何彎彎，王健康，丁成偉，郭榮良，吳玉玲，王友霜，趙軼鵬，胡婷婷

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州 221121)

【研究意義】由子囊菌(Magnaportheoryzea)引起的稻瘟病屬于世界性病害，嚴(yán)重威脅水稻產(chǎn)量，導(dǎo)致其每年損失高達(dá)10%～30%[1-2]。因此，稻瘟病已成為影響水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和糧食安全的重要原因之一。目前在中國已有的稻瘟病防治措施中，培育和種植抗稻瘟病水稻品種(系)是最經(jīng)濟(jì)可行和安全有效的防控措施?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前育種家進(jìn)行抗病品種選育，主要基于材料的抗性和表型性狀，具有選育時間較長、效率低、工作量大、操作麻煩等一系列缺點(diǎn)。到目前為止，已鑒定出90多個稻瘟病抗性基因，其中已成功克隆超過39個抗性基因[3-4]。大量的緊密連鎖的或功能分子標(biāo)記被開發(fā)和利用，為快速、精確、系統(tǒng)地檢測供試材料的基因型及高效率聚合抗病基因，選育抗性好綜合性狀優(yōu)的品種(系)奠定基礎(chǔ)。李剛等[5]利用Pib、Pi9、Pi2和Pigm等10個抗性基因的分子標(biāo)記檢測了500多份材料，發(fā)現(xiàn)Pi9、Pib等4個基因?qū)?個強(qiáng)致病小種的抗性較強(qiáng)；曾正明等[6]指出Pi9是四川稻區(qū)的主要抗稻瘟病基因；王寶祥等[7]利用抗性基因Pi-ta、Pib、Pi54和Pikm的分子標(biāo)記對88份黃淮海稻區(qū)品種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Pib和Pi54在品種中分布最廣。在河南水稻育種中，Pi9和Piz-t是主要抗稻瘟病基因，而Pita尚未被充分利用[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組在多年的育種工作中積累了豐富的種質(zhì)資源，但對這些種質(zhì)資源的抗稻瘟病基因的分布情況以及抗性水平并不完全清楚。本研究利用稻瘟病抗性基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的分子標(biāo)記，對搜集到的93份粳稻品種(系)進(jìn)行穗頸瘟田間抗性鑒定及抗性基因檢測分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過分析93份種質(zhì)資源的抗性基因分布情況以及單基因或不同基因組合對穗頸瘟的抗性效應(yīng)，為稻瘟病抗性育種提供可靠的理論依據(jù)和重要的抗病資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種(系)為來自江蘇、山東、河南、天津、浙江等地區(qū)的93份材料。

1.2 稻瘟病抗性鑒定方法

供試菌株為2015-248A3、2016-218C、2015-335D7、139E和2015-80F1，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。人工接種稻瘟病菌混合孢子液[9]，具體操作如下：在水稻孕穗至破口期，采用人工注射接種進(jìn)行穗瘟鑒定，混合孢子液濃度為5×104個/mL，在水稻成熟后調(diào)查接菌結(jié)果。水稻穗頸瘟分級標(biāo)準(zhǔn)詳見DB32T1123—2007水稻品種(系)抗稻瘟病鑒定方法與抗性評價技術(shù)規(guī)程(表1)。

表1 水稻穗頸瘟的調(diào)查分級及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3 稻瘟病抗性基因的檢測

利用抗稻瘟病基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的基因功能標(biāo)記或連鎖標(biāo)記檢測供試材料，引物名稱、序列及擴(kuò)增片段大小見表2。

表2 抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記引物

在水稻3～4葉幼苗期取新鮮葉片，采用CTAB法提取基因組DNA。引物序列由上海擎科生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和程序以及產(chǎn)物檢測方法參照何彎彎[10]及表2中參考文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種所含基因型及其所占比例

利用5個抗性基因的特異性標(biāo)記對93份材料進(jìn)行檢測(表3)。結(jié)果表明，93份材料包含了5個標(biāo)記對應(yīng)的所有基因，其中19份材料含有3個抗性基因，占總數(shù)的20.4%，抗性比例為21.05%；25份材料含有2個抗性基因，占總數(shù)的26.9%，抗性比例為44%；28份材料含有1個抗性基因，占總數(shù)的30.1%，抗性比例為28.57%；21份材料未檢測到抗性基因，占總數(shù)的22.6%，抗性比例為33.33%(表4)。含有1個抗性基因的材料數(shù)量最多，含有2個抗性基因的材料抗性比例最高。攜帶抗性基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的材料分別為49份(52.7%)、16份(17.2%)、8份(8.6%)、31份(33.3%)、31份(33.3%)(圖1)。Pib基因在檢測材料中所占比例最高，Pi2基因在檢測材料中所占比例最低。

表3 93份水稻品種(系)基因型檢測及抗性水平

續(xù)表3 Continued table 3

表4 攜帶不同抗性基因數(shù)的分布頻率及抗性比例

圖1 5個稻瘟病抗病基因在供試材料中的分布頻率Fig.1 Frequency of the five blast resistance genes in varieties(lines)

在93份材料中，基因型所占比例較多的是Pib+Pi54、Pib+Pish、Pib+Pi9+Pi54、Pib+Pi54+Pish，其中Pib+Pi54基因型的材料12份，占總數(shù)的12.9%；Pib+Pi9+Pi54和Pib+Pi54+Pish基因型的材料均是7份，各自占總數(shù)的7.5%；Pib+Pish基因型的材料6份，占總數(shù)的6.5%(表5)。同時未檢測到攜帶4個及以上抗性基因的材料。

表5 不同抗性基因型品種(系)的抗性鑒定結(jié)果

2.2 水稻品種(系)稻瘟病抗性水平

利用江蘇省農(nóng)科院植保所提供的5個稻瘟病生理小種的混合孢子液對93份材料進(jìn)行穗頸瘟抗性鑒定。遲粳預(yù)68、鎮(zhèn)671、和X45689等3份材料表現(xiàn)免疫，占比為3.22%；宏稻59、靈谷糯6號和泗14-26等6份材料表現(xiàn)高抗，占比為6.45%；浙粳20、賽粳988和泗15-301等21份材料表現(xiàn)中抗，占比為22.58%；鹽稻1333、隆粳99和皖墾糯1號等41份材料表現(xiàn)感病，占比為44.08%；皖墾津清、信粳787和金稻20等22份材料表現(xiàn)高感，占比為23.7%(表3)。

2.3 不同抗性單基因及基因組合對穗頸瘟的抗性

為了探明水稻品種(系)所含的抗性基因數(shù)量與抗病性的相關(guān)性，本研究將基因檢測結(jié)果與抗性水平相結(jié)合進(jìn)行分析。只檢測到抗性基因Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish的材料分別為9、2、3、2和12份，抗性比例分別為22.22%、50%、33.33%、100%和16.67%(表5)。Pi9和Pi54的抗性比例都在50%以上，但檢測到含這兩個基因的材料的數(shù)量較少；包含Pish基因的材料最多，但抗性最差。在基因組合中，含有2個抗病基因Pib+Pi9、Pib+Pi2、Pib+Pi54、Pib+Pish和Pi9+Pi54的材料分別有2、2、12、6和1份，抗性比例為50%、100%、25%、66.67%和100%；含有3個抗病基因Pib+Pi9+Pi54的材料有7份，抗性比例分別為42.86%；而Pib+Pi54+Pish的材料也是7份，但抗性比例為14.29%，表明品種攜帶的抗病基因數(shù)量與其抗性水平并不完全正相關(guān)。

3 討 論

稻瘟病嚴(yán)重威脅我國水稻的增產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)，因此，抗稻瘟病品種的培育和種植是防治該病害最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的措施[17-19]。近年來，水稻新品種審定將稻瘟病抗性列為一個關(guān)鍵的衡量指標(biāo)，新審定的品種均要達(dá)到中抗以上水平[5]。傳統(tǒng)的水稻抗病育種主要依靠大量的田間接種鑒定、抗性遺傳以及目標(biāo)性狀篩選，既費(fèi)時費(fèi)力，又易受環(huán)境條件影響，無法適應(yīng)當(dāng)前對抗病選育俺的技術(shù)需求。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用,尤其是對抗性基因的功能性標(biāo)記的開發(fā),明顯提升了抗源篩選和抗性基因鑒定及育種選擇的效率,成為精準(zhǔn)選擇抗性基因的有效途徑[12,20]。

本研究利用5個抗稻瘟病基因?qū)?3份材料進(jìn)行分析研究。Pib、Pi9、Pi2、Pi54和Pish以不同的頻率出現(xiàn)在檢測材料中，其中Pib的檢出率為52.7%，占所有材料中比例最高，但其對稻瘟病抗性的貢獻(xiàn)較小，且聚合其他基因后對品種抗性的提高作用不顯著。而抗病基因Pi9和Pi54對這幾個生理小種的抗性表現(xiàn)較好，但檢出率很低。將抗性基因分布和抗性水平相結(jié)合進(jìn)行分析，結(jié)果表明，攜帶2個抗病基因(Pib+Pi9、Pib+Pi2、Pib+Pish和Pi9+Pi54)的品種(系)具有較強(qiáng)的抗性，但其所占的比例較低。供試材料抗性低的主要原因是含抗病基因占比少或未攜帶有效抗病基因。于此同時，筆者也發(fā)現(xiàn)，未鑒定出抗性基因的材料中也表現(xiàn)出抗病性以及攜帶相同基因或基因型組合的品種間抗性也存在差異，這可能與品種間是否攜帶其他抗性基因有關(guān)系，也可能受病菌侵染時環(huán)境效應(yīng)的影響。

4 結(jié) 論

隨著水稻基因組研究的迅速發(fā)展，在抗稻瘟病育種中，抗性基因可操作性強(qiáng)、效果顯著，育種家應(yīng)注重遺傳背景多樣性，引入新型抗性基因資源，開展主效抗病基因的鑒定及其應(yīng)用，同時聚合多個抗病基因，培育和推廣種植具有廣譜抗性的水稻新品種(系)。本研究僅檢測了5個抗稻瘟病基因，在今后的工作中，仍需對其他稻瘟病抗性基因檢測及抗病性分析評價。