王立光,葉春雷,陳 軍,李進京,羅俊杰

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070)

連作障礙作為困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個復(fù)雜問題，其形成機制是農(nóng)業(yè)發(fā)展研究的熱點，備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。連作障礙是土壤內(nèi)部諸多因素綜合作用的外在表現(xiàn)，目前研究主要認(rèn)為土壤理化性質(zhì)、自毒作用及土壤微生物群落是引起連作障礙發(fā)生的主要因素[1-3]。土壤微生物在土壤中一直扮演著重要角色，對土壤養(yǎng)分的吸收轉(zhuǎn)化及作物生長發(fā)育具有顯著影響[4-5]。研究表明，連作障礙程度受到種植作物、種植模式、土壤類型及連作年限等因素的影響，連作會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與物種多樣性造成破壞，抑制有益微生物的生長，促進病原微生物積累與生長，造成土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低[6-13]。細菌是土壤微生物群落中的重要類群，在土壤微生物群落中起著重要作用。大豆、硒砂瓜及煙草等研究發(fā)現(xiàn)，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與連作障礙關(guān)系密切，受連作年限和作物種類的影響[6-7,14]。因此，對不同作物連作中的細菌群落變化進行研究，將對破解其連作障礙有重要意義。

胡麻(Linumusitatissimum)是我國西北和華北黃土高原地區(qū)重要的油料作物。在實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其干旱和半旱區(qū)的種植戶發(fā)現(xiàn)，胡麻連作2～3 a后其產(chǎn)量就顯著降低，而利用間作或輪作模式，可使其狀況得到明顯改善。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，胡麻連作3 a會導(dǎo)致土壤水提液自毒作用明顯加強，降低種子萌發(fā)、抑制植株生長，降低產(chǎn)量，并對土壤酶活性造成不利影響，表現(xiàn)出明顯的連作障礙現(xiàn)象[15-18]。目前，關(guān)于胡麻連作障礙的研究雖然已經(jīng)取得部分成果，但胡麻連作對土壤細菌群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)影響的研究少有報道，因此，本試驗通過高通量測序技術(shù)對胡麻連作土壤內(nèi)細菌群落進行測定，研究胡麻連作條件下土壤細菌群落變化，以期從細菌群落變化角度解析胡麻連作障礙機制，從而為消減胡麻連作障礙提供理論依據(jù)，為胡麻產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗地概況

試驗所用胡麻品種為隴亞10號，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所提供。試驗地點為甘肅省榆中縣試驗地(E104°06′35″、N35°50′36″)，海拔1 600 m，屬于黃土高原丘陵溝壑半干旱高寒區(qū)，年均降水量450 mm，年蒸發(fā)量1 400～1 450 mm,樣地區(qū)域土壤類型為黃綿土，有機質(zhì)18.5 g·kg-1,全氮1.15 g·kg-1,全磷1.5 g·kg-1,有效氮49.4 mg·kg-1,有效磷38.9 mg·kg-1,速效鉀104.1 mg·kg-1,pH 8.13。試驗地為澆灌地，3月底胡麻種植，整個生長期實行規(guī)范化管理，胡麻生育期充分澆灌2次。

1.2 田間試驗處理

田間試驗設(shè)置胡麻種植1 a(T1)、連作2 a(T2)和連作3 a(T3)，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，隨機區(qū)組排列，每小區(qū)面積30 m2(6 m×5 m)。為防止小區(qū)間相互影響，小區(qū)間用寬60 cm、高50 cm土埂分隔。

1.3 土樣采集

在收獲后分別采集胡麻種植1 a、連作2 a和連作3 a的根際土壤，土壤樣品采集采用“S”型布點，保證6～8個采樣點，采樣土壤充分混合，剔除枯葉、腐葉等，每小區(qū)獲得2份土樣。每種處理的3個重復(fù)土樣充分混合，最終每種處理獲得2個土壤樣本，用四分法取適量土樣放入自封袋，迅速置于干冰上保存，帶回實驗室進行后續(xù)分析。

1.4 樣品DNA提取及高通量測序

準(zhǔn)確稱取0.1 g土樣，按照土壤微生物DNA提取試劑盒說明書步驟，分別提取各土樣的總DNA，Drop2000測定濃度和純度,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。設(shè)計帶有barcode的融合引物，針對細菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進行PCR擴增，擴增特異性引物序列為338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。對擴增產(chǎn)物進行2 %瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收PCR產(chǎn)物，并用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量檢測,按照每個樣本測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合，合格樣品交由美吉生物醫(yī)藥科技公司進行Miseq文庫構(gòu)建及高通量測序，測序平臺為PE300。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

測序后，對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾處理，得到優(yōu)化序列，進行OTU(Operational taxonomic uniits)聚類分析、Alpha多樣性分析、物種組成分析、Beta多樣性分析及物種差異分析。其中，序列拼接利用FLASH、序列過濾利用QIME，聚類利用UPARSE pipeline軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡麻不同連作年限下土壤細菌OTU分布

測序結(jié)果優(yōu)化后共獲得193 836條有效序列，按97%相似度歸并后通過OTU聚類分析得到1 861條OTU。對各土樣測序得到的OTU進行分類，結(jié)果表明三類樣品中共有的OTU為1 578條，T1、T2和T3分別具有特異OTU為30、13和37條，僅T1和T2共有的OTU為45條，T1與T3共有而T2沒有的OTU為67條，T1不具有而T2和T3共有的OTU為91條(圖1)。

2.2 胡麻不同連作年限下土壤細菌物種多樣性分析

采用Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對不同連作年限的胡麻根際土壤細菌群落Alpha多樣性進行分析，從而反映細菌群落的豐度和多樣性。由表1可知各樣本文庫覆蓋率均大于99.4%，說明測定結(jié)果能夠真實反映各樣本的細菌群落組成。不同處理樣本根際細菌多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)表現(xiàn)為T1>T2>T3，Simpson指數(shù)表現(xiàn)為T3>T2>T1，細菌群落豐度(Chao指數(shù)和Ace指數(shù))則表現(xiàn)T3>T1>T2，說明細菌多樣性隨著連作年限增加而降低，而細菌豐度先降低后再升高，且連作3 a的細菌豐度高于連作1 a。

表1 不同連作年限土壤中細菌的Alpha多樣性分析Table 1 Alpha bacteria diversity statistical in soil samples of different continuous cropping years

2.3 胡麻不同連作年限下土壤細菌物種豐富度分析

樣本檢測出的細菌主要分布在36個門，77個綱，144個目，259個科，428個屬，804個種。在門分類水平對土壤細菌分析發(fā)現(xiàn)，T1、T2和T3土壤具有的細菌門數(shù)分別為33、32個和35個，其中有31個細菌門三者所共有，T1和T2土壤內(nèi)的WWE3菌門在T3土壤內(nèi)未檢測到，T2土壤內(nèi)未檢測到T1和T3土壤內(nèi)的Peregrinibacteria菌門，衣原體門(Chlamydiae)、梭桿菌門(Fusobacteria)和BJ-169菌門只有在T3土壤內(nèi)檢測到(圖2A)。對土壤細菌優(yōu)勢菌門(豐度占比>0.01)分析表明，3種土壤內(nèi)的優(yōu)勢菌門均為相同的12個菌門，但不同土壤內(nèi)各優(yōu)勢細菌門的相對豐度存在差異，相對豐度前四的優(yōu)勢菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠灣菌門(Chloroflexi)(圖2B)。相對豐度第一的變形菌門隨著種植年限增長相對豐度逐年降低，其相對豐度分別為31.74%、27.69%和25.21%。酸桿菌門表現(xiàn)出先升高再降低，T3中的相對豐度比T1降低了35.76%。放線菌門相對豐度變化與變形菌門相反，表現(xiàn)出隨著種植年限增長相對豐度逐年升高，相對豐度分別為12.16%、15.38%和24.12%。綠灣菌門的相對豐度分別為9.58%、10.99%和11.82%，與放線菌門一樣，都是隨著種植年限增長而升高。T3土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度明顯低于T1和 T2，僅是T1和T2的29.82%和35.62%。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在T2和T3土壤內(nèi)的相對豐度接近，分別為4.98%和5.35%，但T1土壤內(nèi)相對豐度為8.02%，明顯高于T1和T2。后壁菌門(Firmicutes)在各土壤內(nèi)的相對豐度為T3(9.67%)>T1(3.29%)>T2(1.32%)。硝化螺旋菌門(Nitrospirae)在T1土壤內(nèi)相對豐度為2.99%，高于T2和T3土壤內(nèi)的相對豐度1.28 %和1.33%。疣微菌門(Verrucomicrobiae)和浮霉菌門(Planctomycetes)也隨著連作年限增長相對豐度逐漸增加，T3土壤內(nèi)其相對豐度分別達到1.57%和1.41%。另外藍藻菌門(Cyanobacteria)和Saccharibacteria菌門在T2土壤內(nèi)的相對豐度較高，分別為2.06%和1.02%(圖2B)。

圖2 門分類水平上不同連作年限土壤細菌物種相對豐度(A)及主要菌門(B)Fig.2 Relative abundance of different continuous cropping years of soil bacterial community(A)and major bacteria (B)at the level of phylum

2.4 胡麻連作對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)影響

對測序結(jié)果的主成分分析(Principal component analysis，PCA)發(fā)現(xiàn)，胡麻不同種植年限土壤細菌群落豐度差異比較明顯。如圖3A所示，土壤PC1貢獻率為38.81%，PC2的貢獻率為24.55%，T1分布在PC1的負值區(qū)域和PC2的正值區(qū)域，且分布集中，而T2分布于PC1和PC2的負值區(qū)域，分布相對較遠，T3聚集到PC1和PC2的正值區(qū)域，樣本集中?；赪eighted Unifrac距離矩陣進行聚類分析，如圖3B所示，T1和T2土壤聚為一類，T3土壤單獨分為一類，說明T1和T2土壤細菌群落差異相對小，隨著連作年限增長土壤細菌群落差異變大。

圖3 不同連作年限土壤中細菌群落β多樣性分析Fig.3 β diversity analysis of different continuous cropping years of soil bacterial communities

3 討論與結(jié)論

土壤內(nèi)細菌群落多樣性往往會伴隨連作障礙發(fā)生而改變。岳思君等[6]對不同連作年限硒砂瓜土壤群落研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限增長，細菌菌群多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)都逐漸增加。林震等[19]也研究證明連作4 a苜蓿根際土壤細菌群落多樣性指數(shù)高于0 a苜蓿。而高林等[7]對煙草連作土壤微生物群落分析發(fā)現(xiàn)，細菌的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)都隨著連作年限增長而下降。納小凡等[20]對枸杞種植研究表明，與對照樣地相比，連作地種植枸杞根際細菌群落α多樣性降低。大豆中也有證據(jù)表明，連作2 a根際土壤中細菌豐富度和多樣性指數(shù)低于連作0 a[14]。這種隨連作種植年限增長而細菌多樣性指數(shù)降低的現(xiàn)象也在黑胡椒、黃瓜、草莓和花生等作物中得到證實[21-24]。這些研究成果顯示，連作土壤根際中細菌群落多樣性的變化與栽培作物及連作年限相關(guān)，在特定的連作年限內(nèi)，有的隨連作年限而升高，有的隨連作年限而降低。本研究中胡麻連作土壤根際細菌群落的多樣性隨著連作年限而逐漸降低，但細菌豐度并未保持持續(xù)降低趨勢，而在連作3 a根際土壤內(nèi)豐富度指數(shù)最大，這與以上所示的研究成果都有所差異。

種植連作年限增加，土壤內(nèi)細菌群落差異也隨之改變，但不同作物連作對細菌群落影響也存在差別。煙草不同連作年限土壤細菌中變形菌門占比最高，放線菌門和泉古菌門的豐富度則隨著增加，細菌群落差異變大[7]。硒砂瓜連作土壤內(nèi)的優(yōu)勢菌門為放線菌門、變形菌門、綠灣菌門和酸桿菌門，放線菌門和酸桿菌門豐度隨著連作時間先增后降，變形菌門豐度隨著連作年限增長逐漸降低，而綠灣菌門豐度先降后增[6]。在大豆連作根際土壤細菌群落測定中發(fā)現(xiàn)，變形菌門和放線菌門豐度在連作2 a土壤中低于對照，而酸桿菌門和綠彎菌門豐度表現(xiàn)相反的趨勢[14]。這些已有的報道說明，不同作物種植土壤中各菌門的豐度存在差異，但放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠灣菌門等一般都包含在優(yōu)勢菌門內(nèi)。番茄根際土壤細菌優(yōu)勢菌門中也包含變形菌門和酸桿菌門[25]。本研究也得到相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在胡麻不同連作年限根際土壤內(nèi)的優(yōu)勢菌門數(shù)量和種類是相同的，但不同土壤中各菌門豐度不同。變形菌門和放線菌門在土壤中是有益的菌門，參與有機碳氮循環(huán)，在胡麻連作中，變形菌門豐度隨連作年限增長而降低，表現(xiàn)出與大豆、硒砂瓜等連作中相似的趨勢，不利于作物的生長，但放線菌門豐度卻表現(xiàn)出持續(xù)增高的趨勢，這與大豆連作中的趨勢相反，卻與煙草、硒砂瓜等連作中的早期趨勢相一致，說明隨著連作年限進一步增長，胡麻根際土壤內(nèi)的放線菌門豐度很可能會表現(xiàn)出下降的趨勢，從而進一步加劇連作障礙的危害。因此，今后繼續(xù)深入開展胡麻更長連作時間對細菌群落結(jié)構(gòu)影響研究，將對有效解決胡麻連作障礙十分必要。主成分分析表明，在胡麻不同種植年限的根際土壤內(nèi)，代表細菌群落分布的距離較遠，說明群落結(jié)構(gòu)存在較顯著差異。進一步的聚類分析顯示，相同連作年限的樣品聚集在一個分支，且隨連作年限增長樣品間聚類水平降低，說明連作改變細菌菌門所占比例，影響菌群結(jié)構(gòu)組成，這與煙草和黃花蒿連作土壤的研究結(jié)果一致[7,26]。本研究通過高通量測序分析了胡麻連作條件下根際土壤細菌群落的豐度及其變化規(guī)律，這些成果對改良胡麻種植技術(shù)及緩解連作障礙提供了理論基礎(chǔ)。