孫星　王文文　衛(wèi)純潔　路雙　鄭志仁　張輝　徐晨曦　汪沖

摘? 要： γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動物、植物、微生物中，并作為信號分子參與體內(nèi)多種代謝途徑和過程.近年研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸能夠有效降低高血壓患者的血壓，且可以通過長時間的飲食攝入起到預(yù)防高血壓的作用.番茄（）作為全世界產(chǎn)量最多的蔬菜之一，在日常飲食中深受消費(fèi)者的喜愛.此外，它還是水果和蔬菜中GABA含量最多的作物之一.然而番茄中的GABA主要以游離氨基酸的形式存在，在果實(shí)綠熟階段大量積累，而在果實(shí)成熟階段含量則大大降低.目前，通過雜交育種、誘變育種及基因編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)番茄果實(shí)成熟階段GABA含量的增加.該文對近年來在番茄GABA育種中的主要研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)分析，并對基因編輯技術(shù)在番茄中的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景進(jìn)行了探討，對如何通過基因編輯技術(shù)更好地提高番茄GABA含量進(jìn)行了展望.

關(guān)鍵詞： γ-氨基丁酸（GABA）; 降血壓; 基因編輯

中圖分類號： Q 94.337??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2022）01-0087-07

γ-aminobutyric acid （GABA） is a kind of natural non-protein amino acid， which widely exists in animals， plants and microorganisms. GABA participates in various metabolic pathways and processes as signal molecules . Recent studies have found that GABA could effectively reduce blood pressure of patients with hypertension and can prevent hypertension through long-term dietary intake. As one of the most produced vegetables in the world， tomatoe （） is favored by consumers in their daily diet. In addition， it is also one of the crops with the highest GABA content in fruits and vegetables. However， GABA in tomato mainly exists in free amino acids form， which is greatly accumulated at green fruit stage and greatly reduced at fruit ripening stage. At present， the GABA content in tomato fruit at ripening stage has been increased by hybridization breeding， mutagenesis breeding and gene editing. This paper summarized the researches on tomato GABA breeding in recent years， and discussed the application status and prospect of gene editing technology in tomato. We also put forward the prospect of how to proving tomato GABA content by gene editing technology in the future.

γ-aminobutyric acid （GABA）; lower blood pressure; gene editing

0? 引 言

生活方式與人體的健康息息相關(guān).不健康的生活方式往往是很多疾病的誘因，如抽煙、酗酒、熬夜、精神壓力、久坐不動、高鹽飲食等都是引起高血壓、高血脂、糖尿病等疾病的病因.據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，心血管疾病致亡人數(shù)約占全球總死亡人數(shù)的16%，并自2000年以來逐年上升. 中風(fēng)則是第二大死亡原因（占世界總死亡人數(shù)的11%）.高血壓是引起心臟病和中風(fēng)的一個危險因素. 據(jù)《全球高血壓流行趨勢綜合分析研究報告》統(tǒng)計，1990—2020年，30～79歲的高血壓成年人人數(shù)從6.5億人增加到12.8億人.

大量人體內(nèi)外研究結(jié)果表明，γ-氨基丁酸（GABA）是一種具有生物活性和功能的有益化合物，能夠有效降低患者的血壓.人體內(nèi)的GABA含量有限，從食物中攝取是補(bǔ)充GABA的重要方式.植物組織中GABA的含量較低，通常在0.3～32.5 μmol?g之間，不能滿足人體的生理需求，番茄（）富含多種維生素、礦物質(zhì)、番茄紅素、胡蘿卜素、生物堿等營養(yǎng)元素，同時也是全球高產(chǎn)量，高消耗的經(jīng)濟(jì)作物之一，其本身就具有較高的GABA含量.然而使成熟番茄中積累更多的GABA的嘗試受阻，傳統(tǒng)的雜交育種受種質(zhì)資源、時間、人力等限制，甚至還會引入一些不利性狀.近些年，隨著基因編輯技術(shù)的問世，植物改良的腳步大大加快.相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因育種，基因編輯技術(shù)在靶向修飾特定基因后，又能通過自交或雜交剔除外源基因以消除轉(zhuǎn)基因安全顧慮，因此在番茄和其他作物的育種中具有廣泛應(yīng)用前景.基于番茄果實(shí)中GABA含量在果實(shí)發(fā)育不同時期變化劇烈，從開花到綠熟（MG）期GABA水平增加，成熟期迅速下降的特點(diǎn)，采用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的單基因、多基因編輯已經(jīng)成功地使番茄中的GABA含量得以提高.本文重點(diǎn)介紹了番茄中GABA的代謝機(jī)制和利用基因編輯技術(shù)已經(jīng)取得的研究進(jìn)展，并對通過基因編輯技術(shù)提高番茄GABA含量的育種工作進(jìn)行了展望.

1? 植物中的GABA

GABA是一種天然非蛋白質(zhì)氨基酸，分子式為CHNO，廣泛存在于動物、植物、微生物中并作為信號分子參與體內(nèi)多種代謝途徑和過程，具有重要的生理學(xué)意義（圖1）.在人體中GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì).有動物實(shí)驗(yàn)報道，對患有自發(fā)性高血壓的大鼠給予外源GABA，能使其血壓顯著降低.同樣有研究證實(shí)，通過在飲食中對患有中高度高血壓癥的病人給予GABA治療比藥物治療更有助于減輕癥狀.此外GABA還能起到誘導(dǎo)放松、減輕心理壓力、縮短睡眠潛伏期等有益作用.

圖1 GABA分子結(jié)構(gòu)圖

自1949年科學(xué)家首次在馬鈴薯中檢測到GABA，目前幾乎所有的重要經(jīng)濟(jì)作物和模式作物中均檢測到它的存在.GABA在作物中的含量會隨物種和品種的不同而出現(xiàn)差異，這取決于許多因素，如植物的發(fā)育階段、生長的環(huán)境條件、對生物和非生物脅迫的反應(yīng)等.很多作物在成熟時都會積累充足的GABA，能夠滿足人們追求健康生活所需的攝入量（10～20 mg?d）.

番茄作為全世界生產(chǎn)和消耗最多的作物之一，不僅具有一定的觀賞價值，還具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值.而且番茄本身含有豐富的GABA和多種營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素C、維生素B、番茄紅素、胡蘿卜素、生物堿以及多種礦物質(zhì)元素.番茄中GABA的含量取決于基因型和品種.研究表明野生種番茄GABA的含量明顯少于現(xiàn)代栽培種，這可能是對番茄風(fēng)味的不斷選育影響了谷氨酸含量造成的，由此對番茄中增加GABA積累的研究就變得更有意義.

2? 番茄中GABA的代謝過程

番茄中的代謝途徑

在植物體內(nèi)GABA的代謝主要是通過GABA分流途徑進(jìn)行的.在番茄細(xì)胞質(zhì)中，谷氨酸在H依賴的谷氨酸脫羧酶（GAD）催化下不可逆地生成GABA，隨后在透性酶（GABA-P）的作用下從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入線粒體中. 在線粒體中，GABA經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）催化可逆性生成琥珀酸半醛（SSA）.最后，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）催化下生成琥珀酸（Suc），參與三羧酸循環(huán)（TCA）代謝，如圖2所示.此外SSA還可以被琥珀酸半醛還原酶（SSR）在細(xì)胞質(zhì)中催化成γ-羥基丁酸（GHB）.但是只有從谷氨酸生成琥珀酸的途徑才稱之為GABA分流.GABA分流被認(rèn)為在碳、氮初級代謝中發(fā)揮著主要作用，是應(yīng)激和非應(yīng)激條件下三羧酸循環(huán)不可缺少的部分.

圖2 GABA代謝圖

番茄代謝途徑中的主要調(diào)節(jié)因子

2.2.1 谷氨酸脫羧酶

現(xiàn)階段已經(jīng)從不同植物物種中鑒定出很多GAD基因，它們的表達(dá)水平受器官類型、生長階段和環(huán)境條件的影響.植物中的GAD是一種典型的吡哆醛-5'-磷酸（PLP）依賴酶，以六聚體形式存在.與動物和細(xì)菌中的GAD不同，植物GAD具有額外的30～50個氨基酸的C末端殘基，稱為鈣調(diào)素（CaM）結(jié)合域（CaMBD）.體外研究結(jié)果表明，植物在Ca和H離子存在的情況下，能通過調(diào)節(jié)GAD活性來應(yīng)對各種脅迫.在生理pH值環(huán)境下，CaMBD會通過折疊其活性位點(diǎn)來抑制GAD活性，而在酸性pH值（<6.0）和Ca存在的條件下，CaMBD構(gòu)象發(fā)生改變.釋放GAD活性位點(diǎn)，使其活性增加.此外，研究表明，CaMBD的去除會導(dǎo)致植物中GABA的積累增加.因此，CaMBD被認(rèn)為在Ca/CaM存在的情況下（如在應(yīng)激條件下）激活GAD酶;在Ca/CaM缺失的情況下（如在非應(yīng)激條件下），CaMBD通過自抑制域發(fā)揮作用.

目前在番茄中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5個GAD基因（Solyc11g011920，Solyc04g025530，Solyc05g054050，Solyc01g005000和Solyc03g098240）.第一個GAD基因，（Solyc03g098240）是研究人員1995年從“Ailsa Craig”番茄果實(shí)的cDNA文庫中篩選得到的.它在果實(shí)綠熟階段表達(dá)量最高，在果實(shí)成熟后緩慢降低.之后，科學(xué)家陸續(xù)從“Micro-Tom”果實(shí)發(fā)育過程中分離到3個GAD基因：（Solyc03g098240，也稱），（Solyc11g011920），（Solyc01 g005000）.的mRNA水平在果實(shí)成熟時較高，而和的mRNA水平在果實(shí)發(fā)育早期最高，隨著果實(shí)成熟逐漸減少.研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)成熟過程中，表達(dá)與GABA含量沒有明顯相關(guān)性，而，則參與GABA代謝調(diào)控.

2.2.2 γ-氨基丁酸透性酶

GABA-P是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將細(xì)胞質(zhì)中的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中代謝，將GABA分流途徑與三羧酸循環(huán)途徑聯(lián)系起來.

2.2.3 γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶

根據(jù)底物親和力不同，有兩種轉(zhuǎn)氨酶參與GABA分解代謝，一種為α-酮戊二酸依賴的GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA-TK），另一種為丙酮酸依賴的GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA-TP）.前者以α-酮戊二酸作為氨基受體產(chǎn)生琥珀酸半醛和谷氨酸，后者以丙酮酸或乙醛酸作為氨基受體轉(zhuǎn)化生成丙氨酸或甘氨酸（圖2）.研究發(fā)現(xiàn)，GABA-TP是植物中特有的，且通常表現(xiàn)出更高的活性，而在其他生物中主要是GABA-TK參與代謝.

番茄中有3個GABA-TP基因參與GABA代謝，分別是線粒體中的-（Solyc07g043310）、細(xì)胞質(zhì)中的-（Solyc12g006470）和質(zhì)體中的-（Solyc12g006450）.研究證實(shí)，-和-參與GABA代謝，且-為調(diào)控的主要轉(zhuǎn)氨酶基因.

2.2.4 琥珀酸半醛脫氫酶

SSADH蛋白在大部分生物體中定位在線粒體中.研究表明，SSADH對SSA具有專一性，對控制植物體內(nèi)整體GABA的水平有重要的作用.

目前在番茄中發(fā)現(xiàn)一個SSADH基因（候選基因Solyc09g090700）參與SSA催化生成Suc的過程.其在番茄果實(shí)發(fā)育各個時期均有表達(dá)，但與GABA含量的相關(guān)性小.

3? 提高番茄中GABA含量的研究進(jìn)展

番茄中提高含量相關(guān)基因的研究

增加番茄GABA含量對促進(jìn)人體健康有極大的潛能，不僅可以降低輕中度高血壓患者的血壓，還可以通過長時間飲食攝入起到預(yù)防高血壓的作用.研究表明，GABA不像其他食品成分，其口感和化學(xué)成分不會受其他營養(yǎng)成分影響，且不像糖、鹽、脂肪等過量攝入會影響健康.因此很多研究者都嘗試了各種辦法，試圖增加番茄中GABA的含量.

2012年，BEMER等通過番茄果實(shí)成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和的功能研究發(fā)現(xiàn)，在番茄的RNA干擾（RNAi）植株果實(shí)中，谷氨酸含量減少到原來的1/8，GABA含量增加2倍.

2013年，KOIKE等通過RNAi技術(shù)沉默了3個-的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)-沉默系的GABA含量在果實(shí)綠熟階段增加了近2倍，在果實(shí)成熟階段增加了6.8～9.2倍.而-，-沉默系相對沒有明顯變化.

2015年，BAO等通過利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）抑制參與GABA代謝的一些關(guān)鍵酶，發(fā)現(xiàn)抑制系的GABA含量下降了40%.

2015年，TAKAYAMA等為了探究表達(dá)對番茄果實(shí)中GABA生物合成的影響，利用RNAi對，和單個基因，以及3個基因同時干擾，發(fā)現(xiàn)-系中的GABA水平?jīng)]有顯著改變，而-，-和-全部表現(xiàn)出較低的GABA水平，特別是-對果實(shí)GABA水平的影響最大.由此表明，和的表達(dá)水平與番茄果實(shí)中 GABA的積累有關(guān)，而與果實(shí)中GABA積累的相關(guān)性小，且GABA水平的降低對番茄葉片谷氨酸水平和植株發(fā)育影響不大.

為進(jìn)一步評估對番茄中GABA含量的影響，TAKAYAMA又對基因進(jìn)行過表達(dá)，結(jié)果表明：35S啟動子過表達(dá)完整的，純合番茄植株在果實(shí)綠熟階段表達(dá)增加超過20倍，在果實(shí)成熟階段表達(dá)增加超過200倍，與之相應(yīng)，GABA含量也增加了6～7倍.該研究人員用番茄果實(shí)特異性啟動子過表達(dá)C末端缺少29個氨基酸的，同樣使GABA含量增加11～18倍.

介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)用于提高番茄中含量的研究進(jìn)展

隨著基因編輯技術(shù)在動植物中的廣泛應(yīng)用，研究人員也嘗試?yán)肅RISPR/Cas9技術(shù)提高GABA在番茄中的積累，并取得了預(yù)期的效果.同時研究人員也發(fā)現(xiàn)番茄中GABA的積累并非越多越好，相反，GABA的過高積累會導(dǎo)致體內(nèi)氨基酸的嚴(yán)重失衡，引起畸變表型.

2017年，NONAKA等通過比對來自于5種不同植物的10個GAD氨基酸序列，以SlGAD2 C末端第30位、48位氨基酸，以及SlGAD3 C末端的第37位氨基酸為目標(biāo)，設(shè)計了針對GAD自抑制域的3個靶位點(diǎn)（SlGAD2ΔC30，SlGAD2ΔC48和SlGAD3ΔC37）.在沒有Ca的環(huán)境下，分別在GAD活性最佳pH值（pH=5.8）和植物細(xì)胞pH值（pH=7.0）下檢測不同C末端自抑制域突變類型對GAD活性的影響.結(jié)果表明：突變導(dǎo)致GAD C末端自抑制區(qū)蛋白截斷后的植株在pH=5.8的條件下，GAD活性分別提高了2.2，2.7和14.6倍;在pH=7.0的條件下，GAD活性分別提高了10.2，16.5和12.9倍.隨后檢測了番茄葉片和果實(shí)成熟階段GABA的積累，發(fā)現(xiàn)GABA含量在葉片中提高了11～12倍，在果實(shí)中提高了2～10倍.有趣的是，通過對T代和T代突變類型的分析統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，由于突變位點(diǎn)選擇的不同，突變類型會有一定的傾向性，且不同突變類型影響GABA的積累，其中SlGAD3ΔC37位點(diǎn)在GAD C自抑制域上游的突變使果實(shí)成熟階段中GABA的積累提高了7～15倍.通過對T代純合突變植株的大小、開花時間、果實(shí)產(chǎn)量等分析發(fā)現(xiàn)，大部分植株比野生型略矮，且成熟階段果實(shí)略小.同時，在SlGAD2ΔC30和SlGAD2ΔC48突變株中還會出現(xiàn)開花延遲、沒有花芽、結(jié)果率降低等不利表型.

2018年，LI等通過對GABA分流途徑中的一些關(guān)鍵基因-，-，-，，進(jìn)行多基因編輯，實(shí)現(xiàn)了GABA的高積累，-，-，，的四基因突變體植株與野生型相比，GABA含量在葉片中增加了高達(dá)19倍，果實(shí)中增加了4倍.然而所有的突變株在生長發(fā)育后期也出現(xiàn)了嚴(yán)重的矮化.高GABA含量的突變系中會出現(xiàn)葉片失綠、卷曲、葉片長出次級軸和多個小葉、葉片細(xì)胞變得小而皺縮，甚至高度不育等畸形表型.由此可見，有效增加番茄成熟階段GABA含量的研究任重而道遠(yuǎn).

4? 展 望

基因編輯技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物中，其系統(tǒng)成熟、技術(shù)完善，取得了突破性成果，并且，它正以多變、靈活的方式應(yīng)用于植物品種的改良.其中最有前途的方向之一是應(yīng)用于順式調(diào)控區(qū)，對控制基因轉(zhuǎn)錄的非編碼序列的編輯.在動植物中進(jìn)行的大量數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）和全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)，許多驅(qū)動進(jìn)化、馴化和育種的基因變化發(fā)生在順式調(diào)控區(qū).與改變蛋白質(zhì)的編碼序列相比，順式調(diào)控區(qū)的突變通常具有實(shí)質(zhì)性和多效性，通過修改基因表達(dá)的時間、模式或水平引起細(xì)微的表型變化.這可能是由于轉(zhuǎn)錄控制的復(fù)雜性，如啟動子和其他調(diào)控區(qū)域中許多順式調(diào)控元件（CREs）的冗余和模塊化組織，且大多數(shù)尚不明確.在動植物的進(jìn)化和馴化過程中，順式調(diào)控變異雖然得到廣泛的青睞，但它還遠(yuǎn)未達(dá)到飽和，依然擁有很大的操縱空間.許多研究表明通過順式調(diào)控元件（CREs）突變產(chǎn)生了顯著的表型變化.如RODRíGUEZ-LEAL等通過對控制番茄果實(shí)大小，及花序結(jié)構(gòu)基因的順式調(diào)控區(qū)編輯，實(shí)現(xiàn)了基因的連續(xù)突變，得到了一系列突變表型，揭示了順式調(diào)控區(qū)影響數(shù)量性狀的原因.對于花序結(jié)構(gòu)基因，轉(zhuǎn)錄變化雖然不能很好地預(yù)測其表型效應(yīng)，但也揭示了調(diào)控突變影響數(shù)量性狀的復(fù)雜性.由此可見，靶向其他發(fā)育調(diào)控因子的啟動子或順式調(diào)控區(qū)，可以不同程度地改變性狀，對進(jìn)一步的基因研究意義深遠(yuǎn).

在利用基因編輯技術(shù)增加番茄果實(shí)中GABA含量的研究中，已經(jīng)通過對編碼區(qū)的突變，如GAD C末端自抑制域的靶向突變、GABA分流途徑多個基因的靶向敲除等使得番茄中GABA含量大大提高. 但是GABA在番茄中的高度積累也伴隨著畸形表型的出現(xiàn)，如植株矮化、葉片失綠、卷曲、多小葉、開花延遲、花早脫、果實(shí)小、坐果率低、育性降低等.為了克服這個現(xiàn)象，有研究人員正在利用基因編輯技術(shù)對-順式元件啟動子區(qū)域進(jìn)行靶向突變.通過對-表達(dá)的調(diào)節(jié)，使酶活達(dá)到最優(yōu)水平，實(shí)現(xiàn)在不影響植物正常發(fā)育的同時最大限度地增加GABA的含量.首先他們設(shè)計了一個包含4個gRNAs的載體，作用在-起始密碼子上游2 kbp的區(qū)域內(nèi)，將載體轉(zhuǎn)入番茄Micro-Tom.同時，他們還在去除自抑域的GAD自抑制域突變系SlGAD3?C37起始密碼子上游2 kbp區(qū)同樣設(shè)計4個靶向突變點(diǎn)，以此將順式調(diào)控基因表達(dá)水平與去除自抑制域的影響結(jié)合在一起，有望得到一系列連續(xù)數(shù)量突變的順式調(diào)節(jié)等位基因，從而進(jìn)一步篩選出既不影響生長發(fā)育又富含GABA的理想材料.

研究證明，在植物育種中，基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)雜交方法相比，效率和精度更高，且可以實(shí)現(xiàn)番茄中GABA的含量顯著增加.在番茄中還有一些在不改變已知GABA代謝途徑的情況下增加GABA含量的現(xiàn)象，說明番茄GABA含量調(diào)控途徑的復(fù)雜性.因此，仍有很大的空間去發(fā)掘番茄中參與GABA含量調(diào)節(jié)的因子.此外，未來在平衡番茄生長發(fā)育和GABA的含量方面仍然需要做出很大的努力.

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（責(zé)任編輯：顧浩然，郁慧）

收稿日期： 2020-12-04

基金項(xiàng)目： 上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目（17DZ2252700）

作者簡介： 孫 星（1996—），女，碩士研究生，主要從事利用基因編輯技術(shù)改良番茄品種等方面的研究. E-mail： 465067569@qq.com

* 通信作者： 汪 沖（1988—），女，講師，主要從事基因編輯在植物中的應(yīng)用及植物功能基因等方面的研究. E-mail： wangchong0726@163.com

引用格式： 孫星， 王文文， 衛(wèi)純潔， 等. 利用基因編輯技術(shù)提高番茄GABA含量的研究進(jìn)展 [J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2022，51（1）：87?93.

?SUN X， WANG W W， WEI C J， et al. Research progress on improving GABA content in tomato by gene editing technology [J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：87?93.