王 迪，俞 英

(中國農業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193)

奶業(yè)是現(xiàn)代農牧業(yè)和食品行業(yè)發(fā)展最快、最有活力的產業(yè)之一。牛奶及各類奶制品已成為人民生活中必不可缺的一部分，牛奶品質則與人們的健康密不可分。奶牛乳房炎是影響奶業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要疾病之一，發(fā)病的主要原因是病原微生物通過奶牛的乳頭導管以及乳房皮膚外傷等進入奶牛的乳腺組織，引起乳腺發(fā)生炎癥反應。根據(jù)臨床表現(xiàn)，可將奶牛乳房炎分為臨床乳房炎和隱性乳房炎。據(jù)報道，全球荷斯坦牛群隱性乳房炎發(fā)病率高達48%，我國為25%～70%[1-2]。隱性乳房炎不僅嚴重影響牛奶產量和品質，還會極大增加妊娠牛的流產率和淘汰率，給現(xiàn)代奶業(yè)帶來嚴重的經濟損失。本文針對近年來有關奶牛乳房炎及其在轉錄組以及表觀基因組等方面的研究進展進行了綜述。

1 奶牛乳房炎研究進展

奶牛乳房炎[3]是乳業(yè)生產中花費最高的疾病之一，提高乳房炎抗性已成為奶牛育種的重要目標。但是，乳房炎抗性通常涉及多個過程的多基因調控，包括對感染、炎癥和感染后愈合的反應。低遺傳力、環(huán)境變異和農場管理差異使得鑒定遺傳變異與乳房炎抗性的關系變得更為復雜和困難。臨床乳房炎可以通過乳房、乳汁的異常表現(xiàn)檢測到；而隱性乳房炎的特征是體細胞數(shù)(somatic cell counts，SCCs)增加，但乳房或者乳汁中沒有任何感官異常。由于較高的發(fā)病率，隱性乳房炎造成的經濟損失要更大。

1.1 奶牛隱性乳房炎抗性相關基因研究進展

奶牛隱性乳房炎抗病育種研究主要利用QTL(quantitative trait locus)定位、候選基因及全基因組關聯(lián)分析等方法，挖掘與隱性乳房炎抗性相關的候選基因或QTLs。已有多項研究定位到大量與SCCs及體細胞評分(somatic cell score，SCS)顯著相關的常染色體QTLs。2012年，Meredith等[4]通過全基因組關聯(lián)分析鑒定到與產奶性狀和體細胞評分顯著相關的276個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)。2013年，王曉等[5]利用Illumina牛54K芯片對2 093頭中國荷斯坦牛進行SNP檢測，基于case-control分組策略進行GWAS(genome-wide association study)分析，發(fā)現(xiàn)了6個與奶牛乳房炎抗性關聯(lián)顯著的SNPs及其相鄰基因可作為奶牛乳房炎抗性的分子標記及候選基因；2015年，基于上述2 093頭 奶牛SCCs育種值，利用GWAS鑒定分析了與奶牛乳房炎抗性及易感性相關的SNPs和候選基因[6]，發(fā)現(xiàn)TRAPPC9可作為潛在候選基因；馮文等[7]進一步將TRAPPC9作為抗性候選基因，與奶牛金葡菌乳房炎的遺傳效應進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)TRAPPC9可作為中國荷斯坦牛金葡菌乳房炎抗性的分子遺傳標記。2020年，Kirsanova等[8]在挪威紅牛群體，對基于測定日體細胞數(shù)閾值定義的12個隱性乳房炎性狀進行了全基因組關聯(lián)分析，鑒定到ACOT2、ACOT4、FOS基因和一系列趨化因子基因(C-X-Cmotif)等可作為挪威紅牛隱性乳房炎的潛在候選基因。

1.2 奶牛金葡菌乳房炎研究進展

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus，簡稱金葡菌)是導致奶牛隱性乳房炎的主要接觸傳染性致病菌[9-10]。金葡菌是一種重要的人獸共患細菌，對全球人類和動物的健康有害[11]。約有25%～30%的健康人群黏膜上攜帶金葡菌，正常情況下不會引發(fā)疾病，但當出現(xiàn)創(chuàng)傷時，金葡菌將造成皮膚和軟組織感染，主要包括膿皰病、毛囊炎、鼻炎、潰瘍和傷口感染等。在金葡菌感染過程中，金葡菌會產生多種酶(蛋白酶、脂肪酶和彈性蛋白酶等)，這些酶會強化其攻擊力，破壞宿主的組織并且向其他位置擴展和進攻(圖1)[14]。與其它細菌相比，金葡菌極強的耐藥性使其具有極低的治愈率和極高的致死率，其中，耐甲氧西林金葡菌(Methicillin-resistantS.aureus，MRSA)是迄今為止最不易治療的“超級細菌”之一[15]。

奶牛金葡菌乳房炎通常表現(xiàn)出潛伏期長、高接觸性傳染、持續(xù)性感染、呈隱性發(fā)作、容易產生耐藥性和導致乳腺壞死等特征，目前主要使用抗生素對其進行治療[16]。但是由于金葡菌的耐藥性及牛奶中抗生素殘留等問題，國內外學者們正在努力探索通過遺傳學手段降低奶牛金葡菌乳房炎的發(fā)生率，并通過候選基因法、全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)等研究方法和轉錄組、蛋白質組、表觀基因組等測序技術手段篩選到了許多與奶牛金葡菌乳房炎相關的抗性候選基因及重要的信號通路，為奶牛金葡菌乳房炎的抗病遺傳育種提供了寶貴的數(shù)據(jù)支持。

2014—2015年，Usman等[17-18]通過候選基因法分別分析了JAK2、STAT5A和STAT5B基因SNPs與中國荷斯坦牛血清細胞因子、乳房炎和產奶性狀之間的關系，認為JAK2、STAT5A和STAT5B基因可作為奶牛金葡菌乳房炎抗性的候選基因，顯著的SNPs可作為潛在的分子遺傳標記。目前也有研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT信號通路參與機體的免疫應答反應[19]，并且與炎癥、癌癥和神經退行性疾病相關，但是該通路在奶牛金葡菌隱性乳房炎中的功能研究未見報道。2015年，Pawlik等[20]對CXCR1基因及該基因SNPs與金葡菌乳房炎易感性及SCCs相關性進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)測定日SCCs與CXCR1的1個SNP顯著相關，而CXCR1基因多態(tài)性與金葡菌乳房炎易感性相關，但是未達統(tǒng)計學顯著水平。同年，Mazzilli等[21]通過芯片技術調查研究了33個奶牛場中分離到的94株金葡菌毒力基因類型和免疫逃逸基因分布情況，并發(fā)現(xiàn)與SCCs升高顯著相關的一系列基因(ssl5、ssl7、Sak和SCIN等)，可作為進一步研究新型抗金葡菌疫苗的候選標記基因。

A.金葡菌通過防止識別、抑制免疫細胞趨化性、調節(jié)ROS、抗Amp及直接溶解白細胞等途徑攻擊免疫系統(tǒng)；B. 中性粒細胞吞噬細菌會導致ROS和脫顆粒的增加，有助于殺死所攝入的微生物并導致中性粒細胞凋亡，巨噬細胞可以將其清除以幫助解決感染?；蛘?，細菌通過加速細胞凋亡的延遲或增加中性粒細胞的損傷，使得病原體逃逸并進入組織，進而導致疾病的發(fā)生A. S. aureus attacks the immune system by various trials as preventing identification, preventing chemotaxis, regulating ROS, resistance to Amp, and directly lysis of leukocytes; B. Phagocytosis of bacteria by neutrophil leads to increased ROS and degranulation, which help in killing the ingested microorganism and resulted in apoptosis of neutrophil that can be removed by macrophage to aid in the resolution of infection. Alternatively, bacteria may change in normal neutrophil by accelerating a delay of apoptosis or enhanced neutrophil damage, helping the pathogen escape and get into the tissue, which leads to the occurence of disease圖1 宿主免疫系統(tǒng)對抗金葡菌感染的機制[14]Fig.1 Mechanisms of the immune system against S. aureus infection[14]

2 奶牛乳房炎抗病遺傳育種與轉錄組學研究

奶牛乳房炎抗性的眾多遺傳變異已經得到證實，主要通過估計與乳房炎相關的表型性狀(如體細胞數(shù)和臨床記錄等)的多基因變異的遺傳力和遺傳相關進行研究。從經濟角度和動物福利與食品安全的考慮，加之消費者與育種工作者的關注，綜合各方面因素，已將乳房炎抗性納入到奶牛的育種目標中。

2.1 轉錄組測序及其在奶牛乳房炎中的研究進展

隨著高通量測序技術的發(fā)展，RNA-seq的應用越來越廣泛。通常情況下，RNA將被轉錄為cDNA文庫，并在其一端或兩端連接銜接子(adaptors)并對其進行測序，從而獲得高質量的Reads。RNA-seq是一種集合實驗方法和計算機手段的技術，它可以確定生物樣品中RNA序列的特征和表達豐度，即可以通過RNA測序技術識別出每條單鏈RNA分子中的核糖核苷酸殘基的組成序列。RNA測序技術自誕生起就應用于分子生物學，用于解讀各個層面的基因功能。

在牛的研究上，轉錄組測序技術的應用越來越廣泛。2014年，McLoughlin等[22]對牛分枝桿菌感染牛外周血白細胞的轉錄組進行分析，并與表達芯片結果進行比較，發(fā)現(xiàn)RNA-seq結果具有更高的動態(tài)范圍，可以更精確、更靈敏地鑒定和定量差異表達基因。大腸桿菌感染奶牛乳腺后的轉錄組學研究揭示了一系列差異表達基因及其顯著富集的免疫反應相關通路[23-24]。某法國課題組對乳房炎易感綿羊和乳房炎抗性綿羊的乳汁體細胞進行金葡菌和表皮鏈球菌感染試驗，并進行轉錄組學研究，發(fā)現(xiàn)乳房炎抗性的綿羊具有更活躍的免疫反應[25]。相對于乳房炎易感奶牛來說，在應對金葡菌或大腸桿菌攻擊時，乳房炎抗性奶牛的乳腺上皮細胞轉錄組水平上的反應更強烈[26]。上述結果說明，在抵抗微生物入侵時奶牛乳腺對細菌的易感性起到重要作用，因此奶牛乳房炎抗性的選育工作至關重要。

2.2 奶牛金葡菌乳房炎抗性的轉錄組學研究進展

自20世紀90年代以來，微陣列表達芯片逐步應用于生物學研究，在乳房炎研究上也發(fā)揮重要作用。隨著高通量測序技術的發(fā)展，RNA-seq已成為了解宿主與病原體關系、探究乳房炎抗性機制的主要工具。一些轉錄組學研究探究了在奶牛乳房炎中乳腺組織對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的應答反應，以及肝組織對大腸桿菌感染和脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)的反應。奶牛乳腺上皮細胞在乳腺的先天性免疫防御中起重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)感染區(qū)與對照組的乳汁中體細胞，以及不同病原體引起的乳房炎分離的乳汁中體細胞之間廣泛存在基因表達的差異性[27]。

轉錄組分析可以鑒定病原菌感染乳腺組織過程中對部分基因表達和通路的調控作用。不同病原體引起的先天性免疫反應通常不同，通常大腸桿菌乳房炎中的細胞因子反應更為強烈，而引起慢性感染可能是金葡菌乳房炎中炎性細胞因子上調水平較低造成的。2016年，He等[28]對健康奶牛和金葡菌乳房炎奶牛的外周血淋巴細胞進行了數(shù)字基因表達譜測序，篩選到一些參與到JAK-STAT信號通路、細胞因子-細胞因子受體互作、T細胞受體信號通路和代謝通路相關的基因與金葡菌乳房炎密切相關，可作為奶牛金葡菌乳房炎抗性候選基因。同年，Wang等[29]對健康奶牛和金葡菌乳房炎奶牛的乳腺組織進行轉錄組測序，篩選到一系列免疫相關基因ITGB6、MYD88、ADA、ACKR1等可作為奶牛金葡菌乳房炎抗性候選基因。2016年，Song等[30]通過DNA甲基化組和轉錄組的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)了NRG1、MST1、NAT9三個基因可作為金葡菌乳房炎抗性的潛在候選基因。轉錄組表達數(shù)據(jù)與QTL數(shù)據(jù)的整合分析可以更好地定位QTL區(qū)域基因，在應對遺傳力相對較低的復雜性狀(如奶牛乳房炎)時更有效率。Fang等[31]通過檢查高、低濃度金葡菌攻菌24 h后奶牛乳腺組織轉錄組的改變，鑒定到194個基因與高濃度金葡菌感染有關，這些基因主要參與先天性免疫反應；通過轉錄組與QTL數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合分析，最終確定了28個與金葡菌乳房炎抗性相關的候選基因。

3 奶牛乳房炎抗病遺傳育種與表觀遺傳學研究

炎癥反應受到遺傳因素和非遺傳因素的調控，表觀遺傳在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調控作用[32]。在奶牛乳房炎的防治中，除了抗生素治療，國內外學者正努力通過抗病遺傳育種手段來提高奶牛乳房炎抗性。但是由于低遺傳力和微效多基因效應，許多與乳房炎抗性相關的候選基因并不能得到有效利用。因此，僅從病原微生物或遺傳學角度，均難以有效實現(xiàn)奶牛乳房炎的防控。表觀遺傳學建立了病原微生物(環(huán)境)與疾病抗性(表型)之間的聯(lián)系[33](圖2)，從表觀遺傳修飾與調控方面對炎癥調控作用的研究，為金葡菌乳房炎帶來了新的思路和挑戰(zhàn)。DNA甲基化[34]是最早被發(fā)現(xiàn)、且目前研究最為深入的表觀遺傳調控機制之一，并且在細胞分化、胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生等過程中都發(fā)揮重要作用，是當前表觀遺傳學研究的熱點之一[35]。近年來，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化變動與多種癌癥有關，例如肝細胞癌、膠質母細胞瘤、乳腺癌、鱗狀細胞肺癌、甲狀腺癌和白血病等[36-37]。同時，也有很多研究發(fā)現(xiàn)其與多種慢性病、代謝紊亂和神經系統(tǒng)疾病等有關[38-39]。

圖為不同影響因素(左)與表觀遺傳學過程(中)和基因組(垂直的DNA螺旋結構)相互作用對表型(右)的影響The figure show the common impact factors (left) that interact with epigenetic processes (center) and the genome (vertical DNA helix structures) to influence phenotypic outcome (right)圖2 表觀遺傳學調控聯(lián)系不同影響因素和動物表型[33]Fig.2 The epigenetic regulatory links different impact factors and animal phenotypes[33]

3.1 奶牛乳房炎的表觀遺傳學研究進展

奶牛乳房炎是一種復雜疾病，受環(huán)境與病原菌的共同影響，同時也與個體自身的耐受力相關，其遺傳力較低，且目前尋找到的乳房炎相關候選基因的效應較小，在不同群體中效應也有所不同，難以得到有效利用。通過抗病遺傳育種的手段去控制奶牛乳房炎還有一定的難度，僅從病原菌角度或僅從遺傳學角度均難以有效實現(xiàn)奶牛乳房炎的防控?！斑z傳-表觀遺傳假說”認為，環(huán)境因素致病(如病原菌、病毒、激素等)主要通過DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀基因組起作用，表觀遺傳學對炎癥調控作用的研究從表觀遺傳修飾與調控方面為奶牛乳房炎的研究帶來了新的思路與研究手段。

為應對炎癥反應，宿主機體會分泌相應的細胞因子調控基因表達。DNA甲基化在調控基因表達過程中起到關鍵作用，且DNA甲基化與奶牛乳房炎的發(fā)生發(fā)展相關[40-41]，Song等[30]在金葡菌乳房炎奶牛與健康奶牛之間觀察到外周血淋巴細胞的DNA甲基化差異，發(fā)現(xiàn)NRG1、MST1和NAT9基因與金葡菌乳房炎的發(fā)展密切相關，是提高奶牛金葡菌乳房炎抗性的表觀遺傳學標記。2020年，Ju等[42]通過RRBS和RNA-seq方法首次探究了自然感染大腸桿菌乳房炎奶牛的血液中性粒細胞全基因組DNA甲基化和轉錄組模式，并發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌乳房炎感染中起到關鍵作用的基因(CITED2、SLC40A1和LGR4)。這些基因通過DNA甲基化在大腸桿菌乳房炎奶牛中調控基因的差異表達，可作為大腸桿菌乳房炎抗性候選表觀遺傳標記。

此外，DNA甲基化對miRNA的表達具有重要影響，大約10%的miRNAs表達受到DNA甲基化的調控[43]。有研究發(fā)現(xiàn)差異甲基化的bta-mir-15a和bta-miR-146a在乳腺炎癥的調節(jié)中起重要作用[42-44]。DNA甲基化還參與基因可變剪接事件的調控[45]，2018年，Zhang等[41]報道IL6R基因的第二外顯子區(qū)域的甲基化水平在乳房炎奶牛的乳腺組織中顯著升高，從而促進了IL6R基因可變剪接事件的發(fā)生。Ju等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，LGR4基因的一個的可變剪接體中第五外顯子存在一個139 bp序列的缺失，且乳房炎奶牛中LGR4基因第五外顯子的甲基化水平顯著降低，推測LGR4基因第五外顯子的DNA甲基化可能調節(jié)該基因的可變剪接，從而調控基因的表達。

3.2 奶牛金葡菌乳房炎抗性的表觀遺傳學研究進展

在牛中，存在多基因相關的復雜疾病與表觀遺傳修飾異常有關，如奶牛乳房炎、布魯氏桿菌病、繁殖障礙綜合征等。多基因相關疾病的遺傳基礎較為復雜，遺傳-病原體-環(huán)境間的互作是導致這類復雜疾病的主要原因。而炎癥是哺乳動物復雜疾病研究最多的話題之一，同時關于炎癥與癌癥之間錯綜復雜關系的研究正在成為科學界尤其是醫(yī)學界的熱門領域，一直備受研究者的關注。目前關于炎癥研究最為集中的是炎癥相關癌癥微環(huán)境，即病原——慢性炎癥——癌癥。

金葡菌由于其免疫逃逸機制[46-47]，可以迅速適應乳腺環(huán)境并致使牛只感染隱性乳房炎[48-49]。相較于其他細菌感染，金葡菌乳房炎癥狀更輕，甚至呈現(xiàn)無癥狀感染，但是金葡菌乳房炎的感染持續(xù)時間長，并且表現(xiàn)出顯著的抗藥性[50]。此外，在擠奶過程中金葡菌會在牛群中進行傳播[51]，使得金葡菌乳房炎的防控變得難上加難。金葡菌乳房炎在給奶業(yè)帶來巨大經濟損失的同時，也會通過牛奶帶來重大的公共健康隱患。

近年來，很多研究致力于金葡菌乳房炎的轉錄組和轉錄調控機制的探索，旨在從不同角度尋找生物標記，應用于基因組選擇、分子診斷和治療等[30-31]。miRNA是一種重要的基因轉錄后調控機制，Jin等[52]對奶牛乳腺上皮細胞系Mac-T細胞進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)4個差異調控的miRNAs(bta-miR-2339、miR-499、miR-23a和miR-99b)可作為奶牛金葡菌乳房炎診斷和防控的生物標志物。DNA甲基化是哺乳動物基因組中最穩(wěn)定的表觀遺傳修飾。在不同組織中鑒定表觀基因組模式有助于了解表觀遺傳調控在家養(yǎng)動物健康中的作用，表觀遺傳修飾會動態(tài)調節(jié)病原菌感染引起的機體免疫反應(表1)。在牛乳腺上皮細胞中，低劑量的LPS(1～10 EU·mL-1(endotoxin units per milliliter))引起的DNA高甲基化促進了脂類和氨基酸代謝等基因的表達(如ACACA、ACSS2和S6K1)；而高劑量的LPS(>10 EU·mL-1) 則會引起免疫應答通路中基因的低甲基化[53]。此外，與LPS對牛乳腺上皮細胞的刺激相比，LPS、肽聚糖(peptidoglycan, PGN)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)的共同刺激會顯著降低DNA甲基化水平，導致轉錄組劇烈變化，炎癥反應增強[54]。全基因范圍內CmCGG的DNA甲基化模式與金葡菌誘導的奶牛乳房炎的免疫反應顯著相關，并發(fā)現(xiàn)IL6R、TNF、BTK、IL1R2和TNFSF8等基因可作為奶牛金葡菌乳房炎的潛在表觀遺傳標記[55]。Song等[30]對金葡菌乳房炎奶牛的外周血淋巴細胞進行全基因啟動子區(qū)DNA甲基化模式及修飾差異進行探究，從表觀基因組和分子遺傳方面深入挖掘金葡菌乳房炎抗性候選基因，并在細胞水平進行功能驗證。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳調控方式，有研究表明其可以調節(jié)乳腺健康，Wang等[56]報道CD4基因啟動子區(qū)的超甲基化在臨床乳房炎奶牛中抑制基因的表達。2018年，Zhang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在乳房炎奶牛中，IL6R基因的異常表達是由于DNA甲基化的變化而非基因突變引起。此外，Nckap5和轉座子MTD的甲基化變化與金葡菌乳房炎的發(fā)展有關[57]，而在金葡菌感染的牛乳腺上皮細胞中，整體DNA甲基化水平的下降抑制了DNA轉移酶活性[58]。2020年，Wang等[55]對金葡菌乳房炎奶牛的乳腺組織進行全基因組DNA甲基化分析，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化是金葡菌感染過程中調控基因表達的機制之一，并發(fā)現(xiàn)一系列與免疫相關的差異甲基化基因可能成為金葡菌乳房炎的候選基因。表觀遺傳標記可以用于提高疾病診斷的效率，節(jié)約時間和金錢成本，隨著表觀遺傳修飾與奶牛乳房炎的聯(lián)系越來越多的得到證實，表觀遺傳標記在奶牛金葡菌乳房炎的抗病遺傳育種中的應用價值將會越來越高。

表1 乳房炎中的表觀基因組變化

4 小 結

奶牛乳房炎頻發(fā)給奶牛的健康狀況、生產性能及繁殖性能帶來極為嚴重的損害，近年來，包括乳房炎抗性在內的健康性狀已逐步納入現(xiàn)代奶業(yè)的育種目標。本文總結了近年來有關奶牛乳房炎，特別是金葡菌乳房炎的研究進展，詳細綜述了奶牛乳房炎抗病遺傳育種在轉錄組學和表觀基因組學方面的研究進展。為奶牛金葡菌隱性乳房炎發(fā)病的分子標記及抗病遺傳育種工作，和更好地理解奶牛金葡菌乳房炎發(fā)病的復雜過程提供參考。當然,顯著改善奶牛乳腺健康狀況需要進行更廣泛和深入地研究，且奶牛乳房炎的治理應該本著防大于治的思路和原則，為牧場的生產管理提供便捷。