陳煒婷 鄧偉 李海濤 陳潔 胡慧娜

（國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心/海南南沙珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站 廣東廣州 510300）

目前，隨著全球工業(yè)化進(jìn)程的不斷加速，來自于礦山（排水）、化工、制酸、冶金及金屬表面酸性處理、電鍍、染料等行業(yè)產(chǎn)生的含重金屬離子廢水是工業(yè)廢水中最常見、危害程度最高的一種廢水，其特征是含有大量可溶性重金屬離子。重金屬離子不經(jīng)處理排入水體，會使受納水體酸化，產(chǎn)生潛在的腐蝕性，其中的重金屬如鉛、銅、鋅、鉻等可通過食物鏈積累，導(dǎo)致人體慢性中毒［1-5］。地下水中鉻含量為0.008 μmol/L～173 μmol/L，海底沉積物和土壤中鉻的含量為98 nmol/L～76 mmol/L，是第二大重金屬污染［6］。Cr（Ⅵ）的高可溶性及強(qiáng)流動性導(dǎo)致其污染源很難被追蹤，易污染水源。因此，處理含鉻廢水的研究關(guān)系到人類健康和生態(tài)環(huán)境，是含重金屬廢水處理中十分急迫的任務(wù)之一。

傳統(tǒng)的含重金屬離子廢水處理方法，如化學(xué)沉淀法、離子交換法、吸附法、電解法和氧化還原法等往往存在處理費用高、易導(dǎo)致二次污染等諸多缺點。微生物作為一種新興的處理技術(shù)，具有成本低、適用性強(qiáng)及無二次污染等優(yōu)點，已受到國內(nèi)外環(huán)境工作者的廣泛關(guān)注［7］。

芽孢桿菌，是一類能夠形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿菌或球菌，包括芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬和梭菌屬等。芽孢桿菌可存在于空氣、水體等環(huán)境中，對外界有害因子具有較強(qiáng)的抗性［8］。

本研究從臺山廣海灣惰性拆建物料處置區(qū)海洋沉積物中分離得到一株Cr（VI）抗性菌Y1，通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色以及16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定了該菌株。本研究還分析了該菌株的生長曲線，探討了不同pH、溫度和鹽度條件下該菌生長的最適環(huán)境條件，研究了不同初始鉻濃度下該菌的Cr（VI）還原特性。本研究為Cr（VI）污染環(huán)境治理提供了微生物的菌種資源和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本項目選取廣東臺山廣海灣作為研究海區(qū)。沉積物樣品于2018 年10 月采于臺山廣海灣惰性拆建物料處置區(qū)GH7 站點E112°50.000′，N21°54.000′。采用抓斗式采泥器采集表層0 cm～5 cm 處沉積物樣品，將樣品裝入聚乙烯袋中，用海水覆蓋，保存于-20 ℃中。樣品在超凈臺內(nèi)切除表層，取內(nèi)層沉積物進(jìn)行下一步實驗以避免污染。

培養(yǎng)基成分及分量［9］為：2216E液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，磷酸鐵微量，人工海水1 000 mL；LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 1 g，蒸餾水1 000 mL。2216E 和LB 固體培養(yǎng)基分別在上述的液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂。

1.2 菌株的分離純化、篩選

在帶有玻璃珠的100 mL 已滅菌的人工海水中加入10 g沉積物樣品，置于35 ℃，180 r/min 搖床中24 h，充分打散混勻。取1 mL 懸濁液分別以10-1～10-5濃度稀釋均勻涂布于2216E 培養(yǎng)基平板上，置于35 ℃培養(yǎng)數(shù)天。通過觀察菌落的形態(tài)和大小，將不同形態(tài)或大小的菌通過平板劃線的方法來進(jìn)行分離純化。制備含有25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 鉻Cr（VI）的固體2216E 培養(yǎng)基，利用平板劃線的方法依次把純化后的不同菌落接種到含鉻Cr（VI）固體2216E 培養(yǎng)基中，仔細(xì)觀察菌株的長勢和大小，把長勢良好、活性高的菌株挑取出來，淘汰活性低的菌種，從而篩選出Cr（VI）還原菌株Y1。

1.3 菌株鑒定

將所得Y1 菌株接種于LB 培養(yǎng)基內(nèi)，35 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)，稀釋菌液涂布平皿，培養(yǎng)24 h 后按照《微生物學(xué)實驗》［10］進(jìn)行革蘭氏染色；Y1 菌株總DNA 利用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取，選取16S rRNA 通用引物27F 和1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)展，PCR 產(chǎn)物利用回收試劑盒純化后，由廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。將測序得到的16S rRNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST 序列比對分析，利用軟件MEGA 7.0 構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株的生長特性研究

（1）生長曲線的測定。將篩選出來的耐鉻優(yōu)勢菌株按1∶100接種比例接種到液體2216E 培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)，每間隔2 h 取樣品測定OD600值，繪制生長曲線。

（2）pH 值對菌株生長的影響。將篩選出來的耐鉻優(yōu)勢菌株分別置于6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 不同pH 值下的液體2216E培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h 后取樣，測定OD600值。

（3）溫度對菌株生長的影響。將篩選出來的耐鉻優(yōu)勢菌株分別置于27 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃不同溫度下的液體2216E 培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h 后取樣，測定OD600值。

（4）鹽度對菌株生長的影響。將篩選出來的耐鉻優(yōu)勢菌株分別置于5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L 不同NaCl 濃度下的液體2216E 培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)，每隔12 h 取樣測定OD600值，培養(yǎng)周期為96 h，在不同NaCl 濃度下測定該菌株對50 mg/L的Cr（VI）還原趨勢。

1.5 菌株的Cr（VI）還原特性

將Y1 菌株接種到2216E 液體培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期后，將菌液以5%的接種量加入到不同Cr（VI）濃度（25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L 和400 mg/L）的2216E 液體培養(yǎng)基中。不定時用滅菌的針筒分別抽取上述菌液10 mL 于潔凈離心管中。把離心管置于離心機(jī)中高速離心分離，后測定上清液OD540處Cr（VI）的濃度。

2 實驗結(jié)果及分析

2.1 菌株的分離純化、篩選及鑒定

通過富集純化，在含有100mg/L 鉻Cr（VI）的固體培養(yǎng)基上獲得菌株Y1。在固體培養(yǎng)基上，該菌株的菌落為圓形，菌落表面不光滑有皺褶，邊緣整齊（見圖1）。從革蘭氏染色鏡檢情況來看，Y1 菌株的細(xì)胞形狀是桿狀，染色結(jié)果為紫色，是革蘭氏陽性菌。

圖1 優(yōu)勢菌株Y1 培養(yǎng)特征

將菌株Y1 測序后的16S rRNA 序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2），結(jié)果顯示該菌株與Bacillus aerius strain 24K、Bacillus stratosphericus stain 41KF2a等菌株的同源性達(dá)100.0%。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)該菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和16S rRNA 基因序列分析可確定菌種為Bacillus（芽孢桿菌屬）。

2.2 生長曲線測定結(jié)果

使用光電比濁法［11］測定菌株Y1 生長曲線（見圖3）。由圖3 可知，0 h～8 h 菌株Y1 處于生長調(diào)整期，8 h～22 h 為對數(shù)生長期，生長速度明顯加快，特別是8 h～10 h 之間，菌體生長最快，22 h 后菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期和衰亡期。

圖3 菌株Y1 的生長曲線

2.3 pH 值對菌株生長的影響

pH 值對菌株生長的影響大多是以控制培養(yǎng)基的初始pH值來進(jìn)行。發(fā)酵過程中，菌株的生長速度會受pH 值的變化而變化，菌株的代謝途徑及細(xì)胞結(jié)構(gòu)亦會受到影響，不合適的發(fā)酵液pH 值會導(dǎo)致菌株生長速度減慢［12］。過高的pH 值會影響蛋白酶電離率，損害蛋白酶的功能，從而影響菌株的活性［13］。起始pH 值對菌株Y1 生長的影響曲線見圖4。由圖4 可知，菌株Y1 的最適pH 值為7.5。

圖4 起始pH 值對菌株Y1 生長的影響

2.4 溫度對菌株生長的影響

溫度對菌株Y1 生長的影響曲線見圖5。由圖5 可知，在25 ℃～35 ℃時，隨著溫度的升高，OD600升高。當(dāng)溫度為35 ℃時的OD600最大。在35 ℃～40 ℃時，OD600隨著溫度的升高而下降，并在40 ℃時降為最低，因此菌株Y1 的最適生長溫度為35 ℃。

圖5 溫度對菌株Y1 生長的影響

由于微生物去除Cr（VI）的機(jī)理是酶促反應(yīng)，過低溫度下細(xì)胞膜流動性的減弱會阻礙運輸系統(tǒng)的正常運行，導(dǎo)致基質(zhì)不能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，從而抑制其正常生長；過高溫度則會使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性，從而使去除Cr（VI）的蛋白酶功能受到損傷，影響蛋白合成機(jī)制或改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)［14］。

2.5 NaCl 鹽濃度對菌株生長的影響

NaCl 濃度會影響菌株對環(huán)境滲透壓的耐受程度，從而影響菌株的生長［15］。在穩(wěn)定滲透壓溶液中菌株細(xì)胞內(nèi)含水量穩(wěn)定，菌株生長最好［16］。鹽濃度過低或過高，會使菌體因失水或水分過多脹破而導(dǎo)致菌量下降。不同NaCl 鹽濃度對菌株Y1生長的影響曲線見圖6。由圖6 可知，隨著NaCl 濃度的增加，菌株Y1 的生長相應(yīng)受到抑制，但也可耐受高鹽環(huán)境。楊宇等［17］利用篩選出來的芽孢桿菌G12 菌株在不同NaCl 濃度下對Cr（VI）的還原實驗中，菌株在20 g/L NaCl 濃度下和25 g/L NaCl 濃度下對Cr（VI）的還原率分別為60%和40%，雖然高鹽濃度抑制了菌株對Cr（VI）的還原能力，但菌株G12 也可耐受高鹽環(huán)境。

圖6 不同NaCl 鹽濃度對菌株Y1 生長的影響

2.6 不同初始Cr（VI）濃度下菌株的還原特性

在菌株生長過程中，其生長及其對Cr（VI）的去除效率會受到Cr（VI）濃度變化的影響。菌體對Cr（VI）的還原時間因為Cr（VI）濃度的升高而相對延長，Cr（VI）還原效率降低［17］。不同初始Cr（VI）濃度下菌株Y1 的還原特性曲線見圖7。由圖7 可知，在濃度為25 mg/L～200 mg/L 的Cr（VI）培養(yǎng)液中，菌株都可以快速生長，基本上沒受到抑制，特別是在25 mg/L Cr（VI）濃度下，生長趨勢最好。但當(dāng)Cr（VI）濃度達(dá)到400 mg/L 時，菌株的生長達(dá)到了延滯期，生長受到了抑制。菌株Y1 對Cr（VI）的還原效率隨著初始Cr（VI）濃度的升高而下降，在25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 的初始Cr（VI）濃度條件下，菌株的鉻還原率分別為88.0%、54.1%、31.2%、24.5%和17.5%。隨著初始Cr（VI）濃度升高，菌體Y1 的耐受性和生長受到抑制，鉻對菌體的致毒性加強(qiáng)，阻抑了菌株鉻還原酶的能力，使還原效率降低。

圖7 不同初始Cr（VI）濃度下菌株Y1 的還原特性

3 結(jié)論

（1）從臺山廣海灣惰性拆建物料處置區(qū)沉積物中分離得到一株Cr（VI）抗性菌，通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色和16S rRNA 基因測序分析，鑒定該菌株為芽孢桿菌（Bacillus），編號為Y1。

（2）菌株Y1 在2216 培養(yǎng)基中8 h～22 h 時處于對數(shù)生長期，生長速度最快；菌株最適生長pH 為7.5；最適生長溫度為35 ℃；能耐受高鹽環(huán)境。

（3）菌株Y1 對25 mg/L～400 mg/LCr（VI）的還原趨勢隨著初始Cr（VI）濃度的升高而下降，在25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 的初始Cr（VI）濃度條件下，菌株的鉻還原率分別為88.0%、54.1%、31.2%、24.5%和17.5%。下一步擬對芽孢桿菌吸附機(jī)理進(jìn)行研究，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)；并探討高濃度Cr（VI）對芽孢桿菌活性以及除鉻能力的影響機(jī)理。