殷國良 孫文浩 龐效云 孫飛

（1. 中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點實驗室，北京 100101；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

1 冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展歷史

光學(xué)顯微鏡的發(fā)明使得人們于17世紀(jì)第一次看見細胞，推動了細胞學(xué)說的建立。但由于光學(xué)顯微鏡的分辨能力有限，限制了對細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的觀察。1931年，Max Knoll和Ernst Ruska發(fā)明了世界上第一臺透射電子顯微鏡，為人們觀察細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)提供了可能。但在發(fā)明之初，利用電子顯微鏡觀察生物樣品存在明顯的局限性：一是使用電子顯微鏡觀察生物樣品需要嚴(yán)格的真空環(huán)境，而真空環(huán)境會導(dǎo)致生物樣品脫水而改變其自然狀態(tài)；二是利用電子對生物樣品成像時所帶來的輻照損傷在一定程度上會破壞樣品的自然狀態(tài)。為了克服這些問題，人們自19世紀(jì)60年代以來發(fā)展出了一套生物電鏡樣品制備技術(shù)，通過化學(xué)固定、脫水、樹脂包埋、超薄切片、重金屬染色等步驟制備出適合于電子顯微鏡觀察的生物樣品，或者通過重金屬負染色的方法制備出適合于電子顯微鏡觀察的病毒顆粒、生物大分子復(fù)合體等樣品，基于這些樣品制備技術(shù)，人們利用電子顯微鏡開始觀察細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了諸如線粒體、葉綠體、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器和亞細胞結(jié)構(gòu)，有效推動了細胞生物學(xué)的研究。然而傳統(tǒng)的樣品制備和電鏡成像方法依然無法使得人們研究接近天然狀態(tài)的生物樣品結(jié)構(gòu)，這就是冷凍電鏡技術(shù)需要解決的問題。

英國劍橋大學(xué)Richard Henderson在冷凍電鏡技術(shù)的早期發(fā)展過程中起到了至關(guān)重要的作用。1975年，他與同事獲得了細菌視紫紅質(zhì)的7?分辨率的三維結(jié)構(gòu)［1-2］，這是歷史上第一個膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并首次證明利用電子顯微鏡可以獲得生物大分子亞納米分辨率的結(jié)構(gòu)。為達到防止真空干涸及降低電子輻照損傷的目的，Henderson與其同事在樣品表面包被了葡萄糖，并建立了低劑量電子照明技術(shù)——冷凍電鏡技術(shù)的重要組成部分。1990年Henderson等［3］利用冷凍電子晶體學(xué)技術(shù)解析了近原子分辨率的細菌視紫紅質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，有力證明了電子顯微鏡在生物大分子高分辨率成像方面所具備的潛力。1981年，瑞士洛桑大學(xué)的Jacques Dubochet團隊發(fā)明了快速冷凍的方法，使得病毒顆粒、生物大分子等生物樣品可以通過冷凍固定保持其天然的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，并用于冷凍電鏡成像。他們的方法是將待觀察的樣品迅速冷凍于非晶態(tài)的冰中（也稱玻璃態(tài)冰），既可以防止生物樣品暴露在高真空狀態(tài)下嚴(yán)重脫水，同時在低溫情況下可以顯著降低電子輻照損傷。在樣品快速冷凍制備和冷凍電鏡低劑量成像技術(shù)出現(xiàn)之后，第三個需要克服的問題是生物大分子冷凍電鏡圖像的處理、解析和三維重構(gòu)。美國哥倫比亞大學(xué)喬基姆·弗蘭克（Joachim Frank）和他的同事則率先針對這個問題提出了行之有效的計算處理方法，他們對同一生物大分子樣品多個不同拷貝的冷凍電鏡圖像進行對齊和平均，以提高圖像的信噪比；在獲得了樣品不同角度的二維圖像后，再利用計算機軟件對其三維重構(gòu)從而得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。至此，冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)（cryo-SPA）［4］完成了樣品快速冷凍玻璃態(tài)化［5］、生物樣品電子輻射損傷［6-7］、蛋白質(zhì)機器單顆粒圖像分類分析［8］等關(guān)鍵技術(shù)理論的建立，從而發(fā)展成為一項研究蛋白質(zhì)機器三維結(jié)構(gòu)的重要手段。2017年，Richard Henderson、Jacques Dubochet和 Joachim Frank三 人由于“開發(fā)冷凍電鏡，用于溶液中生物分子結(jié)構(gòu)的高分辨率測定”的原創(chuàng)奠基性工作，共同獲得了該年度的諾貝爾化學(xué)獎。

近些年來，冷凍電鏡技術(shù)取得飛速發(fā)展。在樣品制備方面，載網(wǎng)支持膜技術(shù)的完善（包括了石墨烯支持膜［9］、氧化石墨烯支持膜［10］、多晶金膜［11］、非晶鎳鈦合金膜［12］和疏水蛋白膜［13］等），以及新型快速冷凍技術(shù)的研發(fā)（包括VitroJet技術(shù)［14］和Spotiton技術(shù)［15］），使得冷凍樣品的制備效率和質(zhì)量得到顯著提高，在一定程度上避免了由氣液界面所帶來的蛋白樣品變性和取向優(yōu)勢問題，提升了冷凍電鏡的成像質(zhì)量，減少了蛋白樣品的用量，可以獲得更高質(zhì)量和更高分辨率的生物樣品三維結(jié)構(gòu)。

在軟硬件設(shè)備方面，具有先進電子光學(xué)系統(tǒng)的高穩(wěn)定電子顯微鏡（FEI Titan Krios）、高性能直接電子探測相機（Gatan K2/K3，ThermoFisher Scientific Falcon III/IV，DE-20/64）、能量過濾器的開發(fā)與使用（ThermoFisher Scientific Selectris X）、數(shù)據(jù)采集自動化程度不斷地提高（SerialEM，Leginon，EMAutomation和 UCSFImage4）、電子束傾斜（beam tilt）和電子束平移（beam-image-shift）的校正使得數(shù)據(jù)收集的效率和質(zhì)量得到顯著提高。在數(shù)據(jù)處理方面，高度自動化軟件的開發(fā)，如RELION［16］、cryoSPARC［17］、Warp［18］等，逐漸替代了人工干預(yù)，使得冷凍電鏡三維重構(gòu)分辨率得到進一步提高［19］。

基于上述軟硬件設(shè)備和數(shù)據(jù)處理算法的突破，2013年程亦凡與合作者利用cryo-SPA技術(shù)首次獲得膜蛋白TRPV1的3.4?結(jié)構(gòu)［20］，標(biāo)志著冷凍電鏡技術(shù)正式打開近原子分辨率結(jié)構(gòu)的大門，到2020年，Yip等［21］依賴于硬件的進步（球差校正器、單色儀等）解析獲得了1.25?分辨率的脫鐵鐵蛋白結(jié)構(gòu)，Nakane等［22］使用冷場發(fā)射槍，能量過濾器和更靈敏的直接電子探測相機獲得了人膜蛋白β3GABAA受體的1.7?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和小鼠脫鐵鐵蛋白1.22?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)提供揭示了前所未有的結(jié)構(gòu)細節(jié)。在這期間，同時有大量復(fù)雜蛋白質(zhì)機器的高分辨率結(jié)構(gòu)通過cryo-SPA技術(shù)得到了解析，包括酵母剪接體2.9-3.8?的高分辨率結(jié)構(gòu)［23］、非洲豬瘟病毒顆粒精細三維結(jié)構(gòu)［24-25］、G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）［26-33］、線粒體呼吸鏈系統(tǒng)中的眾多膜蛋白復(fù)合體［34-36］。在新冠疫情防控中，冷凍電鏡技術(shù)扮演著十分重要的角色，如新冠病毒的刺突蛋白結(jié)構(gòu)［37-42］、RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）結(jié)構(gòu)［43］均通過單顆粒分析技術(shù)迅速解析，進一步證明冷凍電鏡cryo-SPA技術(shù)在生物樣品精細結(jié)構(gòu)解析方面的巨大潛力。

冷凍電鏡技術(shù)除了可以觀察溶液中的蛋白質(zhì)分子，也可以對細胞、組織等復(fù)雜的生物學(xué)樣品進行成像，對細胞內(nèi)的各種蛋白質(zhì)機器進行指認和分析，解析蛋白質(zhì)機器在接近自然狀態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)，這就是蛋白質(zhì)分子機器的冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）技術(shù)。該技術(shù)最早由德國馬普生化細胞所的Baumeister等［44］發(fā)展起來。近年來，由于各項技術(shù)的進步和突破，包括透射電鏡平行光照明技術(shù)、直接電子探測技術(shù)、相位板技術(shù)［45-46］、基于直接電子探測相機的新型圖像處理技術(shù)、輻射損傷補償技術(shù)、三維圖像分類處理技術(shù)以及聚焦離子束（focused ion beam，F(xiàn)IB）銑削技術(shù)［47-49］等，使蛋白質(zhì)機器的冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)解析技術(shù)取得了進一步發(fā)展，包括細菌細胞鞭毛馬達［50-53］的原位結(jié)構(gòu)分析、肌動蛋白［54-55］的原位結(jié)構(gòu)分析以及核孔復(fù)合物（nuclear pore complex）［56-58］的高分辨率原位結(jié)構(gòu)解析。這些蛋白質(zhì)機器在細胞原位的高分辨率結(jié)構(gòu)解析會極大推動人們對于蛋白質(zhì)機器在生理環(huán)境下結(jié)構(gòu)動態(tài)的認識。

冷凍電鏡技術(shù)的飛速發(fā)展也推動了生物三維電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，這方面的介紹可以參考《生物三維電子顯微成像技術(shù)展望》一書［59］。

冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展至今，其解析的結(jié)構(gòu)已達17 000多個，涉及動物學(xué)、分子植物學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)等多個研究領(lǐng)域（引自https://www.ebi.ac.uk/emdb/statistics）。本文將對近年來人們利用冷凍電鏡技術(shù)在植物光合作用及脅迫響應(yīng)等方面進行的應(yīng)用研究進行綜述，以此展望未來冷凍電鏡技術(shù)在分子植物學(xué)研究領(lǐng)域的重要應(yīng)用前景。

2 冷凍電鏡在光合作用分子機理研究方面的應(yīng)用

光合作用是科學(xué)界公認的、地球上最重要的生化反應(yīng)。植物體通過直接吸收光能，分解水釋放氧氣，將二氧化碳轉(zhuǎn)換為碳水化合物。光合作用的分子機制十分復(fù)雜，包含光反應(yīng)及暗反應(yīng)兩個階段，其中涉及光能的吸收、電子的傳遞和能量的轉(zhuǎn)化等一系列物理化學(xué)及生物化學(xué)反應(yīng)。目前，光合作用的機理依然有諸多問題需探索，諸如蛋白復(fù)合體之間如何組裝、相關(guān)蛋白如何捕獲并吸收光能等。X-射線晶體學(xué)在植物光合作用的研究中已發(fā)揮了重要的作用［60-61］，PDB數(shù)據(jù)庫中通過該方法解析結(jié)構(gòu)的數(shù)量也具有較高的占比（圖1），為我們了解光合作用的分子機理提供了堅實的理論基礎(chǔ)。但鑒于該方法受限于獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)結(jié)晶，極大地限制了光系統(tǒng)中復(fù)雜生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析，因此通過X-射線晶體學(xué)方法僅局限于分子量較小的光合作用相關(guān)蛋白研究，這限制了我們對光合作用分子機制的進一步探究。冷凍電鏡技術(shù)的興起與發(fā)展填補了這一缺陷，不需要結(jié)晶，能夠保持樣品的天然狀態(tài)，為深入了解植物體的光合作用分子機制提供了新的技術(shù)手段。

圖1 光合作用相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)解析采用的手段Fig. 1 Methods used for structural analysis of photosynthesis-related proteins

在整個光合作用的過程中，各蛋白復(fù)合物之間的電子傳遞是其核心部分。目前冷凍電鏡技術(shù)在植物光合作用領(lǐng)域的研究主要集中在對電子傳遞鏈中各重要組分的結(jié)構(gòu)解析，以闡明光合作用的原理與機制。在所有能夠進行光合作用的生物體內(nèi)，都具有光系統(tǒng) I（photosystem I，簡稱PSI）和光系統(tǒng) II（photosystem II，簡稱PSII）兩個主要組成部分。其中PSI因其能被波長為700 nm的光所激發(fā)，故也被稱為P700；同理，PSII可被波長為680 nm的光激發(fā)，也被稱為P680。PSI和PSII通過電子傳遞鏈連接在一起，并高度有序地排列在類囊體膜上，它們主要起到電子傳遞和質(zhì)子傳遞的功能。本小節(jié)將對利用冷凍電鏡技術(shù)研究光合作用相關(guān)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能進行綜述。

2.1 冷凍電鏡在光系統(tǒng)I結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用

PSI復(fù)合物分子量低于PSII復(fù)合物，它僅存在于基質(zhì)和基粒片層的非堆疊區(qū)域。PSI的核心復(fù)合體由反應(yīng)中心色素PSI、電子受體和捕光復(fù)合體（light harvesting complex I，LHCI）所組成。關(guān)于PSI復(fù)合體的研究，冷凍電鏡技術(shù)扮演著十分重要的角色（圖2）。2020年，Mazor團隊結(jié)合冷凍電鏡技術(shù)和光譜學(xué)方法在集胞藻PCC 6803中解析了嵌合的PSI復(fù)合物結(jié)構(gòu)［62］，該結(jié)構(gòu)具有高度保守的核心天線，由11個亞基和90多個葉綠素組成。它在紅色光譜區(qū)域顯示出增強的吸收值，這主要得益于捕獲紅光的結(jié)構(gòu)位點，同時也可對光收集效率進行調(diào)節(jié)。該研究確定了光系統(tǒng)I復(fù)合物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以此揭示了能量傳遞途經(jīng)的多樣性。

圖2 光系統(tǒng)I的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)Fig. 2 cryo-EM structure of photosystem I

在真核藻類和高等植物中，PSI被LHCI蛋白包圍，進而形成PSI-LHCI超復(fù)合體，其主要功能是將電子從質(zhì)體藍素傳遞至鐵氧還蛋白，并將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。沈建仁及隋森芳兩個研究團隊于2018年合作解析了紅藻PSI-LHCI超復(fù)合體近原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［63］，分辨率達3.63-3.82?。該項研究得到的結(jié)構(gòu)存在兩種不同的形式，一種與高等植物相似，PSI同3個Lhcr亞基相連；另一種PSI與兩個Lhcr亞基相連。此外，紅藻類的PSI核心還顯示出類似于藍藻和高等植物PSI的特征，表明從原核生物向真核生物的進化過程中存在某種中間類型。該研究成果揭示了紅藻區(qū)別于高等植物PSI-LHCI的獨特電子傳遞途徑，為研究其對多變環(huán)境的適應(yīng)能力以及在低等植物向高等植物進化過程中PSI-LHCI的結(jié)構(gòu)變化提供了新思路。2019年，Minagawa團隊通過冷凍電鏡技術(shù)解得萊茵衣藻的PSI-LHCI復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［64］，該復(fù)合體包含9個LHCI。該研究同時證明相比于陸地植物，萊茵衣藻的 PSI 具有更大、更明顯的外周天線組織和更高的光捕獲能力。同年，李梅團隊聯(lián)合章新政團隊利用冷凍電鏡技術(shù)將萊茵衣藻的PSI-LHCI復(fù)合體結(jié)構(gòu)的分辨率提高至近原子分辨率［65］，相比于Minagawa團隊取得的結(jié)果，該結(jié)構(gòu)同時揭示了兩種不同排列方式的LHCI，一種包含8個與PSI核心相關(guān)的LHCI，另一種則包含10個與PSI核心相關(guān)的LHCI，為超復(fù)合物中天線組織和色素排列提供了更加詳細的信息。觸角中高度密集且緊密排列的葉綠素闡明了CrPSI-LHCI中光收集和激發(fā)能轉(zhuǎn)移的高效率，并為理解CrPSI-LHCI中光收集和能量轉(zhuǎn)移的高效率提供了新見解。2020年，Nelson團隊綜合使用X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡技術(shù)從耐鹽綠藻杜氏鹽藻中確定了PSI-LHCI的結(jié)構(gòu)［66］。該結(jié)構(gòu)揭示了一種新的PSI內(nèi)核配置，它僅由7個亞基組成，形成已知最小的PSI，而植物和萊茵衣藻中則為14-16個亞基。該研究為揭示PSI的組織及物種進化保守性提供了重要信息。

除PSI-LHCI復(fù)合體外，Akita團隊解析了硅藻光系統(tǒng) I-葉綠素a/c蛋白 I（fucoxanthin chlorophyll a/c protein I，F(xiàn)CPI）超復(fù)合物的 2.4? 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［67］。該結(jié)構(gòu)為硅藻PSI-FCPI的采光策略以及放氧光合生物光收集的進化動力學(xué)提供了新的見解。超級復(fù)合體由16個不同的FCPI亞基圍繞單體PSI核心組成，每個FCPI亞基具有不同的色素含量和結(jié)合位點，因而呈現(xiàn)不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，它們與PSI核心一起形成復(fù)雜的色素-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，以有效地收集和轉(zhuǎn)移光能。此外，研究者還在PSI核心中發(fā)現(xiàn)了兩個獨特的亞基。該結(jié)構(gòu)不僅為硅藻PSI-FCPI中的光捕獲策略提供了新見解，同時也為放氧光合生物中光收集器的進化動力學(xué)提供了新的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

在PSI-LHCI復(fù)合體的結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)上，人們利用冷凍電鏡技術(shù)對更為復(fù)雜的超級復(fù)合體結(jié)構(gòu)進行研究。2018年，李梅團隊聯(lián)合章新政團隊報道了玉米來源的光系統(tǒng) I-捕光復(fù)合體 I-捕光復(fù)合體 II超級復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［68］，揭示了LHCII和PSI之間的識別位點。該結(jié)構(gòu)的LHCII和PSI核心內(nèi)的葉綠素網(wǎng)絡(luò)與此前的光譜結(jié)果一致，印證了LHCII三聚體作為高效光收集器的作用。同時每個亞基通過一對葉綠素分子將能量傳遞到PSI核心，進而揭示了PSI核心與捕光天線之間能量轉(zhuǎn)移的路徑。該研究彌補了過去通過X-射線晶體學(xué)方法獲得的PSI結(jié)構(gòu)信息的缺失，為進一步探索植物電子傳遞和能量轉(zhuǎn)換的分子機制提供了重要的理論依據(jù)，在揭示高等植物對自然界多變光照環(huán)境適應(yīng)性機理的同時，也為PSI和PSII的捕光機制及能量調(diào)節(jié)提供了新的理論依據(jù)。

2021年，中科院植物所和浙江大學(xué)合作利用冷凍電鏡技術(shù)解析了大麥葉綠體PSI-NDH超分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)［69］，這是首次解析獲得的高等植物PSI-NDH復(fù)合體高分辨結(jié)構(gòu)。該復(fù)合體由2個PSI-LHCI、1個NDH及一個未知蛋白（unidentified stromal protein，USP）組成，共包含55個蛋白亞基、298個葉綠素分子、67個類胡蘿卜素分子和25個脂分子，總分子量達1.6 MD，是目前解析得到的最大的光合作用相關(guān)蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)。該研究揭示了NDH亞基特有的10個高等植物葉綠體的精確位置及結(jié)構(gòu)特點，首次闡明高等植物PSI-LHCI-NDH相互作用及組裝的機理，在填補高等植物NDH結(jié)構(gòu)信息的同時，也為高等植物PSI-NDH介導(dǎo)光合環(huán)式電子傳遞的功能及調(diào)控提供了新的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

此外，冷凍電鏡技術(shù)也被用于更加復(fù)雜的PSI：質(zhì)體藍蛋白（plastocyanin，PC）-鐵氧還蛋白（ferredoxin，F(xiàn)d）的復(fù)合結(jié)構(gòu)解析［70］。該復(fù)合體中含19個亞基與Fd結(jié)合，其中包含3個β-胡蘿卜素和15個脂質(zhì)分子，各組分在高光脅迫下的環(huán)式電子流中發(fā)揮不同的作用。結(jié)合功能實驗，進一步揭示了OPS亞基在藍藻暴露于強光脅迫期間的調(diào)節(jié)作用。這一結(jié)構(gòu)闡明了從Fd到NDH的電子轉(zhuǎn)移鏈結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時揭示了復(fù)合體內(nèi)所有的接觸部位及相互作用的電子載體和PSI之間的相互作用方式。

2.2 冷凍電鏡在光系統(tǒng)II結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用

PSII反應(yīng)中心、捕光復(fù)合體 II（light harvesting complex II，LHCII）和放氧復(fù)合體（oxygen-evolving complex，OEC）等亞單位共同組成了PSII超復(fù)合體。其主要功能是利用光能將水氧化并還原質(zhì)體醌。目前，冷凍電鏡技術(shù)在PSII復(fù)合體的研究也已得到廣泛的應(yīng)用（圖3）。2016年，柳振峰、章新政、常文瑞/李梅團隊合作利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)成功解析了菠菜PSII-LHCII超級復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)［71］。該復(fù)合體總分子量約1 100 kD，分辨率為3.4?。PSIILHCII超復(fù)合體是一個同源二聚體的超分子體系，其中每個單體都含有25個蛋白亞基、105個葉綠素分子、28個類胡蘿卜素分子和眾多的其它輔因子。該項工作解析了蛋白亞基CP29的全長結(jié)構(gòu)及CP26的結(jié)構(gòu)，揭示了不同外周捕光復(fù)合物與核心復(fù)合物間的裝配方式，彼此之間的相互作用位點，和各亞基間的排布規(guī)律，對于深入了解PSII-LHCII超級復(fù)合物中的能量傳遞具有重大意義。2017年，該團隊又解析豌豆C2S2M2型PSII-LHCII超級復(fù)合體2.7-3.2?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［72］，總分子量達到1 400 kD。與菠菜的PSII-LHCII超級復(fù)合體結(jié)構(gòu)相類似，該超級復(fù)合體也是同源二聚體。不同于菠菜PSII-LHCII復(fù)合物，該復(fù)合體的每個單體中所包含的蛋白亞基、葉綠素分子及類胡蘿卜素分子均多于菠菜的PSIILHCII復(fù)合物。該項研究還解析了蛋白亞基CP24與M-LHCII的結(jié)構(gòu)，通過比較兩種不同狀態(tài)的C2S2M2結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CP24與M-LHCII結(jié)合的位點不是保守的，說明高等植物PSII復(fù)合物能夠及時感受環(huán)境變化并做出響應(yīng)。該項研究對進一步理解高等植物PSII復(fù)合物中的電子傳遞及能量轉(zhuǎn)化，揭示高等植物在土壤、水體等弱光條件下實現(xiàn)高效捕光分子機理具有重要意義。此外，Boekema團隊及其合作者使用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)以5.3 ?的總分辨率解析得到了擬南芥C2S2M2超復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)［73］，除PsbJ和PsbY以及LHCII三聚體和次要天線復(fù)合物以外，該結(jié)構(gòu)包含了在不同PSII復(fù)合物中均保守的膜結(jié)合核心亞基，解析了所有葉綠素在亞基中的位置，揭示了這些葉綠素在介導(dǎo)能量從外圍觸角到核心流動中的作用。

圖3 光系統(tǒng)II的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)Fig.3 Cryo-EM structure of photosystem II

除高等植物外，冷凍電鏡技術(shù)又迅速被應(yīng)用于低等植物的PSII復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析。沈建仁、匡廷云研究組聯(lián)合隋森芳團隊解析了中心綱硅藻PSIIFCPII超級復(fù)合體3.0 ?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［74］。該結(jié)構(gòu)顯示PSII-FCPII超級復(fù)合體為二聚體，每個單體包含24個PSII亞基和11個FCPII亞基，同時還有200多個色素分子以及大量的脂質(zhì)分子，共70個蛋白亞基，分子量高達1.4 MD。該PSII與藍藻和高等植物的PSII結(jié)構(gòu)相似，但區(qū)別于二者，硅藻的PSII在放氧中心存在5個外周蛋白以及兩個與PSII和FCPII相連接的跨膜蛋白。此外，硅藻PSIIFCPII復(fù)合體的組裝形式也顯著不同，F(xiàn)CPII主要由兩個四聚體組成，分別與PSII核心存在兩種結(jié)合形式，緊密結(jié)合與松散結(jié)合。而硅藻FCP四聚體兩種結(jié)合方式的位置與高等植物L(fēng)HCII三聚體的緊密結(jié)合及松散結(jié)合的位置剛好相反。該復(fù)合體構(gòu)建了硅藻PSII-FCPII復(fù)雜的蛋白和色素網(wǎng)絡(luò)，揭示了復(fù)合體中各個亞基的相互作用方式及硅藻PSII中獨特的捕光天線組裝排布，為研究硅藻PSII對光能高效吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的分子機理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同年，柳振峰團隊與合作者也解析了衣藻來源的C2S2和C2S2M2L2型復(fù)合物的近原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［75］，發(fā)現(xiàn)了衣藻C2S2型復(fù)合物中的強結(jié)合型LHCII三聚體結(jié)構(gòu)的亞基組成。C2S2M2L2復(fù)合物與C2S2復(fù)合物的裝配方式十分相似，但前者更為復(fù)雜。相對于C2S2復(fù)合物，C2S2M2L2復(fù)合物的兩側(cè)分別結(jié)合了一對M-LHCII三聚體和一對LHCII三聚體。C2S2M2L2復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)還揭示了L-LHCII與CP29、L-LHCII與M-LHCII彼此之間的相互作用方式與裝配機制。該些研究結(jié)果對理解藻類植物在水體及土壤等弱光環(huán)境下高效捕獲光能的分子機理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.3 冷凍電鏡在光合電子傳遞鏈結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用

除兩類光系統(tǒng)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能研究外，冷凍電鏡技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于其他光合作用組分的結(jié)構(gòu)及功能研究之中，并取得了突破性的結(jié)果。在整個電子傳遞的過程中，細胞色素b6f（cytochrome b6f，Cyt b6f）復(fù)合體也扮演著十分重要的角色。它是一個帶有幾個輔基的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合體，主要生理功能是將光系統(tǒng) I與光系統(tǒng) II聯(lián)系起來，將還原態(tài)質(zhì)子醌中的電子傳遞給質(zhì)體藍素（plastocyanin，PC），同時將H+釋放到類囊體的腔。2019年，Johnson團隊利用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析得到高等植物菠菜細胞色素b6f復(fù)合體3.6?高分辨率結(jié)構(gòu)（圖4）［76］，該復(fù)合物包含多達3個天然結(jié)合的質(zhì)體醌（plastoquinone，PQ）分子。第一個PQ1位于PQ氧化位點（Qp）附近的一個cytb6f單體中，與血紅素bp和葉綠素a相鄰。PQ2跨越單體間的空腔，部分阻礙PQ1側(cè)的PQ還原位點（Qn），并使電子轉(zhuǎn)移網(wǎng)絡(luò)在相鄰單體中占據(jù)的Qn位點發(fā)生轉(zhuǎn)換。第3個PQ分子的位置與Q循環(huán)期間相反單體中Qp和Qn位點之間的轉(zhuǎn)變一致。因此，該結(jié)構(gòu)成功揭示了Q循環(huán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其氧化還原功能的分子機理，指出菠菜細胞色素b6f復(fù)合體與質(zhì)體醌的結(jié)合位點，為了解該復(fù)合物如何在光合作用中發(fā)揮催化和調(diào)節(jié)作用提供了新的見解。并為葉綠素吸收并轉(zhuǎn)化光能的機制及Q循環(huán)期間各位點之間進行PQ交換時所涉及的構(gòu)象變化等問題提供了精確的解答。

圖4 菠菜細胞色素b6f復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)Fig. 4 cryo-EM structure of spinach cytochrome b6f complex

環(huán)式電子流是由PSI參與的一種重要光保護機制，光合作用生物可通過該機制調(diào)節(jié)有效光合作用所需的ATP和NADPH水平。脫氫酶復(fù)合物：NDH在大多數(shù)放氧光合生物中均是關(guān)鍵組成部分，將源自PSI的NADPH氧化為NADP+，同時還原質(zhì)體醌，泵送質(zhì)子穿過質(zhì)體膜，建立質(zhì)體膜兩側(cè)的質(zhì)子濃度梯度，該質(zhì)子濃度梯度被ATP合成酶用來合成ATP。2019年，Davies團隊成功解析了嗜熱藍藻的NDH復(fù)合物3.1?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［77］，揭示了主要OPS亞基在NDH復(fù)合物中的結(jié)構(gòu)與排列信息，并觀察到外周臂中靠近質(zhì)體醌結(jié)合位點的外輔因子，同時也從結(jié)構(gòu)上推測了NDH可能具有的幾種電子傳遞途徑，解釋了NDH如何最大限度避免半質(zhì)體醌自由基的產(chǎn)生?？茖W(xué)界普遍認為藍藻并非植物，但其卻可以進行光合作用并產(chǎn)生氧氣，該結(jié)構(gòu)的成功解析為整個光合作用的電子傳遞途徑和機理提供了新的見解，同時也為光合作用系統(tǒng)各關(guān)鍵組分彼此之間的相互作用提供了新的認知。

光合作用是地球上所有生物賴以生存的基礎(chǔ)。在各種能夠進行光合作用的植物中，藻類植物可為全球的光合作用貢獻近半數(shù)的力量。藻膽體由藻膽蛋白和接頭蛋白組成，是藻類植物中的主要捕光復(fù)合物，有著接近100%的光能捕獲效率。藻膽體作為部分低等植物重要的捕光天線系統(tǒng)，能將捕獲的光能傳遞至光合機器核心，其組裝方式以及高效的能量傳遞機制一直是光合作用研究領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。2017年底，隋森芳團隊報道了太平洋凋毛藻（G.pacifica）藻膽體的3.5 ?分辨率的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)［78］，這是第一個完整藻膽體的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)。該復(fù)合體包含862個蛋白亞基，分子量約16.8 MD。該項工作也是首次獲得該復(fù)合體在功能組裝狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，同時首次確定了藻膽體中全部2 048個色素的整體排布，揭示了接頭蛋白如何影響生色團的微環(huán)境，并闡明了藻膽蛋白與連接蛋白組裝的分子機制，為高效的能量傳遞途經(jīng)提供了堅實的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2020年，該團隊又成功解析了鹽澤紅藻紫球藻（P. purpureum）藻膽體的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)［79］，并將分辨率提高到了2.8 ?。將兩次結(jié)構(gòu)進行對比發(fā)現(xiàn)，鹽澤紅藻藻膽體僅含有706個蛋白亞基，包含1 598個色素分子，比海洋紅藻藻膽體的整體尺寸小。對結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)色素分子與周圍連接蛋白上的芳香族氨基酸相互作用，從而改變色素分子的能量狀態(tài)，以保證高效的能量傳遞。2021年，隋森芳團隊聯(lián)合李雪明團隊，應(yīng)用冷凍聚焦離子束減薄技術(shù)（cryo-FIB milling）和冷凍電子斷層技術(shù)（cryo-ET）解析紅藻細胞內(nèi)藻膽體-光系統(tǒng)復(fù)合物 II原位結(jié)構(gòu)，獲得了離體研究無法獲得的新的結(jié)構(gòu)信息（圖5）［80］。原位結(jié)構(gòu)給予了更加豐富的生物學(xué)信息，該研究發(fā)現(xiàn)紅藻細胞內(nèi)的藻膽體在類囊體膜上以齒狀交互的方式規(guī)則排布。同時，相比于高分辨率單顆粒結(jié)構(gòu)及PSII晶體結(jié)構(gòu)，細胞原位藻膽體-PSII超復(fù)合物還存在3個未知的蛋白密度介導(dǎo)藻膽體的不同亞基與PSII相互連接。細胞水平的藻膽體與PSII存在多個相互作用界面以保證高效的能量傳遞過程。紅藻細胞內(nèi)部分區(qū)域的相鄰類囊體膜之間相連接形成“樓梯狀”的接孔，從而實現(xiàn)膜間信息交換與能量傳遞，為類囊體膜系統(tǒng)形成高度連接的膜網(wǎng)絡(luò)奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖5 藻膽體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［80］Fig. 5 cryo-EM structure of phycobilisome［80］

總之，冷凍電鏡技術(shù)逐漸成為了研究光合作用相關(guān)生物大分子的重要手段，它成功解析了光系統(tǒng)II、細胞色素b6f及ATP合酶等光合作用中重要結(jié)構(gòu)，使得我們對于光合作用機制的深入了解成為可能。同時也為深入了解光能捕獲機制、高效的電子傳遞能力以及能量轉(zhuǎn)化的機理提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（圖6）。

圖6 冷凍電鏡技術(shù)在植物光合作用研究領(lǐng)域的應(yīng)用Fig. 6 Application of cryo-EM in the field of plant photosynthesis research

3 冷凍電鏡在植物感知與應(yīng)答環(huán)境脅迫分子機制研究方面的應(yīng)用

植物的生長暴露于持續(xù)變化的自然環(huán)境，經(jīng)常需要抵御各種不利于植物生長和發(fā)育的生存脅迫。這些生存脅迫包括生物脅迫（如病原體感染和食草動物的啃食損傷）和非生物脅迫（主要包括干旱、高溫、鹽害、營養(yǎng)匱乏等）。不同的環(huán)境脅迫會導(dǎo)致植物在基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理性狀方面的特異性反應(yīng)［81］。近年來，隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)、遺傳學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等技術(shù)方法的應(yīng)用，人們對植物感知脅迫信號并進行抵御的分子機制理解不斷加深，其中冷凍電鏡技術(shù)為研究植物感知與應(yīng)答環(huán)境脅迫相關(guān)生物大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)功能研究方面發(fā)揮了重要作用。

3.1 冷凍電鏡在植物感知與應(yīng)答生物脅迫分子機制研究中的應(yīng)用

自然環(huán)境中，為了抵御細菌、真菌、病毒等病原體脅迫因子，植物進化出一套以細胞為單位的雙重免疫防線：（1）通過細胞膜上錨定的模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）識別病原微生物分泌的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來激活植物免疫反應(yīng)，稱為病原體相關(guān)模式分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMPstriggered immunity，PTI）， 包 括 活 性 氧 ROS 的 劇增、Ca2+大量內(nèi)流、防御基因表達上調(diào)和氣孔關(guān)閉等［82-83］；另外，植物損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也隸屬第一道免疫防線；（2）通過細胞內(nèi)核苷酸結(jié)合和富亮氨酸重復(fù)受體（nucleotide-binding and leucine-rich repeat receptors，NLR）直接或間接地感受病原菌分泌的特異性效應(yīng)因子（virulence protein effector），所激發(fā)的植物免疫反應(yīng)，被稱為病原體效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI）［84-85］。PTI是植物基礎(chǔ)抗性的重要組成部分，該抗性具有廣譜性，但抗性較弱。ETI通常具有物種特異性，形式上更進化，能夠更有效抵抗病原菌［86-88］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，植物的ETI免疫防線依賴于PTI防線，同時激活的ETI免疫反應(yīng)還可以增強PTI免疫防線［89-92］。因此，植物利用相互依賴的兩道免疫防線協(xié)同激活植物的防衛(wèi)反應(yīng)，以抵抗病原菌的入侵。

細胞膜上錨定的模式識別受體PRR家族可分為受體樣激酶（receptor like kinase，RLK）和受體樣蛋白（receptor like protein，RLP）。RLK-PRRs包含負責(zé)識別配體的胞外區(qū)（extracellular domain，ECD）、負責(zé)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)和膜錨定的跨膜區(qū)（transmembrane domain，TM）和負責(zé)下游信號傳導(dǎo)的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，而RLP-PRRs可能不包含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域［93］。

到目前為止，研究較為充分的幾類PRRs基本都有原子分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，包括FLS2、PEPR1、AtCERK1、CEBiP等［93］。FLS2和 PEPR1屬 于 典型的LRR-RLKs受體，兩者分別識別細菌鞭毛蛋白flg22和植物誘導(dǎo)肽Pep1，分別啟動LRR-RLK/PAMP和LRR-RLK/DAMP模式，通過下游信號通路觸發(fā)PTI免疫反應(yīng)［93-94］；來自于擬南芥的AtCERK1和來自于水稻的OsCEBiP均屬于典型的LysM-PRRs，識別真菌幾丁質(zhì)和細菌肽聚糖后被激活，通過下游信號分子與MAPK級聯(lián)連接，進而調(diào)節(jié)多種免疫反應(yīng)［95-96］。

為了達到侵襲感染植物細胞的目的，病原體進化出可以干擾或抑制PTI信號傳導(dǎo)的效應(yīng)因子，從而繞過第一道防線，侵襲植物細胞。相應(yīng)的，植物為了抵御這種侵襲，進一步進化出細胞內(nèi)免疫受體NLR，通過識別病原體效應(yīng)分子或其活動，誘導(dǎo)病原體效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)ETI。植物細胞內(nèi)免疫受體NLRs通常包含N端特定結(jié)構(gòu)域、中部保守的核苷酸結(jié)合位點（nucleotide-binding site，NBS）結(jié)構(gòu)域和C端高度可變的富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域。特定N端結(jié)構(gòu)域為 TIR（toll/interleukin-1 receptor）、CC（coiled-coil）或 RPW8（resistance to powdery mildew 8）結(jié)構(gòu)域，相應(yīng)的NLR受體形成相應(yīng)的亞家族TNLs，CNLs和RNLs［83］。

NLR作為ETI免疫防線的主要組成，可通過“直接識別”、“間接識別”或者“NLR IDs”［97］多種方式識別病原體分泌的效應(yīng)因子，觸發(fā)細胞超敏反應(yīng)，導(dǎo)致細胞程序性死亡，從而將病原體感染限制在侵染部位。在動物中，NLR在結(jié)合其效應(yīng)子后寡聚化是下游活動的關(guān)鍵，但植物系統(tǒng)在許多方面有所不同，其激活機制不太清楚［98］。在過去的20年中，人們努力了解植物NLRs的作用機制，而冷凍電鏡在其中發(fā)揮了重要作用。

2019年，柴繼杰、周儉民和王宏偉研究團隊通過使用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)并使用Volta相位板合作解析了首個植物NLR蛋白ZAR1的全長結(jié)構(gòu)［99］。結(jié)構(gòu)信息表明：分子內(nèi)相互作用和ADP結(jié)合導(dǎo)致了ZAR1蛋白的自抑制狀態(tài)；來自病原體的效應(yīng)蛋白AvrAC尿苷化免疫信號通路關(guān)鍵分子BIK1阻斷PTI免疫信號通路的同時，也導(dǎo)致植物分泌的誘餌分子PBL2的尿苷化，即PBL2UMP，進而會被預(yù)先形成的復(fù)合體ZAR1-RKS1識別并結(jié)合，導(dǎo)致ZAR1NBD構(gòu)象發(fā)生變化，ADP脫落，ZAR1活化進入中間狀態(tài)，形成ZAR1-RKS1-PBL2UMP單體復(fù)合物（圖7）。該研究為ZAR1蛋白自抑制狀態(tài)的維持機制、ZAR1與RKS1的相互作用、ZAR1通過ZAR1-RKS1間接識別PBL2UMP的機制，以及PBL2UMP誘導(dǎo)ZAR1活化的機制提供了詳盡的理論基礎(chǔ)。同時，該研究團隊進一步使用冷凍電鏡方法揭示了處于中間狀態(tài)的單體ZAR1-RKS1-PBL2UMP復(fù)合物寡聚化形成抗病小體機制和激活機制［100］（圖7），并結(jié)合生化實驗和單分子成像進一步揭示了其生物學(xué)功能［101］。這一系列研究揭示了植物NLR寡聚化形成抗病小體發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子機制，同時也比較了NLR抗病小體與NLRC4炎性小體或Apaf-1凋亡小體的結(jié)構(gòu)差異，以及因此所導(dǎo)致的信號傳導(dǎo)機制的不同。

圖7 植物NLR蛋白ZAR1由靜息狀態(tài)進入激活狀態(tài)并寡聚化形成抗病小體的構(gòu)象變化Fig. 7 Conformational changes of plant NLR protein ZAR1 from inactive state to active state and then oligomerized to form resistsome

2021年5月，繼首個CNL類NLR受體ZAR1全長結(jié)構(gòu)得到解析后，兩種TNL-NLR受體復(fù)合物及相應(yīng)抗病小體結(jié)構(gòu)首次通過冷凍電鏡被解析。柴繼杰研究組及其合作者報告了TNL類抗病蛋白RPP1直接識別其效應(yīng)蛋白ATR1后激活并形成全酶的分子機制，區(qū)別于ZAR1-RKS1通過結(jié)合PBL2UMP而間接識別效應(yīng)蛋白的作用機制。該研究通過冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)成功解析了RPP1-ATR1四聚體復(fù)合物激活狀態(tài)的3.2 ?分辨率的結(jié)構(gòu)［102］。結(jié)構(gòu)分析揭示了LRR結(jié)構(gòu)域和新發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域C-JID對效應(yīng)蛋白ATR1的識別，揭示了RPP1抗病小體的形成并作為全酶催化NAD+水解活性的機制（圖8）。生化和功能數(shù)據(jù)表明C-JID結(jié)構(gòu)域在TNL類NLR受體中廣泛存在，作為特異性識別ATR1的主要決定因素，可能對TNL識別配體具有廣譜作用。與ATP作為CNL類NLR受體ZAR1激活并寡聚化不同的是，RPP1中相應(yīng)基序的突變導(dǎo)致結(jié)合在NOD結(jié)構(gòu)域的是ADP，而非dATP/ATP。該研究促進了TNL下游免疫通路信號傳遞機制的研究，為理解植物TNL類抗病蛋白活化機制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

同時，Nogales和Staskawicz研究團隊報道了病原體底物結(jié)合的免疫受體復(fù)合物ROQ1-XopQ的3.8?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了以ROQ1作為范式的TNLs的直接識別、寡聚和TIR結(jié)構(gòu)域激活機制［103］（圖 8）。該研究進一步佐證了 TNL-NLRs與病原體的直接識別作用機制：ROQ1的LRR和C-JID通過直接識別病原體效應(yīng)器XopQ，通過與底物的結(jié)合進而解除TNLs的自抑制狀態(tài)，允許NB-ARC結(jié)構(gòu)域過渡到與ATP結(jié)合、準(zhǔn)備寡聚化形成抗病小體。ROQ1-XopQ的寡聚化組裝使TIR結(jié)構(gòu)域緊密接觸，導(dǎo)致TIR結(jié)構(gòu)域?qū)AD+的切割，釋放二磷酸腺苷核糖（一種觸發(fā)胞漿Ca2+內(nèi)流的信號分子），進而導(dǎo)致抗病性的下游信號通路激活和局部細胞死亡。

圖8 RPP1-ATR1與ROQ1-XopQ分別寡聚化組裝形成抗病小體［103］Fig. 8 Resistosomes oligomerized respectively from RPP1-ATR1 and ROQ1-XopQ

作為植物兩大類NLR受體CNLs和TNLs的代表，ZAR1與RPP1和XopQ的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析結(jié)果是植物抗病蛋白研究領(lǐng)域數(shù)十年來一直期待的重大突破。抗病蛋白在植物免疫系統(tǒng)中扮演著核心角色，因此關(guān)于其生化活性及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一直是植物免疫領(lǐng)域的研究重點，但無論是PRR受體，還是NLR受體，其結(jié)構(gòu)研究進展并不顯著，尚未深入開展結(jié)構(gòu)研究的PRR受體家族除了數(shù)量最多的LRR-RLK受體以外，還包括表皮生長因子樣受體（EGF-like-PRRs）WAK［104］和凝集素結(jié)構(gòu)域型受體（EGF-like-PRRs）DORN1等［105-106］。病原物分泌的效應(yīng)子被寄主細胞識別后如何誘導(dǎo)了NLR受體的N端結(jié)構(gòu)域自我寡聚；效應(yīng)子與抗病蛋白之間的相互作用是否存在中間傳遞分子，以及其如何參與抗病蛋白的構(gòu)象變化和激活？冷凍電鏡技術(shù)將在這些問題的回答中發(fā)揮重要作用。

3.2 冷凍電鏡在植物感知與應(yīng)答非生物脅迫分子機制研究中的應(yīng)用

非生物脅迫和病原菌侵染是影響作物產(chǎn)量和導(dǎo)致巨大損失的兩大主要原因。植物在生長發(fā)育過程中，除了會受到病原體感染侵害之外，經(jīng)常會受到諸如高鹽、低溫、高溫、干旱和水澇等非生物脅迫的影響，造成作物生長不良，嚴(yán)重時導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至死亡。為應(yīng)對各種逆境脅迫，植物已經(jīng)進化出各種機制來感受外界環(huán)境，并通過基因表達調(diào)節(jié)形態(tài)、生理狀態(tài)的方式來對不同的脅迫作出適應(yīng)性響應(yīng)［81，107-108］。

研究人員一直致力于植物體脅迫感受器的鑒定和研究，以期解決植物是如何感知和響應(yīng)非生物脅迫，進而改善植物抗逆性，提升作物產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)性。高滲脅迫是植物在干旱環(huán)境中面臨的主要生存壓力，植物細胞會通過一系列生理過程對該脅迫信號做出應(yīng)答。滲透脅迫可能通過激活某些Ca2+滲透通道快速增加胞質(zhì)Ca2+濃度。這些通道的激活可能是由細胞膜或細胞骨架的滲透應(yīng)力產(chǎn)生的機械力所引起。2014年，研究人員發(fā)現(xiàn)擬南芥的一種質(zhì)膜蛋白OSCA1會形成高滲門控Ca2+通道，并認為OSCA1是植物細胞對高滲信號的感受器［109］。另外，植物細胞利用機械門控的小電導(dǎo)離子通道MscS緩解滲透壓，參與線粒體內(nèi)膜電位的調(diào)節(jié)和非生物脅迫下氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持［110-111］。

2018年，高滲門控Ca2+通道OSCA1蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)被多個研究小組使用冷凍電鏡方法相繼解析。陳雷、宋晨和閆志強研究組通過冷凍電鏡方法率先解析了機械力敏感的非選擇性離子通道 AtOSCA1.1的二聚體結(jié)構(gòu)（3.5 ?）［112］，揭示了OSCA通道的組裝模式，并通過突變體的電生理研究及分子動力學(xué)模擬，推測了該通道基于膜傳遞機械力激活的分子機制和孔道位置（圖9）。該研究通過生化實驗闡明了其功能和二聚體構(gòu)象，鑒定了二聚體界面形成的關(guān)鍵殘基。此外，研究團隊還解析了4.8?分辨率的AtOSCA3.1的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。AtOSCA3.1與AtOSCA1.1在整體架構(gòu)和構(gòu)象上的相似性進一步說明了該蛋白質(zhì)家族的結(jié)構(gòu)保守性。基于所得的結(jié)構(gòu)特征，研究人員推測滲透脅迫在脂質(zhì)雙層中產(chǎn)生張力會導(dǎo)致構(gòu)象變化進而激活OSCA通道以允許Ca2+進入，從而對高滲脅迫信號產(chǎn)生一系列應(yīng)答。

圖9 OSCA1蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及其激活構(gòu)象Fig. 9 cryo-EM structure and activated conformation of OSCA1

同時，Jojoa-Cruz等［113］解析了擬南芥OSCA1.2通道蛋白的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖10，綠色），同一團隊的Murthy等［114］對OSCA通道蛋白的生物物理特性進行更深入的分析，電生理實驗的亞電導(dǎo)狀態(tài)結(jié)果進一步印證了上述研究所解析的OSCA通道蛋白的二聚體結(jié)構(gòu)。與此同時，孫林峰研究組及其合作者也運用單顆粒冷凍電鏡方法對擬南芥OSCA1.2通道蛋白的結(jié)構(gòu)進行了研究，最終獲得了3.7?的分辨率（圖10，紫色）。與其他研究組結(jié)果相比，雖然通道蛋白總體結(jié)構(gòu)非常相似，但在胞質(zhì)螺旋部分及其錨定區(qū)域存在一定差異［115］，暗示不同的胞質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)域可能部分導(dǎo)致了通道蛋白不同的生物物理特性。2019年，Maity等［116］報道了來自水稻的OSCA1.2通道蛋白的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，與擬南芥OSCA1.2相比，水稻OSCA1.2位于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的延伸螺旋臂具有明顯的差異，結(jié)合生物化學(xué)、生物物理和計算研究，該研究提出水稻OSCA1.2如何在滲透脅迫下進行運輸途徑門控的模型，為研究植物細胞的機械傳感機制提供了分子框架。

圖10 AtOSCA1.2單體在多個方向的構(gòu)象Fig. 10 Conformations of AtOSCA1.2 monomer in multiple directions

2019年，孫林峰研究組及其合作者解析了響應(yīng)低滲刺激的擬南芥中小電導(dǎo)機械敏感通道MscS樣蛋白AtMSL1的3.3?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［117］，總體結(jié)構(gòu)與細菌MscS非常相似，但AtMSL1的跨膜結(jié)構(gòu)域更大，羧基末端更具柔韌性，并且缺少在MscS中觀察到的β-桶狀結(jié)構(gòu)。AtMSL1中的側(cè)門明顯較小，通過誘變擴大門的大小可以增加電導(dǎo)性。該研究明確了真核生物中小電導(dǎo)機械敏感離子通道的結(jié)構(gòu)框架和門控機制。2020年，Deng等［118］通過冷凍電鏡單

顆粒技術(shù)解析了小電導(dǎo)機械敏感通道MscS閉合和開放的原子分辨率結(jié)構(gòu)（3.0?），結(jié)合電生理實驗揭示了其通過橫向膜張力導(dǎo)致跨膜區(qū)域扁平化擴張進行門控的結(jié)構(gòu)機制。

鉀元素作為植物必需的三大基本營養(yǎng)元素之一，可以參與多種植物代謝活動，包括氮代謝、滲透調(diào)節(jié)和控制細胞膜極化，對于植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。K+可以提高植物對干旱、高鹽等非生物脅迫的耐受性，同時也可以抵抗真菌等生物脅迫。植物通過體內(nèi)的鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)獲得足夠的K+，其中，鉀離子通道發(fā)揮了重要作用。2020年，基于冷凍電鏡技術(shù)，植物鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能研究取得了一定進展。Perozo小組率先解析了擬南芥中超極化激活的電壓門控鉀離子通道KAT1的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并據(jù)此提出了非結(jié)構(gòu)域交換Kv通道KAT1中機電耦合和門控極性的分子機制［119］。這種直接耦合機制與超極化激活環(huán)狀核苷酸門控通道（HCN）的變構(gòu)機制相反。同時，田長麟小組及其合作者解析了擬南芥全長KAT1的3.2?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)［120］，確定了KAT1是非域交換離子通道，初步確定了其在超極化激活中門控機制的關(guān)鍵要素，并提出了相應(yīng)的門控模型，促進了人們對超極化激活離子通道門控特性的了解。

通過冷凍電鏡技術(shù)，研究人員已經(jīng)獲得了部分植物部分非生物脅迫感受器的分子結(jié)構(gòu)，但尚有眾多的脅迫感受器，比如增加耐熱性的擬南芥環(huán)核苷酸門控Ca2+通道CNGC6［121］，定位于水稻細胞質(zhì)膜上的低溫感受器COLD1［122-123］，水稻中可以提升冷凍耐受性的兩種鈣調(diào)蛋白受體樣細胞質(zhì)激酶CRLK1和CRLK2［124-125］和下調(diào)冷凍耐受性的低溫響應(yīng)性蛋白激酶CPRK1［126］，基于Ca2+成像遺傳篩選手段分離鑒定的在鹽脅迫信號感知中的關(guān)鍵蛋白MOCA1［127］，其結(jié)構(gòu)功能研究有待開展，冷凍電鏡技術(shù)將發(fā)揮重要作用。

4 展望

綜上，冷凍電鏡技術(shù)在分子植物學(xué)領(lǐng)域已得到眾多應(yīng)用（表1），主要包括：光合作用復(fù)合物的結(jié)構(gòu)功能研究，為進一步闡明光合作用分子機理提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；植物感應(yīng)生物脅迫的相關(guān)免疫受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)功能研究，促進了對植物免疫分子機制的認識；植物感應(yīng)非生物環(huán)境脅迫相關(guān)感受器的結(jié)構(gòu)功能研究，揭示了一類新的植物離子通道激活的分子機理。未來，冷凍電鏡技術(shù)將在植物光合作用、脅迫響應(yīng)等方面的分子機理研究發(fā)揮更大的作用，這包括了對于高等植物光系統(tǒng) I復(fù)合體、低等植物細胞色素b6f等的結(jié)構(gòu)研究，包括了對于植物PRR受體WAK和DORN1等的結(jié)構(gòu)研究，包括了對于植物Ca2+通道CNGC6、低溫感受器COLD1和低溫響應(yīng)性蛋白激酶CPRK1等的結(jié)構(gòu)研究。此外，冷凍電鏡等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)近年來不斷發(fā)展和突破，特別是原位冷凍電鏡技術(shù)的突破和成熟［80］，人工智能結(jié)構(gòu)計算技術(shù)AlphaFold2的出現(xiàn)和成功［128］，為冷凍電鏡技術(shù)在分子植物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的更大的契機。這些新技術(shù)的成功應(yīng)用將有效推動人們對植物光合作用、脅迫感知和抗病應(yīng)答分子機理的認識，為改良育種提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)做出貢獻。

表1 冷凍電鏡技術(shù)解析獲得的植物相關(guān)重要生物大分子結(jié)構(gòu)Table 1 Structure of important plant-related biological macromolecules solved by cryo-EM