孟慶坤 譚 昊 顧 卉 駱佳瑩 王菁菁 王傳合 韓 蘇 孫志軍*

心肌梗死是一種致命性疾病，是人類致死的重要原因[1]。在心肌梗死病理生理變化過程中，心肌細(xì)胞缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡對疾病進(jìn)展及預(yù)后起重要作用。而心肌細(xì)胞的凋亡與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[2]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類不具備編碼蛋白質(zhì)的，轉(zhuǎn)錄長度＞200 nt的非編碼RNA[3]，在心肌梗死的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[4-8]。基于之前的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在大鼠心肌梗死邊緣區(qū)有大量差異表達(dá)，以及通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)lncRNA存在多種潛在病理機(jī)制作用[9]。為了模擬心肌缺血缺氧狀態(tài)，本研究采用低糖缺氧處理大鼠H9C2細(xì)胞，選取lncRNA芯片中差異表達(dá)顯著的NR_027324作為研究對象，驗證在低糖缺氧H9C2細(xì)胞模型中NR_027324的變化，以及與凋亡的關(guān)系。通過觀察沉默NR_027324對心肌細(xì)胞凋亡的影響，以探討NR_027324調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為防治心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠H9C2心肌細(xì)胞購自萬類生物技術(shù)有限公司。si-RNA載體由萬類生物技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM2000：Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Inc.，美國。DMEM培養(yǎng)基：Gibco;Thermo Fisher Scientific, Inc.，Waltham，MA，美國。胎牛血清：FBS；EverGreen，浙江天杭生物科技有限公司。TRIpure試劑（Cat. No. RP1001）：北京百泰克生物技術(shù)有限公司。Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（Cat. No. PR6502）：北京BioTeke Corporation。SYBR GREEN mastermix（Cat. No. SY1020）：北京索萊寶科技有限公司。特異性引物：上海生工生物科技。全蛋白提取試劑盒（cat. no. WLA019）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（cat.no.WLA004）：萬類生物技術(shù)有限公司。Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9抗體：萬類生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗：萬類生物技術(shù)有限公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：萬類生物技術(shù)有限公司。乳酸脫氫酶測定試劑盒（cat.no. WLA072）：萬類生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和低糖缺氧處理、si-RNA轉(zhuǎn)染和分組 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，3 d后換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時，胰酶消化后，進(jìn)行傳代。si-RNA分子序列設(shè)計合成：選取NR_027324序列進(jìn)行分析，依據(jù)si-RNA原則設(shè)計3條lncRNA NR_027324干擾序列，并設(shè)計一條陰性對照序列。qRT-PCR檢測si-RNA轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)生長期H9C2細(xì)胞接種于6孔板中（每孔1×105個細(xì)胞），并在37 ℃，5%CO2下孵育24 h。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，用20 nmol/L最終劑量的小干擾RNA（si-Lnc）或小干擾RNA陰性對照（si-Lnc-NC），使用Lipofectamine 2000根據(jù)制造商的規(guī)程，瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，孵育24 h。

實驗分組：對照組（Con）：在高葡萄糖（4.5 g/L）的DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，溫度37 ℃和5%CO2。低糖缺氧組（oxygen and glucose deprivation,OGD）：在低葡萄糖（1.0 g/L）DMEM中培養(yǎng)，將其置于含1% O2、94%N2和5%CO2的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組（si-Lnc-NC+OGD）：轉(zhuǎn)染小干擾RNA陰性對照（si-Lnc-NC）后，給予低糖缺氧培養(yǎng)6 h。沉默NR_027324+低糖缺氧組（si-Lnc+OGD）：轉(zhuǎn)染小干擾RNA（si-Lnc）后，給予低糖缺氧培養(yǎng)6 h。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析使用TRIpure試劑提取總RNA。使用Nanodrop 2000系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，Inc，美國）測量RNA的濃度和純度。根據(jù)制造商的規(guī)程，使用Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA（cDNA）。根據(jù)制造商的規(guī)程，使用SYBR GREEN mastermix對cDNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。利用韓國BIONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量儀進(jìn)行熒光定量分析。mRNA和lncRNA的PCR反應(yīng)條件如下：在94 ℃下持續(xù)5 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)，分別是94 ℃下持續(xù)10 s和60 ℃下持續(xù)20 s。另外，對每個孔使用雙蒸水（ddH2O）作為非模板對照。使用β-actin用于標(biāo)準(zhǔn)化NR_027324的表達(dá)水平。相對表達(dá)通過2-△△Ct法定量，并進(jìn)行了3次重復(fù)。取3次結(jié)果的中位數(shù)計算相對表達(dá)水平。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 乳酸脫氫酶（LDH）檢測 分別轉(zhuǎn)染后，收集各組細(xì)胞上清液，采用LDH測定試劑盒，按照說明書的方案檢測LDH以確定細(xì)胞損傷，在490 nm的酶聯(lián)免疫檢測儀（ELX-800，BIOTEK，美國）測量每一孔的吸光度，每組重復(fù)3次。

1.2.4 噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測 按實驗分組將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞量5×103個，每組設(shè)置5個復(fù)孔，并設(shè)置一對照孔，只加培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，分別按分組進(jìn)行低糖缺氧處理。到達(dá)時間點后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT試劑，37 ℃、5%CO2孵育4 h，棄孔內(nèi)上清液，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），避光靜置10 min，在570 nm的酶聯(lián)免疫檢測儀測量每一孔的吸光度，計算5孔的平均值。計算細(xì)胞成活率。細(xì)胞成活率=OD值實驗組/OD值對照組。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，使用全蛋白提取試劑盒裂解總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測量蛋白質(zhì)的濃度和純度。每泳道40 μg的蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE凝膠上分離（10%），并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后與一抗孵育在4 ℃下過夜。然后將膜用TBST洗滌3次，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在37 ℃下孵育45 min，然后進(jìn)一步用TBST洗滌6次。隨后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測印跡，并用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行事后比較-最小顯著性差異法t檢驗（post-hoc LSD-t檢驗），雙側(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低糖缺氧H9C2細(xì)胞中NR_027324的相對表達(dá)量，LDH、細(xì)胞成活率變化

與對照組相比，低糖缺氧組NR_027324表達(dá)量明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。低糖缺氧組較對照組LDH升高（P＜0.001），成活率下降（P＜0.001）。見表2。

表2 低糖缺氧處理H9C2細(xì)胞的NR_027324表達(dá)、LDH、細(xì)胞成活率變化(±s)

表2 低糖缺氧處理H9C2細(xì)胞的NR_027324表達(dá)、LDH、細(xì)胞成活率變化(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.001；Con，對照組；OGD，低糖缺氧組

組別 NR_027324相對表達(dá)量 LDH(U/L) 細(xì)胞成活率(%)Con 1.004±0.106 55.128±5.875 0.318±0.043 OGD 2.081±0.088a 114.744±2.938a 0.164±0.020a

2.2 沉默NR_027324后，低糖缺氧H9C2細(xì)胞中NR_027324的相對表達(dá)量，LDH、細(xì)胞成活率變化

與沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組比較，沉默NR_027324+低糖缺氧組中NR_027324的相對表達(dá)量顯著下降76.78%（P＜0.001）。沉默NR_027324+低糖缺氧組中LDH與沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組比較進(jìn)一步升高（P＜0.001）；成活率下降（P＜0.001）。沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組與低糖缺氧組（不進(jìn)行轉(zhuǎn)染）比較NR_027324的相對表達(dá)量、LDH、成活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 沉默NR_027324后低糖缺氧H9C2細(xì)胞的NR_027324表達(dá)、LDH、細(xì)胞成活率變化(±s)

表3 沉默NR_027324后低糖缺氧H9C2細(xì)胞的NR_027324表達(dá)、LDH、細(xì)胞成活率變化(±s)

注：與si-Lnc+OGD組比較，aP＜0.001；OGD，低糖缺氧組；si-Lnc-NC+OGD，沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組；si-Lnc+OGD，沉默NR_027324+低糖缺氧組

組別 NR_027324相對表達(dá)量 LDH(U/L) 細(xì)胞成活率(%)OGD 2.081±0.088a 114.744±2.938a 0.164±0.020a si-Lnc-NC+OGD 1.996±0.056a 118.269±2.885a 0.179±0.019a si-Lnc+OGD 0.4images/BZ_106_903_2939_908_2939.png63±0.016 173.397±4.934 0.094±0.015

2.3 低糖缺氧H9C2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及沉默NR_027324后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果顯示與對照組比較，低糖缺氧組H9C2細(xì)胞促凋亡相關(guān)蛋白Bax，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降。沉默NR_027324+低糖缺氧組與沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組比較，H9C2細(xì)胞促凋亡相關(guān)蛋白Bax，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降。沉默NR_027324陰性對照+低糖缺氧組與低糖缺氧組（不進(jìn)行轉(zhuǎn)染）比較，凋亡相關(guān)蛋白差異變化不明顯。見圖1。

圖1 低糖缺氧處理H9C2細(xì)胞及轉(zhuǎn)染小干擾RNA沉默NR_027324后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（蛋白質(zhì)免疫印跡法）

3 討論

有研究表明，原代大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過低糖缺氧損傷（oxygen and glucose deprivation, OGD）干預(yù)4 h后，細(xì)胞成活率降低，LDH釋放增多[10]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果趨于一致，低糖缺氧損傷的H9C2細(xì)胞中，與對照組比較，LDH明顯升高，MTT提示細(xì)胞成活率下降。本研究中蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果顯示低糖缺氧大鼠H9C2細(xì)胞中促凋亡相關(guān)蛋白Bax，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，提示凋亡激活。心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死中導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的重要原因。多種凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)可促進(jìn)或抑制心肌細(xì)胞凋亡，如Bax、Bcl-2和caspase-3、caspase-9等[11]。Caspase是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，活化的cleaved caspase-9 是線粒體細(xì)胞凋亡途徑的啟動者，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者cleaved caspase-3蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。在之前的研究通過芯片技術(shù)分析心肌梗死邊緣區(qū)的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)lncRNA在心肌梗死邊緣區(qū)有大量差異表達(dá)[9]。其中l(wèi)ncRNA NR_027324表達(dá)上調(diào)，重注釋分析提示其為H19基因的一段。有研究結(jié)果顯示H19基因?qū)π募〖?xì)胞缺氧損傷具有保護(hù)作用[13-14]。本研究采用低糖缺氧環(huán)境中培養(yǎng)H9C2細(xì)胞的方法模擬大鼠心肌梗死邊緣區(qū)缺血缺氧狀態(tài)，研究NR_027324在其中發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示，給予沉默NR_027324處理后，低糖缺氧損傷的H9C2細(xì)胞中Bax，cleavedcaspase3和cleaved-caspase9表達(dá)進(jìn)一步增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步下降。對低糖缺氧損傷的H9C2細(xì)胞進(jìn)一步沉默NR_027324后，LDH進(jìn)一步升高提示細(xì)胞損傷進(jìn)一步加劇，MTT法檢測細(xì)胞成活率進(jìn)一步下降。我們認(rèn)為，NR_027324與低糖缺氧的心肌細(xì)胞凋亡明確相關(guān)，沉默NR_027324后能夠促進(jìn)凋亡發(fā)生。進(jìn)而推論NR_027324可能是一種保護(hù)性lncRNA，抑制低糖缺氧H9C2細(xì)胞中的凋亡過程。心肌細(xì)胞經(jīng)過6 h的低糖缺氧干預(yù)后，NR_027324表達(dá)上調(diào)，給予沉默其表達(dá)后，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加，使LDH釋放增多、細(xì)胞成活率進(jìn)一步下降，反之，低糖缺氧損傷后的NR_027324表達(dá)上調(diào)可能是細(xì)胞應(yīng)對缺血缺氧導(dǎo)致凋亡增加的一種應(yīng)激性自我保護(hù)機(jī)制。內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNAs, ceRNA）是lncRNA通過內(nèi)源競爭結(jié)合的方式調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平調(diào)控靶基因表達(dá)的一種作用方式。重注釋分析提示NR_027324為H19基因的一段，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-103-3p可能為其結(jié)合靶點。而在大鼠心肌細(xì)胞中miR-103-3p能夠下調(diào)Atg5的蛋白表達(dá)[15]。我們大膽推測NR_027324可能通過ceRNA的方式調(diào)節(jié)miR-103-3p表達(dá)，繼而調(diào)節(jié)下游靶點ATG5的表達(dá)，來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡。上述推論尚需進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，NR_027324能夠調(diào)節(jié)低糖缺氧的大鼠心肌細(xì)胞凋亡過程。在低糖缺氧的大鼠心肌細(xì)胞中，lncRNA NR_027324可能是減少心肌細(xì)胞凋亡的一個可能的治療靶點。不可忽視的是，隨著心肌梗死的時間演變，凋亡也存在動態(tài)變化，lncRNA在其中發(fā)揮的作用可能也有著動態(tài)的變化，需要進(jìn)一步研究證實。