)桿菌屬Arthrobacter(54.83%),Rikenellaceae_RC9_gut_group(0.40%)，Christensenellaceae_R-7_group(3.49%)，從草青季到草枯季，門級水平上厚壁菌門Firmicutes減少了(28.00%)、擬桿菌門Bacteroidota減少了(14.69%)，放線菌門Actinobacteriota增多了(39.18%).在屬級水平上，節(jié)桿菌屬Arthrobacter增多了(34.29%)(圖2).

圖2 不同季節(jié)間巖羊腸道微生物群落相對豐度(A:門水平，B:屬水平)

2.3 季節(jié)差異分析

通過對不同時期的巖羊腸道微生物菌群的LEfSe分析(|LDA score≥6|,P<0.05)，可以找出巖羊腸道菌群季節(jié)顯著差異的分類單元.在進(jìn)化分支圖中，草青季和草枯季從門級到屬級水平共發(fā)現(xiàn)了44個差異性特征，其中37種差異性特征在草青季，7種差異性特征在草枯季(圖3-A).草青季擬桿菌綱Bacteroidia和擬桿菌門Bacteroidetes以及屬水平上的Rikenellaceae_RC9_gut_group(圖3-B)和草枯季差異性特征微桿菌科Microbacteriaceae，類諾卡氏菌Nocardioidaceace和丙酸桿菌目Propionibacteriales富集顯著.

A.進(jìn)化分支圖：由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級別.在不同的級別上的每一個圓圈代表該級別水平下的一個分類，圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比.B.LDA值柱狀圖.

2.4 群落多樣性分析

巖羊在草青季和草枯季的腸道菌群α多樣性指數(shù)反映出了巖羊腸道微生物的豐富度和多樣性(圖4)，通過對兩組樣本進(jìn)行指數(shù)間差異檢驗，發(fā)現(xiàn)草青季的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)(P<0.001)都高于草枯季.結(jié)果顯示巖羊腸道菌群草青季的多樣性和豐富度都高于草枯季.

圖4 不同組間Alpha多樣性指數(shù)

基于未加權(quán)的Unifrac的方法分別對20個樣本采用進(jìn)行PCoA分析，主成分PC1貢獻(xiàn)率為21.51%，PC2的貢獻(xiàn)率為10.63%.草青季和枯草季的樣本各自聚在了一起(圖5).利用Permanova test分析發(fā)現(xiàn)巖羊腸道微生物的組成具有顯著的季節(jié)差異(F=3.92,P<0.001).

圖5 草青季和草枯季祁連山巖羊腸道微生物PCoA分析

3 討論與總結(jié)

腸道微生物有利于宿主的能量和物質(zhì)的代謝，其組成與結(jié)構(gòu)受食物資源種類和營養(yǎng)成分等因素的影響[20].本研究中，巖羊腸道微生物群落的組成與結(jié)構(gòu)存在顯著的季節(jié)差異，可能與季節(jié)變化導(dǎo)致其食物資源種類及食物資源營養(yǎng)成分變化相關(guān).

祁連山處于我國三大高原的交界處，獨特的地勢條件，植物垂直帶譜明顯.在海拔3 km上的植被類型主要是高寒草甸，海拔2～3 km的植被類型主是灌叢[21].草青季巖羊生活在祁連山3 km以上的地區(qū)，進(jìn)入草枯季后，巖羊從高海拔的區(qū)域遷徙至海拔2～3 km區(qū)域[22-23].在適應(yīng)季節(jié)變化的遷徙過程中，巖羊的食物種類發(fā)生了明顯的變化.食物資源種類變化能改變宿主腸道微生物的組成與功能[24].祁連山巖羊腸道微生物的組成差異可能與其食物資源種類的季節(jié)變化相關(guān).

物候更替導(dǎo)致了植物營養(yǎng)成分改變，草青季植物體內(nèi)粗蛋白、粗脂肪高于草枯季，草青季粗纖維比草枯季低[25].研究表明，攝入較高脂類將會導(dǎo)致宿主腸道菌群中厚壁菌門的比例增加[24]，擬桿菌門的菌群宿主吸收蛋白質(zhì)等起著重要作用[26].本研究中巖羊草青季腸道菌群落中的厚壁菌門和擬桿菌門的組成比例高于草枯季，可能與草青季期食物資源體內(nèi)的粗脂肪和粗蛋白高于草枯季相關(guān).

此外本研究還發(fā)現(xiàn)，在草青季到草枯季時期門級水平上均出現(xiàn)了較高豐度的放線菌門，而放線菌門的菌種有利于宿主機體抵抗外來的病原體[27].在屬級水平上均出現(xiàn)了較高豐度的節(jié)桿菌屬，節(jié)桿菌屬普遍存在于土壤中，其在土壤中存在的原因被認(rèn)為是自身營養(yǎng)多態(tài)性[28]，而在脊椎動物的腸道中存在的節(jié)桿菌屬能夠把木糖轉(zhuǎn)為短鏈脂肪酸[29]，節(jié)桿菌屬在巖羊的腸道菌群存在可能主要與巖羊生活環(huán)境與營養(yǎng)有關(guān).通過對巖羊腸道微生物進(jìn)行α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，草青季的巖羊的腸道微生物多樣性和豐富度都高于草枯季巖羊腸道微生物多樣性，用指數(shù)間差異檢驗檢驗兩組間的α多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)差異顯著，從PCoA分析結(jié)果來看草青季和草枯季兩組之間有明顯的差異性.

綜上所述，植被垂直帶譜與物候更替導(dǎo)致食物種類和營養(yǎng)成分變化對祁連山國家級自然保護(hù)區(qū)野生巖羊腸道微生物群落的組成和多樣性具有明顯的影響.