王虓宇，江文文，胡文著，杭賽虎，趙宏，陳溢娟，趙云蓉，柏會文，趙宸，梁疆莉

百日咳是由革蘭氏陰性鮑特氏桿菌（Bordetella Pertussis，B.p）引起的急性呼吸道感染性疾病。百日咳桿菌可在各年齡組的人群中引起較高的發(fā)病率，而且可對未接種疫苗的嬰兒形成生命威脅[1]。全菌體的百日咳疫苗（whole-cell pertussis vaccine，wP）于 20 世紀 30年代成功研制后，在 40年代得到了大規(guī)模的應(yīng)用。但是因為 wP 伴隨著很多嚴重的副反應(yīng)，如伴有或不伴有發(fā)熱性痙攣、腫脹、疼痛以及注射部位紅腫甚至高熱、驚厥以及腦病等[2]。為了減少這些副反應(yīng)的發(fā)生率和程度，Sato等[3]設(shè)計了一種用共純化方式獲得的無細胞百日咳疫苗（aP）。含百日咳桿菌 1 ～ 5 個組分的 aP 上市后便廣泛替代 wP 使用至今[4]。雖然疫苗是預(yù)防此疾病最有效的工具，但并不是 100% 的有效[5]。即使在疫苗覆蓋率超過 90% 的國家，每年感染率仍達到 1% ～ 7%[2,6-7]。全球百日咳發(fā)病率的增加可能反映了檢測方法學(xué)靈敏度的提高、疫苗誘導(dǎo)的保護力以及誘導(dǎo)的保護時間的有限以及病原體的適應(yīng)和進化[8-11]。其中一個很重要的因素可能是目前使用的 aP 無法在基礎(chǔ)免疫后誘導(dǎo)強效的細胞免疫，而強效的細胞免疫是疫苗介導(dǎo)長期保護的必要條件[12]。

有研究表明，TLR4 配體 LPS 的存在是 wP誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更偏向于 Th1 反應(yīng)的一個重要因素[13]。在 aP 中加入 TLR4 配體作為佐劑能誘導(dǎo)更理想的細胞免疫反應(yīng)[13-14]。無毒性的單磷酸脂質(zhì)A（MPLA）來源于沙門氏菌的脂多糖。一些臨床前研究顯示，MPLA 可以誘導(dǎo) IL-2 和 IFN-γ 的合成和釋放，從而促進了 Th1 細胞反應(yīng)的產(chǎn)生[15-16]。本研究擬利用實驗室前期建立的百日咳氣霧攻擊動物模型開展用常規(guī)的 aP[含百日咳毒素（PT）、絲狀血凝素（FHA）、黏附素（PRN）以及鋁佐劑）]作為基礎(chǔ)疫苗，研究加入 MPLA 佐劑后對 aP 的免疫效果影響。通過動物實驗研究試驗疫苗在動物體中介導(dǎo)的免疫反應(yīng)差異，特別是 Th1 和 Th2 的差異，評價 MPLA 佐劑的添加對改善 aP 的免疫效果，從而為后續(xù)新型的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 無細胞百日咳疫苗的三個抗原組分PT、FHA 和 PRN 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所自主制備；MPLA 購自美國 Avanti 公司；PT、FHA、PRN 及 MPLA 分別用氫氧化鋁佐劑吸附制成原液，按所需的量加入。各疫苗配方見表1。

表1 無細胞百日咳疫苗的抗原及佐劑配方Table 1 Antigens and adjuvants formulations of vaccines used in this study

1.1.2 試劑 百日咳攻擊菌（菌株號：B.p2016-CY-41）由中國食品藥品檢定研究院提供，為近期從臨床病人新分離的流行株；對百日咳毒素啟動子（ptxP）、百日咳毒素亞單位 1（ptxA）、PRN、百日咳菌毛蛋白（Fim）2 和 Fim 3 的多態(tài)性進行測序分析，百日咳菌株B.p2016-CY-41 基因型為 ptxP1/ptxA1/prn1/fim2-1/fim3-1；百日咳抗血清標準品（含 5 種百日咳抗原的抗體組分：anti-PT 17 IU/ml、anti-FHA 143 IU/ml、anti-PRN 30 IU/ml、anti-Fim2 32 IU/ml、anti-Fim3 32 IU/ml）購自英國國家生物制品檢定所；羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2a 二抗（帶 HRP）購自美國 Jackson 公司；包被抗原 PT、FHA 和 PRN 為我所保存；單組分 TMB 底物顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實驗動物 SPF 級 Balb/c 小鼠，4 ～ 5 周齡，共 60 只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有動物實驗均根據(jù)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動物保護和使用委員會批準的方案進行。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫及感染 將小鼠隨機分為 3 組（aP 組、aP + MPLA 組和 PBS 對照組），每組20 只，雌雄各半。每只小鼠經(jīng)腹腔途徑免疫兩次1/40 的人用劑量疫苗（0.5 ml/劑），每次間隔 3 周。第一次免疫前三天及每次免疫后的第 21 天采血，分離血清，-80 ℃ 儲存。在最后一次免疫的三周后對各組小鼠用百日咳鮑特氏菌菌株 2016-CY-41進行氣霧攻擊，進行呼吸道感染（1011CFU/ml）。于感染后第 2、6、10、14 和 21 天取樣，每次4 只/組，對肺部、氣管細菌進行計數(shù)。

1.2.2 百日咳抗體效價檢測 采用 ELISA 法檢測血清中抗 PT、FHA 和 PRN 抗體（anti-PT、anti-FHA、anti-PRN）IgG 的水平。利用四參數(shù)擬合法繪制曲線，并與每個酶標板上的百日咳抗血清標準品進行比較，將抗體濃度轉(zhuǎn)化為 IU/ml[17]。同時分別使用 IgG1 與 IgG2a 酶二抗測定小鼠血清中 IgG1 與 IgG2a 抗體亞型的滴度，并計算兩者比值；顯色液 TMB 37 ℃ 孵育顯色 15 min 后，用OD450酶標儀檢測吸光值，同時設(shè)定陰性血清對照孔，讀數(shù)值/陰性值 ≥ 2.1 判定為陽性孔。

1.2.3 感染后白細胞計數(shù) 氣霧感染各組小鼠，于感染前、感染后第 2、6、10、14、21 天尾靜脈采血，采全血 200 μl，EDTA 抗凝，血球計數(shù)儀檢測白細胞數(shù)。

1.2.4 感染肺部、氣管菌落計數(shù) 每組每個采樣點隨機數(shù)字表法挑選 4 只小鼠，分離肺和氣管組織，稱取 0.1 g 肺組織以及整個氣管組織，分別加入 1 ml 等滲無菌 PBS，電動組織勻漿器研勻。適當(dāng)稀釋后，取 50 μl 均勻涂布于直徑為 6 cm 的含頭孢氨芐（40 μg/ml）的木炭瓊脂平板上，37 ℃ 孵育 4 ～ 5 d 后計算菌落克隆形成數(shù)（CFU）。剩余肺組織全部制備成勻漿，并加入 PMSF，-80 ℃ 凍存，以檢測細胞因子含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 Graphpad prism 軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪圖。兩組間的比較采用雙尾t檢驗，三組間比較采用 One-way ANOVA 分析，以P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫后抗原特異性 IgG 抗體應(yīng)答

第一次免疫后的第 21 天，aP 組小鼠血清中的 anti-PT、anti-FHA 以及 anti-PRN 的IgG 抗體平均水平分別為 47.16、38.25 和 12.82 IU/ml；aP + MPLA 組的 PT、FHA 以及 PRN 的特異性IgG 水平均高于 aP 組，分別為 88.12、95.88 和94.76 IU/ml（圖1A ～ C）。第二次免疫后的第21 天，aP 組小鼠血清中的 anti-PT、anti-FHA 以及 anti-PRN 的 IgG 抗體水平與第一次免疫后相比，有了明顯升高，分別為 731.25、770.95 和552.18 IU/ml；但 aP + MPLA 組第二次免疫后血清anti-PT、FHA 以及 PRN 的特異性 IgG 水平與 aP組相比，仍高于 aP組且具有統(tǒng)計學(xué)差異，分別為1200.12、3475.81 和 3369.76 IU/ml（圖1D ～ F）。

圖1 疫苗接種誘導(dǎo)的百日咳特異性 IgG（**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 1 B. pertussis-specific IgG production ( **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001)

2.2 IgG1 與 IgG2a 變化

在第二次免疫后檢測血清中 IgG 抗體的同時，還檢測了 IgG1 和 IgG2a 亞型的抗體滴度，以此作為 CD4+T 細胞應(yīng)答的間接測量指標。MPLA 佐劑所誘導(dǎo)的 anti-PT、anti-FHA以及anti-PRN 的不同 IgG 亞型（IgG1、IgG2a）抗體水平均高于 aP 組（圖2A ～ C）。計算各抗體 IgG2a與 IgG1 的比值，發(fā)現(xiàn)免疫 aP + MPLA 的小鼠anti-PT、anti-FHA 以及 anti-PRN 的 IgG2a 與IgG1 的比值均高于免疫 aP 的小鼠（圖2D），說明 MPLA 佐劑可促進無細胞百日咳疫苗產(chǎn)生偏向性 Th1 細胞免疫反應(yīng)。

圖2 ELISA 檢測 PT（A）、FHA（B）、PRN（C）的特異性 IgG1、IgG2a 抗體水平和滴度比值（D）（*P ＜ 0.05，**P ＜0.01，***P ＜ 0.001）Figure 2 IgG1, and IgG2a specific for PT(A), FHA(B), PRN(C) titers were analyzed by ELISA assay and the antibody titers (D)(*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001)

2.3 小鼠氣霧感染后白細胞變化

百日咳桿菌氣霧攻擊小鼠后第 2 天，PBS 對照組小鼠白細胞數(shù)（WBC）與感染前相比出現(xiàn)了顯著性升高，并在第 14 天達到峰值，在第 21 天恢復(fù)至正常水平。aP 組和 aP + MPLA 組小鼠的WBC 水平在感染后第 2、6 和 10 天與感染前相比無顯著性變化，而在感染后第 14 天時，兩組小鼠的 WBC 均有一過性升高，第 21 天便恢復(fù)至正常水平（圖3）。

圖3 小鼠氣霧感染后的白細胞數(shù)變化（和感染前相比，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 3 Dynamic profiles of leukocytosis after challenged with B. pertussis (**P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs. pre-challenge)

2.4 小鼠氣霧感染后氣管和肺組織細菌定植分析

對照組小鼠感染后百日咳桿菌在肺組織大量定植，并且在感染后的第 10 天達到最高峰（2.3 ×105CFU/ml），且在感染后的第 21 天仍未清除（圖4A）。與對照組小鼠相比，兩組疫苗接種組小鼠在肺組織中的細菌定植顯著降低，但仍有少量定植，且兩組之間無顯著性差異。到感染后第21 天，免疫 aP + MPLA 小鼠的肺組織已將感染清除至檢測限，而 aP 免疫的小鼠肺組織中仍檢測到少量細菌定植。此外，在氣管組織中的細菌定植與肺部相似，各疫苗接種組的小鼠在氣管中的細菌定植數(shù)量與對照組相比顯著降低。其中 aP + MPLA免疫的小鼠和 aP 組一樣在感染第 14 天就將氣管組織細菌定植清除至檢測限（圖4B）。

圖4 小鼠氣霧感染后肺（A）和氣管（B）組織細菌定植分析（LOD：檢測限）Figure 4 B.pertussis colonization of lung (A) and trache (B) tissue after aerosol infection (LOD: Limit of detection)

2.5 小鼠氣霧感染后血清和肺組織中細胞因子分析

實驗中我們觀察到感染后的第 2、6 和10 天，各組小鼠血清中 IFN-γ 水平?jīng)]有明顯差異（圖5A）；而免疫 aP 的小鼠血清中，與 Th2 反應(yīng)相關(guān)的 IL-5 細胞因子水平在感染后的第 2 天顯著高于其他組（圖5B）；此外，感染后對照組小鼠血清中與 Th17 細胞反應(yīng)相關(guān)的 IL-17A 的水平顯著高于兩種疫苗組（圖5C），這說明小鼠的百日咳自然感染可以引起很強的 Th17 反應(yīng)。同時，我們還檢測了小鼠肺勻漿中的細胞因子以作為肺局部免疫指標，同血清中反應(yīng)一樣，各組小鼠肺組織中 IFN-γ 水平?jīng)]有明顯差異（圖5D）；而免疫 aP 的小鼠肺組織中，與 Th2 反應(yīng)相關(guān)的 IL-5細胞因子水平在感染后的第 2 天顯著高于其他組（圖5E），在感染后的第 6 天，疫苗組小鼠 IL-5細胞因子水平均高于對照組（圖5E）；感染后第10 天對照組小鼠肺組織中 IL-17A 的水平顯著高于兩種疫苗組（圖5F）。

圖5 小鼠感染后血清和肺組織中細胞因子變化（A：血清 IFN-γ；B：血清 IL-5；C：血清 IL-17A；D：肺組織 IFN-γ；E：肺組織 IL-5；F：肺組織 IL-17A；*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001）Figure 5 Analysis of cytokines kinetics of serum and lung tissues in mice after infection (A: Serum IFN-γ; B: Serum IL-5;C: Serum IL-17A; D: Lungs IFN-γ; E: Lungs IL-5; F: Lungs IL-17A; *P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001)

3 討論

盡管自 20 世紀 30年代以來就已經(jīng)有百日咳預(yù)防性疫苗，但最近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明百日咳的預(yù)防控制仍然存在問題[1,18]。MPLA 為 TLR4 的配體，可顯著增強 T 細胞和 B 細胞的免疫應(yīng)答，將 MPLA 作為佐劑已經(jīng)在很多疫苗都被證實具有免疫增強的效應(yīng)。近年來的研究還顯示將 TLR4 配體作為佐劑添加到 aP 中可提高百日咳特異性CD4+T 細胞應(yīng)答[13]。因此，在此研究中我們將MPLA 作為新的佐劑加入 aP 中，對其進行免疫刺激作用的評價。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，與單一使用鋁佐劑相比，添加 MPLA 可同時顯著提高 aP 免疫的 IgG、IgG1和 IgG2a 的抗體水平，且顯著提高了小鼠的 Th1細胞免疫。此外，在使用百日咳桿菌菌株號為2016-CY-41 的流行株作為攻擊菌株的小鼠中，1/40人用劑量的 aP 是具有保護性的，并且在該劑量下，添加 MPLA 佐劑在一定程度上可加快小鼠肺部細菌的清除，反映在感染后第 14 天肺部細菌就已經(jīng)清除，而 aP 疫苗組在感染后第 21 天還檢測到少量細菌。但添加 MPLA 的疫苗組小鼠感染后的白細胞水平，與 aP 相比沒有顯著性差異。另外，MPLA 的加入對氣管的細菌定植未觀察到明顯改善。在此研究中，MPLA 的加入并未達到理想的改善 aP 的保護效果。對于這種現(xiàn)象我們主要有以下三點考慮，第一，MPLA 可能在細胞免疫記憶的迅速激活方面沒有起到明顯的促進作用，這反映在小鼠感染后血清和肺組織中 IFN-γ 水平都沒有觀察到顯著變化；Auderset 等[19]研究表明，相比于TLR4 的激動劑，TLR9 的激動劑可誘導(dǎo)更高更快的免疫記憶細胞激活。第二，MPLA 的加入可能沒有顯著提高 Th17 細胞的作用。已有大量的研究表明，Th17 細胞在百日咳免疫保護效果中具有非常重要的作用[20]。很遺憾在此研究中我們并沒有監(jiān)測MPLA 的加入對小鼠免疫后 Th17 細胞的促進作用，只是將此作為一種推測。第三，百日咳自然感染可誘導(dǎo)保護性的黏膜免疫，這在再次感染的細菌快速清除中起到重要作用[21]。此外，有研究表明細菌自然感染后在組織中誘導(dǎo)的局部組織駐留記憶T 細胞（tissue resident memory T cells，TRMs）在抵抗再次感染中起關(guān)鍵作用[22]，而腹腔免疫途徑不能誘導(dǎo)較好的黏膜免疫[23]。

本研究的結(jié)果表明，MPLA 作為免疫佐劑添加到無細胞百日咳疫苗中與未添加 MPLA的疫苗相比較都能產(chǎn)生足夠的免疫保護能力。百日咳感染后保護效果的主要指標是檢測白細胞和動物肺部百日咳菌克隆數(shù)的變化[24]，以及感染后細菌定植清除的效率。百日咳桿菌氣霧攻擊小鼠后，保護效果較好的疫苗組即白細胞上升更少、細菌定植量更少。MPLA 的加入雖然可顯著提高小鼠免疫后的體液和細胞免疫水平，但 MPLA 的添加與否并不影響疫苗的保護性能。與對照組小鼠相比，兩組疫苗接種組小鼠感染后外周血白細胞數(shù)量在 10 天內(nèi)無顯著性變化，在肺組織和氣管組織中的細菌定植顯著降低且細菌清除時間相同，兩組之間無顯著性差異，因此兩組疫苗在保護效果上并無明顯差別。分析結(jié)果我們認為向當(dāng)前 aP 中添加 MPLA 并不是改善 aP 的最佳方式，后續(xù)的研究應(yīng)該考慮其他佐劑以及其他免疫途徑。