張麗勍,李雄偉,石大艷,余永婷,方獻(xiàn)平,周慧娟,張學(xué)英,葉正文*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所,上海 201403；2 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201403；3貴州師范學(xué)院,貴陽 550018；4 安順學(xué)院,安順 561000)

桃為薔薇科桃屬植物,起源于我國,迄今已有4 000 多年的栽培歷史[1]。2017—2018年我國鮮食桃(含油桃)產(chǎn)量1 430 萬t,居全球首位[2]。我國桃果實(shí)成熟期通常在6—8月份,采運(yùn)季節(jié)常遇高溫濕熱天氣,導(dǎo)致桃采后生理代謝旺盛,易變軟、腐爛和遭受病蟲害。一般來說,桃果實(shí)品質(zhì)從優(yōu)良至腐爛變質(zhì)、不可食用的時(shí)間僅為2—3 d[3]。其中,真菌病害引起的桃腐爛最為嚴(yán)重,輕者腐爛率為10%—30%,重者高達(dá)50%以上,給我國桃產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。2018年上海市桃樹種植面積0.45 萬hm2,產(chǎn)量7.40 萬t,產(chǎn)值7.37 億元人民幣[4]。

上海地處長江入?？?屬亞熱帶季風(fēng)性氣候,雨量充沛。2019年上海市6月17日入梅,7月20日出梅,梅雨期33 d(常年23 d),出梅偏晚,降水量明顯偏多,為常年平均值的2.1 倍,導(dǎo)致桃爛果增多。梅雨季適宜的溫度和潮濕的天氣最有利于病原菌的生長和傳播。目前,我國已報(bào)道的引起桃腐爛的病原菌有10 種[3,5-6]。本研究對上海桃產(chǎn)區(qū)的桃腐爛樣品進(jìn)行分離和鑒定,并通過柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證,以期明確上海地區(qū)引起桃腐爛的主要病原菌種類,為其有效防控提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌的分離

2019年6—7月從奉賢區(qū)、浦東新區(qū)和金山區(qū)等上海桃產(chǎn)區(qū)采集桃樹上病果70 份。采用組織分離法對病樣進(jìn)行分離純化,純化后的菌株置于4 ℃和-80 ℃各保存1 份。

1.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將在PDA 平板上培養(yǎng)的病原菌用無菌打孔器在菌落邊緣處打孔,將菌塊置于新的PDA 平板上28 ℃黑暗培養(yǎng),5 d 后對菌落形態(tài)特征進(jìn)行記錄并在光學(xué)顯微鏡(Leica DM 2700 M)下觀察菌絲形態(tài)、分生孢子形態(tài)及測量大小。美澳型核果褐腐病菌(M.fructicola)分生孢子形態(tài)學(xué)觀察參照Hu 等[7]方法,將桃果實(shí)接種褐腐病菌,培養(yǎng)4 d 后,挑取病斑表面產(chǎn)生的分生孢子進(jìn)行觀察。葡萄座腔菌(B.dothidea)分生孢子形態(tài)學(xué)觀察參照Yuan 等[8]誘導(dǎo)產(chǎn)孢方法:取剪成長5 cm 左右的健康松針,121 ℃滅菌,放置在水瓊脂培養(yǎng)基上,接入菌株,28 ℃培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿；隨后置于20 ℃有光照的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及菌株ITS 序列分析

用無菌槍頭刮取PDA 平板培養(yǎng)的菌絲,采用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA, -20 ℃保存。對84 個(gè)菌株的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS) 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增引物序列:ITS1 (5’-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3’)∕ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[9]。產(chǎn)物測序由生工生物工程(上海)股份技術(shù)有限公司完成。將測定的序列在GenBank 中進(jìn)行Blast 比對,根據(jù)比對結(jié)果確定歸屬。

1.4 多基因建樹分析

根據(jù)ITS 測序結(jié)果,選取15 株褐腐菌代表菌株進(jìn)行甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(G3PDH)和β-微管蛋白基因(TUB2)的PCR 擴(kuò)增及測序。PCR 擴(kuò)增引物序列:Mon-G3pdhF(5’-ACGGTCAATTCAAGGGTGAT-3’)∕Mon-G3pdhR(5’-ATCGAAGATGGAGGAGTGGT-3’)和Mon-TubF1(5’-ATGCGTGAGATTGTACGTAT-3’)∕Mon-TubR1(5’-GTACCAATGCAAGAAAGCCT-3’)[7]。采用DNASTAR 軟件和CLUSTAL X 1.81 軟件對褐腐菌15 株代表菌株測序的G3PDH和TUB2 基因序列與下載自GenBank 的參考序列進(jìn)行序列比對分析[10]。利用MEGA v7.0.26 軟件對其進(jìn)行手動校正[11]；利用貝葉斯法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,在MrBayes v3.2.2 軟件中,利用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)算法對貝葉斯后驗(yàn)概率樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MrModeltest v2.3 軟件的Akaike 信息準(zhǔn)則(AIC)選擇最佳核苷酸替換模型[12]。利用MrBayes v3.2.2軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析,當(dāng)分裂頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)差低于0.01 時(shí),停止分析。生成的進(jìn)化樹利用FigTree 1.4.3 軟件進(jìn)行可視化。如果后驗(yàn)概率≥0.95,則視為顯著支持。所得系統(tǒng)發(fā)育樹選用FigTree 1.4.3 軟件進(jìn)行分析。

構(gòu)建G3PDH-TUB2 系統(tǒng)進(jìn)化樹時(shí),利用B.fuckeliana的G3PDH基因(GenBank 序列號AJ705006)和TUB2 基因(GenBank 序列號Z69263)序列作外群。

1.5 致病性測定

按照柯赫氏法則將分離到的病原菌進(jìn)行回接。本試驗(yàn)利用黃桃品種‘錦繡’進(jìn)行接種測定,分為刺傷和無刺傷接種。選取外觀整齊、成熟度及大小相似、健康的桃果實(shí),用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇對桃果實(shí)表面進(jìn)行消毒后,無菌水沖洗3 次。刺傷接種:用無菌接種針在桃果實(shí)表面刺一個(gè)約5 mm 深的孔,同時(shí)用打孔器從新鮮菌落的邊緣(PDA 平板上培養(yǎng)5 d)取直徑5 mm 的菌餅,倒置(菌絲向下)放于桃果實(shí)表面的針孔上。無刺傷接種:用打孔器從新鮮菌落的邊緣(PDA 平板上培養(yǎng)5 d)取直徑5 mm 的菌餅倒置于桃果面上。將接種后的桃果實(shí)置于塑料盒中,盒子的底部放入潤濕的吸水紙以保證培養(yǎng)濕度近100%,并蓋上塑料蓋。將塑料盒置于25 ℃的人工氣候培養(yǎng)箱中,光照條件設(shè)為12 h 光照∕12 h 黑暗的交替,培養(yǎng)48 h 后去掉塑料蓋。每隔24 h 對發(fā)病情況進(jìn)行記錄并測量病斑直徑。刺傷接種和無刺傷接種的對照均取直徑5 mm 的PDA 瓊脂塊倒置于桃果面,重復(fù)5 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

對70 個(gè)病果進(jìn)行病菌分離,共分離到84 個(gè)真菌菌株,根據(jù)菌落形態(tài)將菌株分為5 種類型,分別命名為SP1、SP2、SP3、SP4 和SP5,各類型菌落的分離率依次為75.00%、8.33%、8.33%、4.76%和3.57%。從圖1 可以看出,SP1 菌落為灰褐色,邊緣較為整齊,無玫瑰花瓣結(jié)構(gòu)；SP2 菌落初期為白色,后從中央轉(zhuǎn)為紫色,絮狀菌絲；SP3 菌落顏色為白色、奶油色；SP4 菌落顏色初期為白色,后從中央開始轉(zhuǎn)為灰色；SP5 菌落初期為白色,后從中央開始轉(zhuǎn)為灰綠色,菌落蓬松。

圖1 不同類型菌株的菌落及其孢子形態(tài)Fig.1 Morphology of colony and spore of different pathogen species

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

SP1 的分生孢子透明,呈橢圓形、檸檬形或卵圓形,單細(xì)胞,鏈狀,有分枝(圖1),分生孢子大小為(10.2—27.8)μm× (7.1—18.4)μm(圖1c)。SP2 的小孢子細(xì)長、橢圓形、無隔或具有一個(gè)隔膜,大小為(5.5—12.3)μm×(2.2—3.8)μm；大型分生孢子透明、彎曲、鐮刀形,有1—5 個(gè)分隔,大小為(28.0—48.2)μm×(3.6—4.3)μm(圖1f)。SP3 的孢子呈長方形兩端略鈍圓近方形或圓柱形,單細(xì)胞,大小為(5.0—12.5)μm×(2.5—4.0)μm(圖1i)。SP4 的分生孢子呈卵圓形或橢圓形,單細(xì)胞,無色,分生孢子大小為(8.1—14.5)μm×(7.5—9.0)μm(圖1l)。利用松針誘導(dǎo)的SP5 代表菌株呈紡錘形或梭形,薄壁、無隔、無色透明,分生孢子大小為(16.0—22.0)μm×(4.5—9.0)μm(圖1o)。

2.2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對5 種類型的代表菌株進(jìn)行ITS 序列的擴(kuò)增,擴(kuò)增片段長度分別為537 bp(SP1)、564 bp(SP2)、376 bp(SP3)、537 bp(SP4)和585 bp(SP5)；GenBank 登錄號分別為MN689861、MN689858、MN689859、MN689856 和MN689841。BLAST 分析比對表明:5 種類型的代表菌株與美澳型核果褐腐病菌(M.fructicola) (MH860465.1)、 層 出 鐮 孢 菌(F.proliferatum) (MK336501.1)、 白 地 霉(G.candidum)(KY495323.1)、灰霉菌(B.cinerea)(KT723007.1)和葡萄座腔菌(B.dothidea)(KC218814.1)的一致性分別為98.88%、99.82%、99.05%、99.25%和98.97%,覆蓋率(Query coverage)分別為99%、96%、100%、99%和99%。根據(jù)比對結(jié)果,將上述5 種類型病原菌分別鑒定為M.fructicola、F. proliferatum、G.candidum、B.cinerea和B.dothidea。

對上海地區(qū)分離的15 株褐腐菌菌株分別擴(kuò)增G3PDH和TUB2 基因序列(GenBank 登錄號見表1),構(gòu)建G3PDH-TUB2 多基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,15 株菌株均以高支持率(貝葉斯后驗(yàn)概率≥0.95)與美澳型核果褐腐病菌(M.fructicola)菌株聚為1 個(gè)進(jìn)化分支(圖2)。

圖2 基于G3PDH-TUB2 基因序列構(gòu)建的15 株褐腐菌和14 株參考菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 15 Monilinia isolates and14 reference isolates constructed based on G3PDH-TUB2 gene sequence

表1 Monilinia 菌株信息及GenBank 登錄號Table 1 Monilinia isolates information and GenBank accession numbers

2.3 致病性

將5 種類型病原菌的代表菌株分別接種至‘錦繡’黃桃成熟果實(shí),25 ℃培養(yǎng),刺傷接種和無刺傷接種3 d 后均可見明顯的病斑(圖3、表2)。對接種的果實(shí)進(jìn)行再分離并純培養(yǎng),均可獲得與原來病原菌性狀一致的病菌。

表2 5 種不同病原菌在桃果實(shí)上的致病性(25 ℃,接種后6 d)Table 2 Pathogenicity of 5 different pathogen species on peach fruits(25 ℃,6 days after inoculation)

圖3 5 種不同病原菌接種桃果實(shí)(‘錦繡’)后的發(fā)病癥狀Fig.3 Symptoms of peach fruits(‘Jinxiu’) inoculated with 5 different pathogen species

3 討論

本研究表明,引起上海桃腐爛的病原菌有5 種,分別是美澳型核果褐腐病菌(M.fructicola)、層出鐮孢菌(F.proliferatum)、白地霉(G.candidum)、灰霉菌(B.cinerea)和葡萄座腔菌(B.dothidea)。褐腐病是引起桃腐爛的重要病害之一,其引起的桃果實(shí)腐爛病的發(fā)生率輕者為20%左右,重者高達(dá)100%[13-14]。桃褐腐病在采前、采后運(yùn)輸、貯藏期間均可發(fā)生,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[15]。近年來,我國東部、東南部、中部和西部桃主要產(chǎn)區(qū)均出現(xiàn)大量感染褐腐病的報(bào)道[16-18]。Moniliniaspp.病原真菌在生物學(xué)性狀、發(fā)生流行規(guī)律及致病性方面各有不同[19],因此明確上海地區(qū)桃褐腐病病原種類具有重要意義。該菌群分類較為復(fù)雜,利用多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)合形態(tài)特征分析,結(jié)果更為準(zhǔn)確。本研究選取分離自上海不同桃產(chǎn)區(qū)的15 株菌株,通過形態(tài)學(xué)鑒定和G3PDH-TUB2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,明確了上海地區(qū)引起桃褐腐病的主要病原菌為美澳型核果褐腐病菌(M.fructicola)。美澳型核果褐腐病菌也是引起我國桃褐腐病的最主要病原菌[7]。因此,應(yīng)將M.fructicola作為上海地區(qū)褐腐病防治管理策略中的主要目標(biāo)重點(diǎn)防治,避免造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

我國有關(guān)層出鐮孢菌(F.proliferatum)的報(bào)道主要集中在水稻、玉米等作物上[20-21]。2018年,福建省寧德市首次報(bào)道了F.proliferatum為引起桃果腐病的新病原菌,且當(dāng)?shù)氐奶夜麑?shí)受害率達(dá)20%[22]。葡萄座腔菌(B. dothidea)寄主廣泛,在蘋果上可以引起蘋果輪紋病,且在潮濕的環(huán)境中侵染較嚴(yán)重。B.dothidea釋放分生孢子的高峰期在5—6月份,在溫度適宜的條件下,病菌的分生孢子在降雨持續(xù)4 h 后就開始大量釋放[23]。B.dothidea在桃樹主干、主枝和側(cè)枝上可以引起流膠,造成病原性桃流膠病[24]。我國目前有關(guān)B.dothidea引起桃果腐的報(bào)道較少。近年來上海地區(qū)桃流膠病發(fā)生嚴(yán)重,B.dothidea可以在為害枝干上越冬,且可存活4—5年[25],而上海6—7月份的梅雨天氣尤其適合該病的侵染及傳播,這也間接加重了桃腐爛病發(fā)生,推測此為果實(shí)受害的主要原因。B.dothidea具體傳播侵染機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。開花至果實(shí)采收期間濕度過大是桃灰霉病(B.cinerea)發(fā)生和流行的主要條件。在桃真菌病害發(fā)病初期,葡萄座腔菌引起的桃腐和桃灰霉病等不能依靠肉眼有效區(qū)分,建議對兩種病害進(jìn)行綜合防治。在我國,由白地霉(G.candidum)侵染引起的酸腐病是桃果實(shí)在采后運(yùn)輸和貯藏中的主要病害[26]。本研究首次證實(shí)了白地霉在采前生產(chǎn)過程中對桃果實(shí)的侵染。Schnabel 等[27]報(bào)道了由G.candidum侵染引起的桃酸腐病是美國南卡羅來納州夏季重要病害之一。G.candidum孢子對桃果實(shí)的致病能力,可能會由于其他病原真菌的存在而增加。Morris 等[28]早在1982年就在柑橘果實(shí)中觀察到了G. candidum與青霉菌(Penicillium digitatum)的孢子之間存在協(xié)同作用。因此,研究白地霉孢子與其他病原菌孢子之間可能存在的協(xié)同致病機(jī)理具有重要意義。

本試驗(yàn)首次明確了上海地區(qū)夏季桃腐爛病害的主要病原菌,為各果園后期進(jìn)行有效的綜合防治及預(yù)測預(yù)報(bào)奠定了基礎(chǔ),同時(shí)對桃采后病害的防控具有重要的指導(dǎo)作用。