曾 茜，陳 旭，楊 雨，楊仁德，王曉敏

(1.貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，貴陽 550025；2.貴州省農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所，貴陽 550006)

【研究意義】香菇(Lentinulaedodes)又名香蕈、椎茸、花菇，隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)蘑菇綱(Agaricomycetes)蘑菇目(Agaricales)類臍菇科(Omphalotaceae)微香菇屬(Lentinula)，人工栽培起源于我國，是世界第二大生產菇類[1]。香菇種植為勞動密集型農業(yè)，因與農戶利益聯(lián)結緊密，促進了生產規(guī)模的不斷壯大，然而優(yōu)良種質資源儲備匱乏和適栽菌材日益緊缺已成為制約產業(yè)發(fā)展的關鍵因素[2-4]?！厩叭搜芯窟M展】據統(tǒng)計，2018年我國出產香菇1000余萬t，占食用菌總產量1/4以上，遠超于其他種類食用菌[5]。香菇作為家常傳統(tǒng)美食不僅味道鮮美，營養(yǎng)豐富，還兼具保健功能，是一種普遍認可的食藥同源真菌，其藥用價值自古以來就有著述及報道[6-8]。特別是香菇多糖(Lentinan, LNT)已受到世界各國學者的廣泛關注，相繼開展了許多藥理與臨床研究[9]，具有抗腫瘤[10]、抗氧化[11]、免疫調節(jié)[12]等多種生物活性。我國擁有極其豐富的地域野生香菇種質資源，多樣性特征顯著，但缺乏用于地方適栽品種的創(chuàng)新創(chuàng)制研究[13]。如何開發(fā)并利用好野生資源，挖掘優(yōu)質性狀基因，馴化或選育出更多生長適應性強、高產穩(wěn)定、種性優(yōu)良的香菇品種，是推動產業(yè)健康及創(chuàng)新發(fā)展的重要途經[14]。【本研究切入點】通過前期在貴州銅仁梵凈山國家自然保護區(qū)采集篩選獲得的一株野生香菇作為試驗菌株，經馴化已在印江、播州及義龍等地開展栽培小試，均表現出副產物基質適料性強、生產周期短、商品性狀優(yōu)良等特點，具備較好的發(fā)展應用前景。【擬解決的關鍵問題】采用固體和液體培養(yǎng)方式，以菌落直徑和菌絲體干重作為主要考察指標，從營養(yǎng)條件和環(huán)境因素方面研究該香菇菌株菌絲(體)的生物學特性，并基于不同添加物(皇竹草和中藥渣浸煮汁)進一步測定經液體發(fā)酵后其香菇多糖的抗氧化活性，以期為高活力菌種的制備及功能性產品開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集分離自貴州省銅仁市梵凈山國家自然保護區(qū)，菌株編號為黔香篩5號，現保存于貴州省農科院農業(yè)資源與環(huán)境研究所微生物研究室。

1.1.2 試劑 沙氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、(NH4)2SO4、酵母浸膏、硝態(tài)氮、NH4Cl、蛋白胨、皇竹草浸煮汁、中藥渣浸煮汁、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、過硫酸鉀、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮基雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Vc。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同因子對香菇黔香篩5號營養(yǎng)生長的影響 ①碳源。以改良沙氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加20 g/L的蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖作為碳源制成相應的平板培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿直徑90 mm)，以不添加碳源的基礎培養(yǎng)基作對照(CK)。參照文獻[15]的方法利用打孔器取直徑為5 mm的單個活化菌餅接種于各培養(yǎng)基中，置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)8 d，觀察不同處理菌落的生長情況，并采用十字交叉法分別測量菌落直徑。每個處理5次重復(下同)。②氮源。在改良沙氏培養(yǎng)基中分別加入10 g/L (NH4)2SO4、酵母浸膏、硝態(tài)氮、NH4Cl、蛋白胨作為氮源，并以不添加氮源的基礎培養(yǎng)基作對照(CK)。③初始pH。在無菌條件下，利用濃度為0.1%的HCl和NaOH溶液調節(jié)基礎培養(yǎng)基初始pH分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0進行試驗。④溫度。將接種菌餅的基礎培養(yǎng)基平板分別置于10、15、20、25、30和35 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 不同因子對香菇黔香篩5號菌絲體生物量的影響 ①碳源。以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎培養(yǎng)液，分別添加20 g/L的蔗糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖作為碳源，以不加碳源培養(yǎng)液為對照(CK)，裝液量為200 mL/500 mL，再分別以3%(V/V)接種量將種子液接入不同培養(yǎng)液，pH自然，置于24 ℃條件下，150 r/min恒溫搖瓶培養(yǎng)12 d。之后用已烘干稱重的濾紙過濾，并一起置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重稱量，減除干濾紙重量即為菌絲體生物量。每個處理5次重復[16-17](下同)。②氮源。參照1.2.1的氮源設置制備培養(yǎng)液，即以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎培養(yǎng)液，分別加入10 g/L (NH4)2SO4、酵母浸膏、硝態(tài)氮、NH4Cl、蛋白胨作氮源，以基礎培養(yǎng)液作對照(CK)。③初始pH。參照1.2.1的培養(yǎng)液初始pH設置制備培養(yǎng)液。④溫度。參照1.2.1的溫度設置進行培養(yǎng)。⑤接種量。以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎培養(yǎng)液，分別設置1%、2%、3%、4%、5%和6%(V/V)的接種量。

1.2.3 不同添加物對香菇黔香篩5號抗氧化活性的影響 ①菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)。以改良沙氏培養(yǎng)液為基礎培養(yǎng)液，分別添加10%(V/V)的皇竹草浸煮汁、中藥渣浸煮汁及馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液，裝液量為200 mL/500 mL，按3%(V/V)接種香菇種子液，置于24 ℃條件下，150 r/min恒溫搖瓶培養(yǎng)20 d，用濾紙收集菌絲體低溫干燥備用。②胞內多糖制備。參照MA等[18]改良后的水提醇沉法。將菌絲體研磨至粉末狀，加25倍蒸餾水，90 ℃水浴煮提2次混合濾液，旋蒸濃縮至1/4體積，用3倍體積95%乙醇，于4 ℃醇沉24 h，4500 r/min離心5 min，烘干至恒重。利用Sevag法脫蛋白，按等量加入香菇多糖溶液振蕩2次，每次1 h，靜置分層并分離上層溶液，選擇3500 Da透析袋流水透析24 h，經冷凍干燥后獲得皇竹草香菇多糖HLNT、中藥渣香菇多糖ZLNT、PD香菇多糖PLNT。③抗氧化性測定。將上述多糖樣品分別配制為濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的水溶液，以Vc為對照(CK)，測定DPPH、ABTS、羥基自由基的清除率，每個處理3次重復。參照趙詩雨等[11，19]的方法進行測定。

1.3 數據統(tǒng)計與分析

利用SPSS 17.0和Excel 2010對數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同因子處理香菇黔香篩5號菌落的生長

從圖1看出，香菇黔香篩5號在不同碳源、氮源、溫度及初始pH等因子影響下其菌落生長存在差異。

2.1.1 碳源 各處理的菌落直徑為0.2～7.7 cm，表現為葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>乳糖>無碳(CK)>甘露醇。當甘露醇作為碳源時，菌絲幾乎不能生長，而在其他碳源平板培養(yǎng)基上均能生長，但對不同碳源的利用能力存在顯著差異。其中，含葡萄糖培養(yǎng)基上的菌絲生長速度最快，菌落長勢良好，菌絲粗壯濃密，培養(yǎng)10 d后其菌落直徑達7.7 cm，分別為CK和劣勢組乳糖的1.97和1.45倍，顯著高于除蔗糖外的其余處理。其次是含蔗糖培養(yǎng)基上的菌絲，生長旺盛，較潔白濃密，菌落直徑為7.1 cm，顯著高于除麥芽糖外的其余處理。蔗糖、麥芽糖和乳糖差異顯著，均優(yōu)于CK；乳糖培養(yǎng)基中的菌絲較稀疏，且有少量氣生菌絲產生。結果表明，葡萄糖為最佳碳源，蔗糖次之。

2.1.2 氮源 各處理的菌落直徑為0.5～8.6 cm，表現為(NH4)2SO4>蛋白胨>NH4Cl>酵母浸膏>無氮(CK)>硝態(tài)氮。菌株在硝態(tài)氮培養(yǎng)基上無法生長，而其他氮源培養(yǎng)基的菌落生長速度均優(yōu)于CK。其中，硫酸銨和蛋白胨能顯著促進菌絲生長，菌落直徑分別為8.6和7.6 cm，生長速率分別達1.08和0.95 cm/d，菌絲潔白濃密，長勢較好，且以硫酸銨處理菌絲生長的綜合性狀最優(yōu)，其菌落直徑顯著高于其余處理；其次為氯化銨和酵母浸膏處理，菌絲生長相對緩慢，稀疏不整齊，略發(fā)黃。

2.1.3 溫度 香菇黔香篩5號菌株在溫度14～38 ℃時菌絲均可生長，各處理的菌落直徑為2.0～6.7 cm，表現為30 ℃>25 ℃>20 ℃>35 ℃>15 ℃>10 ℃，即隨著培養(yǎng)溫度升高，菌落直徑呈先升后降趨勢。其中，當溫度為30 ℃時菌落直徑達最大；最適溫度為25～30 ℃，對高溫表現出較好的耐受性，培養(yǎng)8 d菌落直徑達6.5～6.7 cm，差異不顯著，但均顯著高于其他溫度條件下的菌落直徑；當溫度<15 ℃或>30 ℃時，菌落長勢緩慢，菌絲較稀疏細弱。

2.1.4 初始pH 各處理的菌落直徑為0.4～5.9 cm，表現為pH 4.0>pH 6.0>pH 8.0>pH 2.0>pH 10.0，即隨著初始酸堿度升高，菌落直徑呈先升后降趨勢。菌株在初始pH為2.0～8.0的培養(yǎng)基上均能生長，pH最適范圍在4.0～6.0，培養(yǎng)8 d后菌落直徑可達5.6～5.9 cm，且菌絲健壯，較濃密。其中，pH 4.0時菌落直徑最大，pH 6.0時其次(5.6 cm)，二者菌落直徑差異不顯著，但均顯著高于其余處理；當pH達10.0其長勢急劇減弱，甚至無法生長。

2.2 不同因子處理香菇黔香篩5號菌絲體的生物量

從圖2看出，不同碳源、氮源、溫度及初始pH等因子影響下香菇黔香篩5號菌株菌絲體的生物量(干重)存在差異。

從左到右接種量依次為1%、2%、3%、4%、5%、6%(V/V)Inoculum sizes were designed by 1, 2, 3, 4, 5 and 6 percent, in order圖2 不同因子處理香菇黔香篩5號菌絲體的生物量(干質量)Fig.2 Biomass(dry weight) of Lentinula edodes treated with different factors

2.2.1 碳源 各處理的菌絲體干重為0.09～1.49 g，表現為蔗糖>葡萄糖>乳糖>麥芽糖>無碳(CK)>甘露醇。香菇黔香篩5號仍無法利用液體培養(yǎng)基中的甘露醇，與CK相比，其余碳源處理均能顯著提高該菌株菌絲體生物量的積累。其中，以蔗糖處理黔香篩5號菌株的菌絲體生長情況最佳，碳源利用率高，產量較好，其菌絲體干重為CK的3.17倍，顯著高于其余處理，且在此碳源條件下的菌絲球數量相對較多、均勻致密、大小適宜，培養(yǎng)液較澄清。葡萄糖、乳糖和麥芽糖處理次之，菌絲體產量為CK的2.60～2.70倍，均勻度略差，三者間差異不顯著，葡萄糖和乳糖處理的菌絲體干重顯著高于除麥芽糖外的其余處理，麥芽糖處理的菌絲體干重顯著高于無碳和甘露醇處理。

2.2.2 氮源 各處理的菌絲體干重為0.07～1.65 g，表現為(NH4)2SO4>蛋白胨>酵母浸膏>NH4Cl>無氮(CK)>硝態(tài)氮。硝態(tài)氮處理的液體培養(yǎng)基無法被黔香篩5號菌株吸收，其他處理的菌絲體干重均顯著高于CK。其中，添加硫酸銨和蛋白胨的培養(yǎng)基效果較好，菌絲體干重分別為1.65和1.62 g，二者差異不顯著，但均顯著高于其余處理；且兩者的菌絲球在數量、大小、均勻度和懸浮性等性狀上差異不明顯，硫酸銨處理菌絲球輪廓更清晰，相互分明。酵母浸膏和氯化銨處理其次，培養(yǎng)液澄清，菌絲體干重分別為1.48和1.39 g，二者差異不顯著，但均顯著高于無氮(CK)和硝態(tài)氮。

2.2.3 溫度 各處理的菌絲體干重為0.33～1.45 g，表現為25 ℃>30 ℃>35 ℃>20 ℃>15 ℃>10 ℃，即隨著培養(yǎng)溫度升高，菌絲體生物量呈先升后降趨勢。不同培養(yǎng)溫度處理黔香篩5號菌株的菌絲體生長情況和生物量積累存在顯著性差異。當溫度為25 ℃時，菌絲體干重達最大，為1.45 g，該條件下菌絲球性狀均優(yōu)于其他處理，且培養(yǎng)液較澄清。隨著溫度的升高或下降，菌絲體干重均逐漸降低，而當溫度高于35 ℃或低于20 ℃時，菌絲球生長緩慢并受到抑制，少部分相互粘連，培養(yǎng)液較渾濁。

2.2.4 接種量 各處理的菌絲體干重為0.63～0.94 g，表現為4%>3%>1%>2%>6%>5%，不同接種量處理黔香篩5號菌株的菌絲球性狀及干重存在一定差異。其中，接種量3%(V/V)和4%菌絲體生物量積累均較好，干重分別達0.91和0.94 g，二者差異不顯著，但前者菌絲球的均勻度、懸浮性及大小形態(tài)均優(yōu)于后者。接種量1%和2%處理其次，而當接種量為1%時，菌絲球性狀表現為數量少、形態(tài)大，且相互粘連，難以分生擴增。接種量6%和5%處理的菌絲體生物量最低，二者差異不顯著，但均顯著低于除2%處理外的其余處理。

2.2.5 初始pH 各處理的菌絲體干重為0.21～1.16 g，表現為pH 6.0>pH 8.0>pH 4.0>pH 10.0>pH 2.0，即隨著培養(yǎng)溫度升高，菌絲體干重呈先升后降趨勢，各處理間差異顯著。液體培養(yǎng)條件下黔香篩5號菌絲體在pH 4.0～10.0均能較好生長，菌絲體干重達0.6 g以上。其中，當初始pH為6.0時，菌絲體生物量積累最多，達1.16 g，顯著高于其余處理，菌絲球相對密集均勻，懸浮性較好，互相分明。pH 8.0處理其次，干重為1.01 g；當pH為2.0時，菌絲體生長受到明顯抑制。

2.3 不同添加物處理香菇黔香篩5號的抗氧化活性

從圖3看出，不同添加物處理黔香篩5號產香菇多糖的抗氧化活性存在差異。

圖3 不同發(fā)酵處理產香菇多糖對DPPH自由基、羥基自由基及ABTS自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of lentinan polysaccharide produced by different liquid fermentation to DPPH radical,hydroxyl radical and ABTS radical

2.3.1 清除DPPH自由基 皇竹草(HLNT)、中藥渣(ZLNT)浸煮汁及馬鈴薯葡萄糖(PLNT)3種添加物處理的香菇多糖對DPPH自由基清除能力與濃度呈正相關，濃度為0.2～1.0 mg/mL清除率增長較快，而濃度超過1.0 mg/mL后HLNT和PLNT處理的清除能力逐漸趨于平緩，而ZLNT處理多糖濃度大于3.0 mg/mL時，其活性較其他處理呈現出較好的增強趨勢。在濃度達5.0 mg/mL時，ZLNT、HLNT和PLNT處理對DPPH自由基的清除率分別為86.7%、78.1%和66.0%，均低于Vc(CK)。與HLNT和PLNT相比，ZLNT對DPPH自由基具有更強的清除作用，且最大值為Vc(CK)的0.89倍。

2.3.2 清除羥基自由基 不同處理香菇多糖隨著濃度增加，其清除羥基自由基能力也逐漸增強。當香菇多糖濃度為5.0 mg/mL時，ZLNT、PLNT和HLNT處理對羥基自由基的清除率分別為73.5%、63.7%和59.8%，但均低于Vc(CK)。其中，ZLNT對羥基自由基的清除作用明顯強于PLNT和HLNT處理，而PLNT和HLNT處理間差異不明顯。

2.3.3 清除ABTS自由基 多糖濃度直接影響3個處理對于ABTS自由基的清除能力，相較Vc(CK)，ZLNT和PLNT處理清除率隨濃度增長緩慢，且差異不明顯。當香菇多糖濃度達5.0 mg/mL時，HLNT、ZLNT和PLNT處理對ABTS自由基的清除率依次為75.5%、57.8%及52.1%，均低于Vc(CK)，但HLNT清除ABTS自由基的效果明顯高于ZLNT和PLNT處理。

3 討 論

隨著香菇產業(yè)的快速發(fā)展，種植規(guī)模不斷壯大，產銷競爭日益激烈，菌種作為食用菌生產上的重要基礎資料，市場需求已逐漸由價格轉變?yōu)閮?yōu)質、穩(wěn)定及適應性強等品種特性。而目前國內香菇主栽品種為野生資源譜系中的較小分支，遺傳背景狹窄，缺乏對優(yōu)良種質資源的挖掘與利用，導致香菇新品種選育及良種繁育工作相對滯后[20]。研究發(fā)現，我國是世界上野生香菇種質資源最豐富、遺傳多樣性最高的地區(qū)，地理環(huán)境和氣候生態(tài)多變促使各譜系間差異頻繁，且西南和西北區(qū)域為香菇多樣性分布中心，這些都為優(yōu)勢品種創(chuàng)制提供了有利條件[21-23]。因此，野生香菇資源的收集評價及開發(fā)應用具有深遠的現實意義。

馴化或選育出的優(yōu)良食用菌品種在應用于生產前，必須全面掌握其生物學信息及種性特點等要素，盡可能預防和減少不必要損失[24]。本研究已初步篩選出適宜于香菇黔香篩5號菌絲生長的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件，可為后續(xù)進一步探明各因素對其生長發(fā)育、遺傳規(guī)律及基因互作影響提供參考。錢可晴等[25]通過對野生皺木耳開展生物學特性研究及本地馴化栽培，獲得出菇性狀穩(wěn)定的木耳屬新品種鹿肚耳菌株，為工廠化栽培提供了適宜種質資源，也充分說明野生資源是食用菌品種開發(fā)與創(chuàng)新利用的重要來源。并且，隨著菌林矛盾的日益凸顯，決定了利用農林副產物替代闊葉樹木屑作為香菇栽培原料將成為主要發(fā)展趨勢，如何開發(fā)適宜特殊營養(yǎng)源和特定地理區(qū)域的優(yōu)勢品種，或挖掘出更多功能基因是重要的育種方向，也是產業(yè)發(fā)展的根本動力。另外，研究發(fā)現不同栽培基質條件下獲得的食用菌代謝產物也會存在一定差異，部分表現為可誘導或抑制某些特定代謝產物產生[26]。香菇黔香篩5號菌株具有較好的副產物適料性，添加其浸煮汁可有效促進發(fā)酵物的抗氧化活性，與朱伶俐、吳鴻雪等[27-28]利用不同基質栽培猴頭菇和靈芝，改善代謝產物體外免疫及抗腫瘤活性結果相似，表明篩選并改良基質配方亦可作為食藥用菌活性產物富集及產品研發(fā)的新途徑[29]。

4 結 論

研究結果表明，不同碳氮源、培養(yǎng)溫度及pH等因素對香菇黔香篩5號菌株的菌絲生長存在顯著影響。其中，母種培養(yǎng)基的最佳碳氮源分別為葡萄糖和硫酸銨，最適培養(yǎng)溫度25～30 ℃，初始pH在偏酸性的4.0～6.0為宜。液體培養(yǎng)基中以蔗糖作為碳源、硫酸銨或蛋白胨作為氮源時更有利于菌絲體生物量的積累，且培養(yǎng)溫度25 ℃、接種量3%(V/V)及pH 6.0為適宜條件。值得注意的是，在2種菌絲培養(yǎng)方式下，供試菌株均無法利用甘露醇和硝態(tài)氮作為營養(yǎng)物質。并且，香菇黔香篩5號液體發(fā)酵添加皇竹草(HLNT)和中藥渣(ZLNT)浸煮汁均能提高多糖的抗氧化活性，ZLNT對DPPH及羥基自由基具有顯著清除作用，當濃度為5 mg/mL時，清除率分別達86.7%和73.5%；HLNT則是對ABTS自由基清除效果較好，相同濃度下清除率為75.5%。