張?jiān)?張雪萍 張?jiān)沦?李曉娟

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 北京林業(yè)大學(xué)林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

在生命活動(dòng)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)各種分子進(jìn)行著復(fù)雜和高度動(dòng)態(tài)的化學(xué)反應(yīng)和相互作用，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)與平衡。因此，在單分子水平上對(duì)生物分子的生理特性和動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，有助于深入研究分子之間和分子內(nèi)的精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制［1-2］。目前，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的單分子檢測(cè)技術(shù)主要分為兩大類：一是非基于力學(xué)的方法，包括熒光檢測(cè)和電子顯微成像；二是基于力學(xué)的方法，包括光學(xué)鑷子，原子力顯微鏡等［3-4］。單分子熒光檢測(cè)技術(shù)（single-molecule fluorescence detection）通過(guò)對(duì)被熒光標(biāo)記的單個(gè)分子的進(jìn)行成像追蹤和檢測(cè)，在納米級(jí)的空間尺度和納秒級(jí)的時(shí)間尺度上對(duì)分子的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)的生化與分子生物學(xué)或者遺傳學(xué)檢測(cè)方法相比，單分子熒光檢測(cè)不僅可以檢測(cè)到集群平均方法無(wú)法檢測(cè)的分子信息，還可以檢測(cè)瞬時(shí)活動(dòng)或者偶發(fā)性的事件。隨著科技的不斷發(fā)展，單分子檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，成為極具價(jià)值的生物學(xué)研究方法。

單分子熒光檢測(cè)技術(shù)可以在不改變樣本生理狀態(tài)的條件下對(duì)目的分子進(jìn)行觀察和分析，因此可以用于研究活細(xì)胞內(nèi)的生命過(guò)程。該類技術(shù)還具有以下優(yōu)勢(shì)：首先，具有對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)追蹤的能力，通過(guò)持續(xù)監(jiān)測(cè)單個(gè)分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，能夠獲得分子在活體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡和動(dòng)力學(xué)信息。其次，多種不同的成像/檢測(cè)技術(shù)可以相互結(jié)合，提升時(shí)間和空間分辨率［5］。本文著重對(duì)基于熒光檢測(cè)的單分子成像技術(shù)和光譜分析方法的原理以及近期的技術(shù)發(fā)展進(jìn)行了總結(jié)，介紹了單分子檢測(cè)技術(shù)在植物學(xué)中的應(yīng)用，并且展望了其促進(jìn)植物學(xué)研究的前景。

1 單分子成像技術(shù)

在單分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展中，基于熒光標(biāo)簽的光學(xué)成像技術(shù)為在單分子尺度上成像并追蹤特定靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。由于其可進(jìn)行高靈敏性和高特異性的活體分子成像，目前已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)的研究。

1.1 全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)

全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)（total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM）是近年來(lái)單分子研究的常用技術(shù)之一。當(dāng)入射光從一個(gè)高折射率介質(zhì)（蓋玻片）進(jìn)入低折射率介質(zhì)（溶液）時(shí)，在入射角大于臨界角的條件下，入射光將在玻片-溶液界面發(fā)生全內(nèi)反射。在全內(nèi)反射條件下產(chǎn)生的倏逝波可以激發(fā)界面附近250 nm薄層范圍內(nèi)的熒光分子［6］。相較于傳統(tǒng)熒光顯微鏡，TIRFM僅激發(fā)樣品中靠近界面的一薄層區(qū)域，使來(lái)自于失焦平面的背景熒光減小，圖像分辨率和信噪比（signal-noise ratio，SNR）均獲得了明顯的提升。同時(shí)，樣品上的總照明量減少，減小了對(duì)樣品的光損傷。因此，TIRFM多被用于研究活細(xì)胞表面和近膜區(qū)域的單分子行為［7］。

在20世紀(jì)80年代早期，TIRFM首次被應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究，Axelrod［8］應(yīng)用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)大鼠原代肌管細(xì)胞質(zhì)膜和近膜胞質(zhì)區(qū)域的成像。1995年，F(xiàn)unatsu等［9］使用TIRFM直接觀察了水溶液中被熒光標(biāo)記的單個(gè)肌球蛋白分子，并檢測(cè)到單個(gè)ATP的轉(zhuǎn)換反應(yīng)。隨著新興照明設(shè)備和超靈敏探測(cè)器的出現(xiàn)，TIRFM技術(shù)也得到了充分的發(fā)展，并被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜蛋白研究［10-11］。但是，由于植物細(xì)胞在細(xì)胞膜外側(cè)環(huán)繞著細(xì)胞壁，其對(duì)入射激發(fā)光全內(nèi)反射位置的影響，使得TIRFM在植物細(xì)胞中的研究受到了限制。可變角度全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)（variable angle-TIRFM，VA-TIRFM）的開(kāi)發(fā)，有效的解決了這一難題。VA-TIRFM通過(guò)調(diào)節(jié)激發(fā)光的入射角度，使其穿過(guò)細(xì)胞壁在細(xì)胞膜/胞質(zhì)界面發(fā)生全內(nèi)反射，從而激發(fā)完整植物細(xì)胞質(zhì)膜及近膜區(qū)域的熒光分子［12］。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，依賴于多角度掃描和自動(dòng)校準(zhǔn)的TIRFM技術(shù)被用于提升z軸分辨率。該方法通過(guò)大范圍小增量地調(diào)整入射角度并自動(dòng)校準(zhǔn)，能夠更精準(zhǔn)的確定入射角度，減少激發(fā)光的散射，使TIRFM可以對(duì)復(fù)雜表面的樣品進(jìn)行研究，同時(shí)獲得較高的z軸分辨率，有利于對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行定量分析［13］。另外，一種超臨界照明顯微光度定位（supercritical illumination microscopy photometric z-localization with enhanced resolution，SIMPLER）的方法也被用來(lái)對(duì)單個(gè)分子發(fā)射光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，解碼基于單分子定位顯微術(shù)（single-molecule localization microscopy，SMLM） 的 TIRFM成 像（TIRFM-SMLM）中分子的z軸位置。VA-TIRFM應(yīng)用多角度連續(xù)測(cè)量以確定分子z軸信息，而SIMPLER可以直接利用TIRFM-SMLM產(chǎn)生的2D數(shù)據(jù)編碼分子的z軸信息，同時(shí)兼容SMLM所需的快速單分子閃爍。這項(xiàng)技術(shù)在約250 nm的成像深度下，以10-20 nm的z軸定位精度獲得高時(shí)空分辨率下的單分子3D信息［14］。經(jīng)典TIRFM進(jìn)行活體實(shí)時(shí)成像時(shí)，其檢測(cè)視野受限于高數(shù)值孔徑的檢測(cè)物鏡。最近，基于波導(dǎo)的TIRFM成像系統(tǒng)被應(yīng)用于活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像，該系統(tǒng)可以提供更大的檢測(cè)視野和更均勻的照明，為快速移動(dòng)分子的大視野檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)［15-16］。

1.2 超分辨顯微成像

近年來(lái)，隨著生物化學(xué)和生物物理技術(shù)的不斷改進(jìn)，光學(xué)成像的分辨率打破了光學(xué)衍射的極限。光學(xué)衍射極限即發(fā)光分子經(jīng)過(guò)顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)后，其分子間的分辨率極限為：

該函數(shù)即為顯微鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（point spread function，PSF），其中，λ是光的波長(zhǎng)，n是折射率，θ是聚焦光錐的半角?？梢?jiàn)光波長(zhǎng)最短的為藍(lán)紫光，波長(zhǎng)約400 nm，因此普通光學(xué)顯微鏡分辨率極限為200 nm。超分辨率顯微技術(shù)（super-resolution microscopy，SRM），例如，光激活定位顯微技術(shù)（photoactivated localization microscopy，PALM）、結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（structure illumination microscopy，SIM）、受激發(fā)射光猝滅技術(shù)（stimulated emission depletion microscopy，STED）和隨機(jī)光重建顯微技術(shù)（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）等，突破了光學(xué)衍射極限，為活細(xì)胞中開(kāi)展高時(shí)空分辨率的研究提供了有力的支撐［17］。

這些顯微技術(shù)中，PALM和STORM通過(guò)對(duì)隨機(jī)“開(kāi)-關(guān)”的熒光分子進(jìn)行單分子定位，并將多個(gè)精確定位的圖像疊加，來(lái)大幅度提高圖像分辨率［18］。其使用光激活/轉(zhuǎn)換熒光染料，一次只能激活/轉(zhuǎn)換視野下的幾個(gè)熒光分子，隨后在高強(qiáng)度激光下將已激活分子全部淬滅，多次重復(fù)后即可獲得細(xì)胞內(nèi)全部熒光分子的精確位置，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光標(biāo)記分子稀疏化，在不改變熒光點(diǎn)PSF的情況下，識(shí)別光斑的中心定位，提升熒光分子的空間分辨率［19-20］。最近，在單分子定位的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的DNA點(diǎn)積累定位（DNA points accumulation for imaging in nanoscale topography，DNA-PAINT）技術(shù)，以熒光標(biāo)記核苷酸，通過(guò)DNA雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的超分辨可視化研究［21］。此外，基于干涉定位成像的ROSE（repetitive optical selective exposure）單分子干涉定位顯微鏡，推動(dòng)顯微鏡的分辨率提升到3 nm以內(nèi)的分子尺度，并解析了間隔5 nm的分子結(jié)構(gòu)［22］。但不論是PALM還是STORM，其成像過(guò)程均需要反復(fù)激活-淬滅熒光分子，極易產(chǎn)生光漂白和光毒性，對(duì)活細(xì)胞的生理狀態(tài)產(chǎn)生影響。

STED和SIM是通過(guò)設(shè)計(jì)照明模式，通過(guò)有效減小PSF的大小來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨率成像。STED利用一束與激發(fā)光共軸，且波長(zhǎng)與熒光分子發(fā)射波長(zhǎng)匹配的環(huán)形損耗光，使得處于激發(fā)光斑外圍的激發(fā)態(tài)分子以受激輻射的方式釋放能量回到基態(tài)，因此能夠大幅度減小激發(fā)光光斑大小，實(shí)現(xiàn)超分辨率成像［23］。SIM技術(shù)利用摩爾條紋把原本不能通過(guò)熒光采集系統(tǒng)的高頻信息平移到可觀察的頻率范圍內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨。與其他幾個(gè)超分辨技術(shù)相比，SIM所需的原始圖像較少且成像速度快，而且對(duì)激發(fā)光功率的要求也不高，所以對(duì)樣品的光漂白和光損傷程度較小，在活體成像方面具有較大的優(yōu)勢(shì)［24］。2018年，具有高時(shí)空分辨率的掠入射-結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)（grazing incidence structured illumination microscopy，GI-SIM）和海森結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)（Hessian structured illumination microscopy，Hi-SIM）的開(kāi)發(fā)，很大程度減弱了活細(xì)胞成像的光損傷，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物分子的快速、長(zhǎng)時(shí)程成像［25-26］。

盡管超分辨率顯微技術(shù)具有優(yōu)異的空間分辨率優(yōu)勢(shì)，但仍具有通量低、成像時(shí)間長(zhǎng)和成像窗口小等局限性。因此，多技術(shù)的聯(lián)用成為新的發(fā)展趨勢(shì)。在強(qiáng)化每一種技術(shù)優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，弱化各自的缺點(diǎn)，從而提供更多的生物系統(tǒng)結(jié)構(gòu)信息。SRM技術(shù)與其他光學(xué)顯微鏡的聯(lián)合使用是最易實(shí)現(xiàn)的應(yīng)用之一，例如SIM與TIRFM的結(jié)合，在高分辨的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升了近膜區(qū)域單分子檢測(cè)的分辨率，同時(shí)大幅度減輕了SIM檢測(cè)的光漂白［27］。此外，SRM的分辨率（＜200 nm的空間分辨率）與電子顯微鏡（electron microscope，EM）的分辨率水平更為匹配，因此SRM-EM聯(lián)用可以進(jìn)行更精細(xì)的聯(lián)合分析，獲得細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)［28-30］。

1.3 單顆粒示蹤技術(shù)

單顆粒示蹤技術(shù)（single particle tracking，SPT）與單分子熒光成像結(jié)合，極大地促進(jìn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子的物理性質(zhì)、膜動(dòng)力學(xué)、亞細(xì)胞分布和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)雀鞣N動(dòng)態(tài)過(guò)程的深入研究［31-32］。SPT的應(yīng)用始于20世紀(jì)80年代，Geerts等［33］使用金納米顆粒標(biāo)記生物分子，隨后利用顯微鏡成像并追蹤每一個(gè)被標(biāo)記分子的運(yùn)動(dòng)軌跡。通過(guò)追蹤附著于單個(gè)粒子上的成像標(biāo)簽，并且以連續(xù)時(shí)間序列的方式記錄其運(yùn)動(dòng)以生成軌跡，揭示了分子的運(yùn)動(dòng)特征［34］。由于群體分子在生命活動(dòng)中常表現(xiàn)出異質(zhì)性行為，因此，需要檢測(cè)軌跡足夠長(zhǎng)，才可以獲得單分子動(dòng)態(tài)行為規(guī)律［35］。當(dāng)運(yùn)動(dòng)軌跡較短時(shí)，基于單個(gè)軌跡對(duì)其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行分析將導(dǎo)致嚴(yán)重的誤差［36］，所以足夠的時(shí)間長(zhǎng)度及較高的時(shí)間分辨率是SPT精確分析的基礎(chǔ)。此外，要實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間追蹤，需要熒光成像具有較高信噪比。因此，用于SPT分析的熒光標(biāo)簽需要有明亮、穩(wěn)定的光譜性質(zhì)以及適當(dāng)?shù)臉?biāo)記密度，以便對(duì)單個(gè)蛋白在合適的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行有效的追蹤。同時(shí)，也要求熒光標(biāo)簽的尺寸和分子量較小，以減小或避免標(biāo)簽對(duì)生物分子功能和擴(kuò)散性質(zhì)的影響［34，37］。

近年來(lái)，標(biāo)記和成像技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了SPT的應(yīng)用。例如，超時(shí)間分辨顯微鏡（super temporalresolved microscopy，STReM）極大提高了SPT分析的時(shí)間分辨率。STReM采用旋轉(zhuǎn)雙螺旋相掩模（rotating double helix phase mask，DHPM）以可控角度旋轉(zhuǎn)，將得到的雙螺旋PSF方向進(jìn)行擬合，編碼為樣品的時(shí)間信息，獲得了高于傳統(tǒng)顯微鏡20倍的時(shí)間分辨率［38］。此外，PALM、STORM等SRM技術(shù)與SPT的結(jié)合，打破了分子標(biāo)記密度和衍射極限的局限性［39-40］。值得注意的是，使用傳統(tǒng)的成像技術(shù)（熒光顯微鏡，TIRFM等）分析分子運(yùn)動(dòng)時(shí)，獲得的xy-二維（2D）圖像假定成像區(qū)域是完全平坦的，從而只對(duì)物鏡焦平面上的分子的側(cè)向位移進(jìn)行2D-SPT分析，所以會(huì)對(duì)分子擴(kuò)散系數(shù)的分析產(chǎn)生影響造成誤差［41］。為解決這一問(wèn)題，基于多焦平面顯微鏡［42］和PSF工程［43］的高分辨率3D成像技術(shù)，擴(kuò)展了單分子檢測(cè)的z軸范圍，從而可以在xyz-3D空間尺度對(duì)分子的動(dòng)態(tài)特征進(jìn)行3D-SPT分析，促進(jìn)了對(duì)厚細(xì)胞和組織中生物分子的研究［44-45］（圖1）。

2 光譜學(xué)檢測(cè)方法

光譜學(xué)檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)光譜的變化，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的分子動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析的方法和技術(shù)。在過(guò)去的研究中，諸如熒光漂白后恢復(fù) 技 術(shù)（fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP）、熒光相關(guān)光譜技術(shù)（fluorescence correlation spectroscopy，F(xiàn)CS）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）等光譜學(xué)檢測(cè)技術(shù)極大促進(jìn)了細(xì)胞生物學(xué)的研究。近年來(lái)，與超高分辨率顯微技術(shù)的結(jié)合，進(jìn)一步提高了其空間分辨率。

2.1 熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)

熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)（fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。FRAP可以用于研究活細(xì)胞內(nèi)分子間的相互作用，揭示分子在活細(xì)胞內(nèi)的遷移方向、速度以及擴(kuò)散系數(shù)等動(dòng)力學(xué)特征，進(jìn)而揭示生物分子的功能與作用機(jī)制。該技術(shù)的工作原理是將激光聚焦于樣品中的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），測(cè)定ROI的初始熒光后，以高功率激發(fā)光進(jìn)行漂白，隨后監(jiān)測(cè)漂白區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間推移的變化情況，從而獲得分子的運(yùn)動(dòng)信息［35］。FRAP在細(xì)胞組分的互作［47］、細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)［48］、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)［49］、染色體結(jié)構(gòu)［50］等方面的研究中廣泛應(yīng)用。

FRAP技術(shù)不斷發(fā)展以適應(yīng)不同的研究策略，例如反向熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（inverse fluorescence recovery after photobleaching，iFRAP）［51］、 熒 光 漂白中損失技術(shù)（fluorescence loss in photobleaching，F(xiàn)LIP）［52-53］、光激活后的熒光損失技術(shù)（fluorescence loss after photoactivation，F(xiàn)LAC）［54］、線性熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（Line FRAP）［55］等基于FRAP的延伸應(yīng)用越來(lái)越廣泛。iFRAP利用了光激活熒光蛋白的光譜性質(zhì)［56］，首先激活ROI中的熒光分子，隨后對(duì)已激活的熒光分子的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行實(shí)時(shí)成像觀察。由于該方法只能檢測(cè)并追蹤ROI內(nèi)的已光活化分子，因此有效的規(guī)避了ROI周圍或細(xì)胞內(nèi)部熒光分子運(yùn)動(dòng)的影響，比傳統(tǒng)FRAP更能夠精確的測(cè)定生物分子動(dòng)力學(xué)［50］。FLIP通過(guò)對(duì)某一固定ROI進(jìn)行連續(xù)的光漂白，并監(jiān)測(cè)整個(gè)樣品的熒光波動(dòng)信號(hào)，揭示了分子在核與胞質(zhì)中的動(dòng)態(tài)穿梭過(guò)程。此外，若將樣品中單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)漂白，即可獲得樣品中細(xì)胞間的分子交換情況，同時(shí)也有利于獲得樣品中固定分子的分布信息［52］。Line FRAP可以大幅度縮小漂白區(qū)域，從而更快的對(duì)局部區(qū)域中分子擴(kuò)散系數(shù)和分子移動(dòng)進(jìn)行測(cè)量［55］。FRAP與SRM結(jié)合的smFRAP技術(shù)通過(guò)將光漂白區(qū)域面積縮小至衍射極限之內(nèi)，在單分子水平上以高分辨率實(shí)時(shí)檢測(cè)分子的動(dòng)態(tài)變化，獲得活體樣品中分子的擴(kuò)散系數(shù)及遷移速率等信息［57-58］。

2.2 熒光相關(guān)光譜技術(shù)

熒光相關(guān)光譜技術(shù)（fluorescence correlation spectroscopy，F(xiàn)CS）通過(guò)檢測(cè)樣品中激發(fā)焦點(diǎn)處的熒光波動(dòng)，分析熒光分子數(shù)量的變化以及分子擴(kuò)散情況。FCS首次提出是用于對(duì)溶液中熒光標(biāo)記物（溴化乙錠）與DNA分子的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)［59］。隨著激光共聚焦顯微鏡的誕生，F(xiàn)CS實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞內(nèi)分子動(dòng)力學(xué)的監(jiān)測(cè)［60］。FCS的熒光采集范圍較小，可達(dá)10-15L，可用于對(duì)微小區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)。然而，在FCS檢測(cè)過(guò)程中高激發(fā)光經(jīng)常導(dǎo)致光漂白，高濃度的熒光分子也可能導(dǎo)致檢測(cè)出現(xiàn)較大誤差?？晒饧せ顭晒獾鞍着cFCS的聯(lián)合，有效的克服了這些問(wèn)題［61-62］。

對(duì)活體樣本的研究過(guò)程中，F(xiàn)CS快速發(fā)展，出現(xiàn)了熒光互相關(guān)光譜技術(shù)（fluorescence cross-correlation spectroscopy，F(xiàn)CCS）［63］、掃描 單 分 子 FCS（scanning single-molecule fluorescence correlation spectroscopy，scanning smFCS）［64］、掃描受激發(fā)射損耗 -熒光相關(guān)光譜（scanning STED-FCS）、基于對(duì)相關(guān)函數(shù)的FCS［65］等延伸技術(shù)，擴(kuò)展了FCS的檢測(cè)能力。FCCS利用雙通道檢測(cè)不同顏色熒光團(tuán)標(biāo)記的兩種分子，通過(guò)對(duì)兩種熒光分子進(jìn)行相關(guān)性分析實(shí)現(xiàn)對(duì)分子相互作用的定量分析［66-67］。然而，F(xiàn)CCS在活體生物中的應(yīng)用也會(huì)受到自發(fā)熒光導(dǎo)致的非相關(guān)熒光串?dāng)_的影響。1980年，Thompson等［68］提出了全內(nèi)反射熒光相關(guān)光譜技術(shù)（TIRFM-FCS）。與基于Confocal的FCS相比，TIRFM-FCS對(duì)樣品表面約250 nm薄層區(qū)域內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)行為進(jìn)行定量分析，避免了遠(yuǎn)離焦平面的熒光團(tuán)的激發(fā)，規(guī)避了樣品內(nèi)部自發(fā)熒光的干擾，從而提高了檢測(cè)信噪比。隨后，物鏡型TIRFM-FCS被提出用于提升傳統(tǒng)TIRFM-FCS的信號(hào)采集效率［69］。最近，SRM技術(shù)的出現(xiàn)使FCS獲得了前所未有的空間分辨率，例如掃描受激發(fā)射損耗-熒光相關(guān)光譜（scanning STED-FCS）在較小的檢測(cè)體積內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)約60 nm的空間分辨率，并利用線或環(huán)掃描在幾微米的掃描軌跡上快速記錄FCS數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)亞毫秒級(jí)的時(shí)間分辨率［70-72］。

2.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）利用基于分子間相互作用的能量轉(zhuǎn)移。依賴于熒光供體發(fā)射光與熒光受體激發(fā)光的光譜重疊，當(dāng)處于激發(fā)狀態(tài)的供體靠近受體時(shí)，供體的能量可以轉(zhuǎn)移到受體，并導(dǎo)致受體被激發(fā)。FRET能量轉(zhuǎn)移效率與供體-受體二者之間的距離高度相關(guān)［73-74］，因此FRET可被用于測(cè)定相互作用分子間的距離。

單分子FRET（single-molecule FRET，smFRET）是FRET的一種技術(shù)延伸。smFRET通過(guò)檢測(cè)單個(gè)供體和受體FRET對(duì)之間熒光波動(dòng)，計(jì)算單個(gè)FRET對(duì)的能量轉(zhuǎn)移效率以及熒光強(qiáng)度波動(dòng)，以高靈敏性檢測(cè)低豐度生物分子，當(dāng)以熒光染料作為供體和受體時(shí)，smFRET可以以高敏感度檢測(cè)分子的相互作用強(qiáng)度［75］。通過(guò)能量轉(zhuǎn)移效率從供體和受體的熒光強(qiáng)度計(jì)算來(lái)推斷分子之間的距離，從而smFRET可以用于研究單個(gè)生物分子在體內(nèi)/體外的功能［73，76］、動(dòng)態(tài)變化［77-78］以及構(gòu)象改變［79］，使得亞納米尺度的分子相互作用研究成為可能。FRET信號(hào)檢測(cè)靈敏度的提高以及分子標(biāo)記密度的優(yōu)化對(duì)于smFRET的應(yīng)用至關(guān)重要，為了有效的檢測(cè)smFRET的信號(hào)，TIRFM被應(yīng)用于smFRET成像以使背景噪音最小化提高檢測(cè)效率［80］。同時(shí)，可光激活有機(jī)染料（如CAGE 552和ZMWs）作為供體引入檢測(cè)樣品，可以克服分子標(biāo)記密度的限制，使其更好的應(yīng)用于生理?xiàng)l件下的活體檢測(cè)［81-82］。此外，smFRET檢測(cè)中熒光分子的淬滅會(huì)導(dǎo)致時(shí)間分辨率下降。最近研究人員將FRET與DNA-PAINT［83］聯(lián)合應(yīng)用，開(kāi)發(fā)了FRET-PAINT技術(shù)，在DNA-PAINT技術(shù)抗光漂白特性的基礎(chǔ)上，大幅度地提高了分子的成像速度，實(shí)現(xiàn)了高時(shí)空分辨率的smFRET檢測(cè)［84］。

3 單分子檢測(cè)技術(shù)在植物學(xué)中的應(yīng)用

近幾十年來(lái)，單分子技術(shù)的應(yīng)用提高了監(jiān)測(cè)細(xì)胞中分子異質(zhì)性和偶發(fā)性行為的能力，改變了我們對(duì)復(fù)雜生命過(guò)程的理解。在早期的研究中，植物細(xì)胞因具有細(xì)胞壁或較強(qiáng)的自發(fā)熒光，導(dǎo)致SMD技術(shù)應(yīng)用于植物研究的難度較大。隨著成像與分析技術(shù)的不斷發(fā)展成熟［85-86］，SMD技術(shù)也逐漸在植物單分子研究中的到了應(yīng)用。Li等［87］應(yīng)用VA-TIRFM在單分子水平上追蹤擬南芥水通道蛋白（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs） 的 動(dòng) 態(tài)， 發(fā) 現(xiàn)PIP2；1在細(xì)胞膜上存在不同的寡聚化狀態(tài)，揭示了其在質(zhì)膜上的分布和側(cè)向擴(kuò)散具有高度異質(zhì)性，并通過(guò)亞細(xì)胞循環(huán)響應(yīng)鹽脅迫的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，采用VA-TIRFM對(duì)PIP2；1在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌鞭毛蛋白（bacterial flagellin-derived peptide flg22）處理?xiàng)l件下，PIP2；1的動(dòng)態(tài)行為不僅具有細(xì)胞類型特異性，還受到細(xì)胞骨架的調(diào)控，揭示了植物膜蛋白響應(yīng)病原體脅迫的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制［88］。另外，單分子追蹤PALM（sptPALM）進(jìn)一步在20-80 nm的空間分辨率條件下，追蹤和分析了PIP2；1在膜上的單分子動(dòng)態(tài)異質(zhì)性［89-90］。近期，VA-TIRFM與SIM結(jié)合檢測(cè)膜筏相關(guān)蛋白（flotillin 1，F(xiàn)lot1）的動(dòng)態(tài)特征與內(nèi)吞發(fā)現(xiàn)，在病原體脅迫下，F(xiàn)lot1在膜上的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與寡聚化狀態(tài)改變，這一過(guò)程介導(dǎo)了Flot1的內(nèi)吞，從而影響植物的防御響應(yīng)［91］。

除了用于研究植物膜蛋白對(duì)脅迫信號(hào)的響應(yīng)外，SMD技術(shù)還被用于植物激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的研究。在油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BR）刺激后，應(yīng)用FCS定量分析發(fā)現(xiàn)BR受體蛋白（brassinosteroidinsensitive 1，BRI1）的擴(kuò)散系數(shù)顯著升高，表明BRI1被BR激活，擴(kuò)散加快，從而實(shí)現(xiàn)BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［92］。2019年，Song等［93］利用多色 TIRFM 對(duì) BR信號(hào)通路下游元件BIN2（brassinosteroid-insensitive 2）與轉(zhuǎn)錄因子BES1（BRI1-EMS suppressor 1）的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和單分子分析。研究發(fā)現(xiàn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以激活BIN2，導(dǎo)致BIN2激酶組成性結(jié)合BES1，隨后在ATP存在的條件下活化的BIN2磷酸化BES1，抑制BR信號(hào)向下游的傳遞，在單分子水平上揭示了植物在響應(yīng)脅迫過(guò)程中利用ROS調(diào)控BR信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)程的動(dòng)態(tài)機(jī)制。Clark等［94］利用Scanning FCS定量分析干細(xì)胞調(diào)控因子SHR（short-root protein）從維管細(xì)胞向內(nèi)皮層細(xì)胞中的定向胞間移動(dòng)，以及其在內(nèi)皮層細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄因子SCR（scarecrow）相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，揭示SHR-SCR調(diào)控?cái)M南芥根系發(fā)育的分子機(jī)制。隨后，利用基于熒光壽命顯微成像的FRET技術(shù)（F?rster resonance energy transfer measured by fluorescence lifetime microscopy，F(xiàn)RET-FLIM），通過(guò)檢測(cè)供體熒光分子熒光壽命的衰減，分析細(xì)胞類型分化調(diào)控因子SHR、SCR和JKD（JACKDAW）間的相互作用情況。在單分子水平上，揭示了SHR、SCR和JKD可以形成不同的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)相鄰細(xì)胞間細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制［95-96］。

4 總結(jié)與展望

單分子檢測(cè)技術(shù)是一種強(qiáng)大的方法，可以揭示基于系統(tǒng)平均的檢測(cè)方法所不能體現(xiàn)的異質(zhì)性信息。本文綜述了常用的SMD技術(shù)（圖2）以及近期在植物學(xué)研究中的應(yīng)用。但與動(dòng)物細(xì)胞相比，其在植物細(xì)胞中的應(yīng)用存在一定的局限性。新技術(shù)不斷被開(kāi)發(fā)與利用可以更好地克服植物細(xì)胞壁和自發(fā)熒光的限制，同時(shí)提高信噪比并獲得良好的圖像質(zhì)量，如VA-TIRFM以及SRM等檢測(cè)方法已經(jīng)應(yīng)用于追蹤植物膜或近膜蛋白的動(dòng)態(tài)特性。此外，為打破活的植物細(xì)胞中追蹤單個(gè)分子的空間限制，具有高空間分辨率的光片層熒光顯微鏡（light sheet fluoresnence mircoscopy，LSFM）也被應(yīng)用于檢測(cè)植物細(xì)胞中的單分子［97］，與TIRFM相比LSFM具有更大的成像深度并允許照明平面在樣品中的任意位置。然而，近年來(lái)新發(fā)展的更多技術(shù)，例如基于光激活熒光團(tuán)的smFRET技術(shù)與TIRFM相結(jié)合，突破了TIRFM成像對(duì)熒光濃度的限制，實(shí)現(xiàn)了生理濃度下的單分子檢測(cè)［82］；以及最近利用貝葉斯照明的LSFM可以獲得更佳的信噪比，都為實(shí)時(shí)檢測(cè)活植物細(xì)胞中的單分子提供了全新見(jiàn)解［98］。伴隨SRM技術(shù)的革新，LSFM-SIM在植物中的應(yīng)用也具有廣闊的前景［99］。同時(shí)，GI-SIM和Hi-SIM的開(kāi)發(fā)與利用，實(shí)現(xiàn)了低激光強(qiáng)度對(duì)低信號(hào)熒光的快速、高分辨成像，在植物生物學(xué)研究中也具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。但這些技術(shù)在植物中的應(yīng)用以及根據(jù)植物的具體特性進(jìn)行優(yōu)化還需要深入研究。隨著SMD技術(shù)的不斷發(fā)展，相信未來(lái)能夠更好地推動(dòng)植物生物學(xué)經(jīng)典科學(xué)問(wèn)題得到新的闡釋。

圖2 不同單分子檢測(cè)技術(shù)的分類及優(yōu)勢(shì)Fig.2 Classification and advantages of different single-molecule detection techniques