陳 曙，張 彧，陳 卓，金 輝

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091；2. 農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091)

【研究意義】泛素26S-蛋白酶體途徑(UPP)作為生物體內(nèi)蛋白翻譯后的重要修飾途徑之一，由泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3及26S蛋白酶體組成，共同調(diào)控生物體中蛋白的修飾和降解過程，是真核生物生命活動中最重要的調(diào)控機制之一。在UPP中，E3泛素連接酶負責對靶蛋白特異性識別，并進行泛素化修飾[1]。U-box基因家族作為泛素連接酶E3大家族中一類，其U-box結構域決定了U-box E3基因的活性。研究表明，該部位發(fā)生突變會導致E3連接酶活性變?nèi)趸蛘邌适2]，致使其在維持細胞分裂、信號轉導、逆境脅迫、生長發(fā)育等多個方面的生物學功能紊亂或者徹底喪失[3-6]。因此鑒定玉米泛素U-box基因家族成員，研究基因功能對深入了解玉米生長發(fā)育和逆境脅迫等作用機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】U-box泛素連接酶最早在酵母UFD2蛋白中發(fā)現(xiàn)，也是最早發(fā)現(xiàn)的E3泛素連接酶[7]。U-box結構域由大約70個氨基酸組成，在真核生物中高度保守，在不同的植物基因組中數(shù)量差異大，這表明U-box在植物的生長發(fā)育過程中具有特異性調(diào)控[8]。U-box蛋白與RING蛋白結構具有高度的相似性，兩者都具有β-β-a-β折疊結構，氨基酸序列類似，且促進E2結合酶與泛素分子相結合的部位相同。不同之處在于U-box的結構域是通過靜電之間的相互作用形成，通過疏水核心基團代替結構金屬離子，較RING finger結構域而言更加穩(wěn)定和保守[9-10]。有別于RING finger結構域中通過金屬離子的作用螯合殘基，擬南芥PUB蛋白(Arabidopsis thaliana plant U-box, 簡稱At PUB)AtPUB14是擬南芥中最早鑒定出來含有U-box結構域的蛋白，含有β-β-a-β折疊結構以及鋅指結構，其2個疏水結構基團上的殘基構成特殊的E3結合位點，并通過氫鍵之間的相互作用使U-box結構穩(wěn)定[11]。目前為止，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)64個含有U-box結構域的蛋白[12]，在水稻中，鑒定出了77個[13]，蒺藜苜蓿中有41個[14]，番茄中鑒定出了56個[15]。PUB蛋白參與植物生長發(fā)育過程以及對環(huán)境脅迫的防御作用。研究表明，擬南芥中AtPUB17基因參與了植物細胞凋亡過程，對植物生長發(fā)育有著正調(diào)控作用[16]。在煙草和油菜中分別存在其同源基因ACRE276和ARC1，其中ACRE276與AtPUB17的功能具有同源性，而ARC1與AtPUB17功能則并不相同，ARC1含有ARM結構，具有E3連接酶活性，對油菜的自交不親和狀態(tài)進行負調(diào)控作用[17-18]。在干旱脅迫條件下，水稻OsPUB41基因通過介導OsUBC25后被激活，并與OsCLC6相互作用，并發(fā)揮負調(diào)控作用[19]。馬鈴薯的PHOR1基因在反義沉默后，植株長勢變緩且變得矮小，對外源GA表現(xiàn)不敏感，響應能力受損；而將PHOR1基因過表達后發(fā)現(xiàn)，植株變得對外源GA敏感，對GA合成抑制劑的抗性增強[20]。U-box蛋白在植物對抗環(huán)境脅迫中也發(fā)揮著重要作用。CHIP蛋白作為U-box家族中一類具有輔助分子伴侶和E3活性的蛋白，在植物遭遇高溫、強光燈不利因素時能提高植物的抗逆性[21]。植物類病變(lesion mimics)突變體是一類在沒有病原物入侵時就能自發(fā)產(chǎn)生壞死斑的突變體,這類突變往往使植株增強抗病。水稻SPL11突變體植株在無病原體侵染的情況下發(fā)生系統(tǒng)性的自主死亡過程，葉片自發(fā)出現(xiàn)病斑，并且植株對一些真菌和細菌性病原體的抗性增強，如稻瘟病菌和白葉枯病菌[22]。玉米是全球主要的經(jīng)濟糧食作物之一，在玉米的生長發(fā)育過程中泛素化過程具有重要的意義，其過程順利進行與否直接影響玉米植株的生長，同時也影響產(chǎn)量和品質[23]?！颈狙芯壳腥朦c】目前已完成玉米全基因組的測序工作，為在全基因組范圍內(nèi)對玉米各基因家族進行基因結構分析和功能預測提供了數(shù)據(jù)支持。但迄今為止，尚未見有對玉米U-box基因家族的研究和報導?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用生物信息學方法，通過對玉米全基因組進行分析，鑒定出U-box基因家族中的基因類型、數(shù)目以及對基因的結構、理化性質、染色體定位、啟動子功能和基因的表達模式進行分析等，以期為后續(xù)深入開展U-box基因功能的相關研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

玉米(ZeamaysL.)全基因組數(shù)據(jù)來源于Maize Genetics And Genomics Database數(shù)據(jù)庫(https://www.maizegdb.org/)及Ensembl Plants基因組數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)。擬南芥U-box基因家族基因和蛋白序列下載于擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis)，水稻U-box基因家族基因序列下載于水稻全基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 玉米U-box基因序列的獲取和家族成員鑒定 以目前擬南芥中鑒定出的64個U-box基因家族成員的序列對Ensembl Plants基因組數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)進行基因搜索和序列比對，查找出玉米基因組中所有U-box基因的CDS和蛋白序列。所得結果利用SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)在線分析軟件進一步進行結構分析，剔除無典型U-box結構域的序列，最終得到玉米基因組中所有U-box基因。

1.2.2 玉米U-box家族基因的結構分析 根據(jù)已獲得的玉米U-box基因的基因序列和CDS序列，利用在線工具GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)分析基因結構，明確內(nèi)含子和外顯子的組成數(shù)量。并通過Mapinspect工具標注每個U-box基因在染色體上的位置，了解U-box基因家族中所有U-box基因在基因組中的分布情況。

1.2.3 玉米U-box基因氨基酸序列屬性分析 利用ExPASy Proteomics Server(http://www.expasy.org/ proteomics )對所有玉米U-box基因進行蛋白分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質分析預測。利用Plant-mPLocServer(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)在線工具分析U-box蛋白的亞細胞定位。二級結構分析利用SOPMA在線程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html)。

1.2.4 玉米U-box基因序列比對及系統(tǒng)進化樹的構建 利用ClustalW工具對水稻、擬南芥、玉米基因組中所有U-box蛋白序列進行比對，結合序列比對結果，利用MEGA 6軟件采用鄰接法(neighbor joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。參數(shù)設置：替換模型設置為“Poisson model”，缺口設置為“Pairwise deletion”,校驗參數(shù)Bootstrap method 取值為1000。

1.2.5 玉米U-box基因啟動子功能分析 獲取玉米U-box家族基因上游約1500 bp序列，將序列導入在線工具Plant CARE(http:/ /bioinformatics.Psb.Ugent.be /webtools /plantcare /html/)中，歸類基因啟動子上的作用元件，預測分析各基因啟動子所含基序種類和功能。

1.2.6 玉米U-box家族基因在不同組織中的表達模式分析 通過Ensembl Plants (http:/ /plantsa.ensembl．org /index．html) 網(wǎng)站，根據(jù)基因登錄號，搜索下載玉米76個U-box基因在胚、胚囊、胚乳、胚珠、子房、根、葉片、穗、花粉等其它共14個不同組織部位的表達情況。利用百邁客在線軟件( http:/ /console．Biocloud.net /static /index.html)繪制基因表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 玉米U-box家族基因的獲取和理化性質分析

通過BLAST比對以及搜索，剔除無典型U-box結構域的序列，最終從玉米全基因組中共鑒定出76個含有U-box結構域的基因，如圖1所示。ZmPUB基因在玉米基因組1～10號染色體上均有覆蓋，每條染色體ZmPUB基因數(shù)量從2～12個不等，其中1號染色體上最多，為12個，8號染色體上僅含2個。部分U-box基因較為特殊，在染色體上緊密排列形成了基因簇。另外有兩個基因在染色體上無法定位，分別為ZmPUB1和ZmPUB2。表1結果顯示，玉米U-box基因中分子量最大的蛋白ZmPUB22含有氨基酸殘基數(shù)目為1353，分子量大小為144.72 kD，最小的U-box蛋白為ZmPUB57，含有94個氨基酸殘基，分子量僅10.76 kD。對等電點進行分析發(fā)現(xiàn)，最小的U-box蛋白為ZmPUB34，等電點為4.86，顯酸性。不穩(wěn)定指數(shù)分析顯示，78個ZmPUB基因中，不穩(wěn)定指數(shù)最小的為ZmPUB14，最大的為ZmPUB59，其中不穩(wěn)定指數(shù)小于40蛋白的有13個，蛋白穩(wěn)定性較好，其余65個ZmPUB蛋白均為不穩(wěn)定蛋白。

圖1 玉米U-box家族基因在染色體上的位置分布Fig.1 The distribution of maize U-box family genes on chromosomes

表1 玉米U-box家族基因理化性質分析

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 玉米U-box基因家族系統(tǒng)進化及基因結構分析

利用上述篩選出的76個ZmPUB蛋白序列，與62個擬南芥PUB蛋白以及77個水稻PUB蛋白組成數(shù)據(jù)矩陣，利用MEGA 6進行系統(tǒng)進化分析(圖2)，結果顯示玉米、水稻、擬南芥三大U-box基因家族可分為9個亞家族，即PUBⅠ～PUBⅨ。3個作物中各亞家族U-box基因數(shù)量差異明顯，亞家族Ⅶ中水稻成員數(shù)目最多，為32個，占水稻U-box基因總數(shù)的41.6%，在亞家族Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ中則數(shù)量較少，分別為0、0、2和1。擬南芥在亞家族Ⅶ中數(shù)目為17個，占水稻U-box基因總數(shù)的27.4%，數(shù)量最多，在亞家族Ⅳ中數(shù)目為零，數(shù)量最少。玉米在各亞家族中的成員數(shù)量分布為2～23個，其中在亞家族Ⅱ中為23個，占玉米U-box基因總數(shù)的30.3%，在亞家族Ⅳ和Ⅴ中數(shù)目最少，均為2個。

圖2 玉米、擬南芥以及水稻U-box家族基因系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of U-box family genes in maize, arabidopsis and rice

亞家族Ⅳ中僅含有2個玉米U-box基因，分別為ZmPUB41和ZmPUB53，不含有水稻和擬南芥成員。表明玉米在歷史進化過程中可能發(fā)生了多次家族基因擴增現(xiàn)象，且ZmPUB41和ZmPUB53在經(jīng)過片段復制后發(fā)生了快速變異。利用在線軟件GSDS對玉米U-box基因進行結構分析，并繪制基因結構示意(圖3)，結果顯示玉米U-box家族76個成員中共有28個基因無內(nèi)含子，僅含有1個外顯子，占玉米U-box基因總數(shù)的36.8%，表明這些基因進化可能源于轉座子機制。內(nèi)含子最多的為ZmPUB39，含有17個，其余基因分別含有內(nèi)含子數(shù)目為1～17個不等。

圖3 玉米U-box家族基因結構分析Fig.3 The genetic structure analysis of maize U-box family

2.3 玉米U-box基因啟動子功能預測和分析

考慮到玉米U-box基因家族較大，成員數(shù)較多，筆者根據(jù)系統(tǒng)進化分析結果，從亞家族PUB1～PUB9中每個亞家族選取1～2個成員，總計14個基因作為分析對象,具體基因編號見表2。表2統(tǒng)計結果顯示，受檢基因所含功能元件主要包括植物激素響應元件、逆境脅迫應答元件、光反應元件和周期性調(diào)控相關元件4類。所有基因中所含光反應元件最多，說明玉米U-box基因參與了植株光合作用或相關代謝活動。在植物激素調(diào)控方面，主要分為ABA、MeJA、IAA、GA、乙烯、水楊酸6類，各受檢基因所含元件數(shù)量差異明顯。14個受檢基因中，部分基因不含乙烯調(diào)控元件，其余基因所含數(shù)量為1～4個，含量較少，說明各基因在參與乙烯調(diào)控中可能不作為主效基因發(fā)揮作用。其余基因如ZmPUB35含有ABA調(diào)控元件最多，ZmPUB1含有MeJA調(diào)控元件最多，ZmPUB41含有IAA和水楊酸調(diào)控元件最多，ZmPUB33含有GA調(diào)控元件最多。同理在逆境脅迫調(diào)控中，對應干旱脅迫、厭氧應答、低溫調(diào)控中所含元件數(shù)量最多的基因分別是ZmPUB2、ZmPUB1和ZmPUB73，在周期性調(diào)控相關元件中ZmPUB75所含元件最多，這些現(xiàn)象說明不同亞家族成員間各基因主效功能不一樣，表明在玉米進化過程中，U-box家族基因在復制、快速擴增的同時也發(fā)生了大量的變異，使玉米U-box家族基因功能更加多樣化。

表2 玉米U-box基因啟動子功能元件分析

2.4 玉米U-box基因在不同組織的表達分析

利用搜索出的64個玉米U-box基因表達數(shù)據(jù)(12個基因未能搜索出相關數(shù)據(jù))，制作基因表達熱圖(圖4)?；虮磉_聚類分析結果顯示，玉米U-box基因在不同組織中表達差異較大，各U-box基因表達差異明顯。ZmPUB3、ZmPUB6、ZmPUB7、ZmPUB11、ZmPUB22、ZmPUB29、ZmPUB50、ZmPUB52在種子的發(fā)育以及組成器官如胚、胚囊、胚乳、珠心、糊粉層、子房、胚珠中大量表達，表明這些基因可能參與了種子的形成以及萌發(fā)等生理活動過程。部分基因如ZmPUB19、ZmPUB21、ZmPUB26、ZmPUB49等在被檢測組織中均未見表達，說明未參與上述器官相關生命活動。ZmPUB12、ZmPUB18、ZmPUB30、ZmPUB40、ZmPUB75在花粉中表達量較高，而在其它被檢測組織中均未見表達，說明這5個基因功能特異性較強，可能在玉米花粉受精過程中發(fā)揮了重要作用。

T1：維管束鞘;T2：胚;T3：胚囊;T4：胚乳;T5：花絲;T6：葉片;T7：珠心;T8：糊粉層;T9：子房;T10：胚珠;T11：花粉;T12：根;T13：雄穗;T14：營養(yǎng)分生組織T1:Vascular sheath;T2:Embryo;T3:Embryo sac;T4:Endosperm;T5:Filigree;T6:Leaf;T7:Nucellus;T8:Aleurone layer;T9：Ovary;T10：Ovule;T11：Pollen;T12:Root;T13: Tassel;T14:Vegetative meristem圖4 玉米U-box家族基因在不同組織中的表達分析Fig.4 Expression analysis of maize U-box family genes in different tissues

3 討 論

U-box基因家族是泛素連接酶E3家族中的主要家族之一，在植物的生長發(fā)育及逆境脅迫應答中發(fā)揮了重要的作用，包括人類在內(nèi)，U-box蛋白幾乎存在于所有的真核生物中[2]。U-box蛋白最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)，隨后相繼在擬南芥、水稻、番茄、柑橘、雷蒙德氏棉、苜蓿等作物中被鑒定報導。隨著玉米全基因組測序工作的全面完成，大量的玉米基因家族功能被研究和驗證，極大的推進了玉米基礎研究領域的發(fā)展，生物信息學作為研究植物基因功能、調(diào)控模式以及系統(tǒng)進化關系等功能的重要工具被廣泛使用。目前玉米E1、E2家族基因已經(jīng)相繼被鑒定出來，而E3家族包括多亞基家族cullin-RING (CRLs)和單亞基家族如HECT(homologous to E6-AP COOH-Terminus) 、RING (really interesting new gene) 、U-box 共4類家族，目前尚未見有對U-box基因家族的系統(tǒng)性報導。本研究從玉米全基因組中鑒定出了76個U-box基因成員，與水稻U-box成員數(shù)相似，比擬南芥、苜蓿和番茄中U-box成員數(shù)目多，表明不同物種的U-box成員數(shù)量存在差異。部分玉米U-box基因染色體上排列緊密，形成了數(shù)目較多的基因簇，加強了基因功能的表達。玉米不同U-box亞家族成員間所含氨基酸數(shù)目、等電點、分子量、外顯子數(shù)量以及不穩(wěn)定指數(shù)差異較大，說明其理化性質有較大不同，而同一亞家族間各成員上述各理化指標相似度較高，暗示其理化性質相似?；騼?nèi)含子/外顯子排列特性對基因功能具有重大影響[24]?；蚪Y構及系統(tǒng)進化分析結果顯示，同一個亞家族中，處在不同分支的U-box基因在外顯子、內(nèi)含子數(shù)目以及蛋白序列長度等方面均有差異，但同屬一個分支的旁系同源基因之間如ZmPUB75與ZmPUB18、ZmPUB29與ZmPUB50、ZmPUB4與ZmPUB70及ZmPUB35與ZmPUB67等理化性質及基因結構高度相似。說明玉米泛素連接酶U-box家族基因在進化過程中具有高度保守性，但同時在漫長進化過程中使得基因功能多樣化，以適應環(huán)境變遷和種群延續(xù)。

啟動子作為位于基因5′端上游的DNA序列結構，控制著基因轉錄的起始以及表達程度，繼而決定了編碼特異性蛋白的功能。玉米U-box基因在植物的各種生命活動如生長發(fā)育、逆境脅迫、信號轉導以及細胞周期調(diào)控等方面起著非常重要的作用[3-6]。進行啟動子結構和基序分析對研究基因的功能具有重要的作用。本研究通過對14個玉米U-box基因啟動子功能預測分析發(fā)現(xiàn)各基因均含有大量光反應元件，說明U-box基因可能參與了植物光合作用調(diào)控途徑。在所有受檢基因中均發(fā)現(xiàn)有生長素、脫落酸以及茉莉酸甲酯順式作用元件，暗示U-box基因可能參與了玉米植株的生長發(fā)育、果穗的成熟以及病蟲害應激性防御過程。在逆境脅迫方面，干旱響應、厭氧應答和低溫調(diào)控三類元件在玉米U-box基因中均存在，說明U-box基因在植株應對這些逆境脅迫中均發(fā)揮了相應作用。

進行基因組織表達模式分析是了解基因生物學功能的重要方法之一。本研究中，對玉米14個不同組織部位進行基因表達分析發(fā)現(xiàn)，不同U-box基因間組織差異性表達明顯?；虮磉_熱圖顯示，部分基因表達不具有特異性，如ZmPUB3、ZmPUB6、ZmPUB7、ZmPUB22、ZmPUB29、ZmPUB50除在花粉中表達量較低外，在其它13個受檢組織中均有較高表達量。而部分基因表達特異性強，如ZmPUB12、ZmPUB18、ZmPUB30、ZmPUB40、ZmPUB75僅在花粉中有較高表達量，在其它組織中幾乎不表達。這些現(xiàn)象說明玉米U-box家族基因功能具有互補性，揭示了U-box家族在進化過程中，在基因復制擴增的過程中也逐漸產(chǎn)生了新的變異，使得整個基因家族功能更加全面完善。基因在特殊器官中高水平表達意味著其在相關過程中發(fā)揮關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)柑橘CcPUB10基因能夠調(diào)控柑橘葉、花、莖和果的生長發(fā)育[25]。蘋果MdPUB24在葉片中高度表達，且對外源ABA、NaCl和低溫脅迫呈負調(diào)控反應[26]。本研究中，部分玉米U-box基因在種子相關器官中大量表達，暗示了其可能參與了種子的形成以及萌發(fā)等生理活動過程，但具體作用機制還不清楚，需后續(xù)對相關基因的功能進行進一步研究和驗證。

4 結 論

本研究依據(jù)玉米全基因組數(shù)據(jù)庫，從中鑒定出了76個玉米U-box家族成員,經(jīng)篩選、鑒定后其蛋白均含有U-box保守結構域。各成員含有內(nèi)含子數(shù)目差異較大，部分基因內(nèi)含子數(shù)量為零。啟動子功能預測分析發(fā)現(xiàn)，U-box基因可能參與了玉米光合作用、激素應答和逆境脅迫應答反應，且響應程度不同，顯示出各成員間基因功能特異性明顯?；虮磉_模式分析結果顯示玉米U-box基因表達具有組織特異性。