駱海春 陳高健 朱飛如 張雪梅

通常，為了解化學(xué)藥物成分、評估其治療價值，需要對藥物進行檢測，以保障臨床用藥合理性。傳統(tǒng)化學(xué)藥物檢測多采用薄層色譜法，其盡管能夠?qū)瘜W(xué)藥物成分分析起到一定的作用，但也存在分離困難的問題，未能在臨床推廣。近年來，高效液相色譜法（HPLC）以其測量速度快、靈敏度高等優(yōu)越性在藥品檢驗中得以應(yīng)用，且隨著該技術(shù)在實踐中的不斷改進，其分離分析操作逐漸完善，成為藥品檢驗的關(guān)鍵技術(shù)[1]。現(xiàn)介紹HPLC技術(shù)的發(fā)展及特點，分析HPLC技術(shù)在藥品檢驗中的應(yīng)用現(xiàn)狀以及HPLC技術(shù)在藥品檢驗中的發(fā)展趨勢。

1 HPLC技術(shù)發(fā)展及特點

HPLC技術(shù)最早誕生于20世紀60～70年代，其作為一種新型分離分析技術(shù)，經(jīng)過不斷改進與優(yōu)化，成為分析化學(xué)分離方法中極為重要的手段。該技術(shù)基礎(chǔ)為經(jīng)典液相色譜，并融入氣相色譜理論，利用高壓液泵、高效固定相及高靈敏度檢測器等所具有的較高選擇性、分離效能以及靈敏度，實現(xiàn)了自動化操作[2]。HPLC技術(shù)流動相為液體，利用各輸液系統(tǒng)傳輸需要檢驗液體物質(zhì)到相應(yīng)區(qū)域反應(yīng)，能夠產(chǎn)生固定顏色物質(zhì)，其原理與傳統(tǒng)液相色譜基本相同，但引入了更為先進的設(shè)備，優(yōu)化了操作過程，進而提升了物質(zhì)管理效率及反應(yīng)速率。HPLC技術(shù)在具體應(yīng)用過程中加入液體藥物后，各類物質(zhì)會被儀器有效分離，物質(zhì)特性不同其在色譜中分離位置也呈現(xiàn)出明顯的差異性，然后將其輸送到相應(yīng)位置處理機器，對物質(zhì)檢驗有著較高的精確度。不僅如此，其還能夠?qū)⑽镔|(zhì)中的雜質(zhì)進行分離，篩選出無用物質(zhì)，在藥物質(zhì)量改進中有著較高的應(yīng)用價值[3]。

以往有學(xué)者提出HPLC技術(shù)較傳統(tǒng)液相色譜法有著更高的速率、靈敏度與自動化[4]。1）從分析速度上看，經(jīng)典液相色譜法采用重力加料的方式，減慢了流出速度，HPLC則采用的是高壓輸液設(shè)備，流速能夠達到10 ml/min，是經(jīng)典液相色譜法的數(shù)百倍。以苯的羥基化合物分離為例，分離7個組分1 min內(nèi)便能夠完成。2）經(jīng)典液相色譜法僅能夠?qū)怏w或沸點較低化合物進行分析，HPLC技術(shù)則能夠?qū)崿F(xiàn)對80%以上有機物的分離與分析。3）氣相色譜以惰性氣體為流動相，與組分僅具有運載作用，無親和力與作用力。而HPLC技術(shù)將不同極性液體作為流動相，擁有較大的選擇余地，與組分會產(chǎn)生相互作用，可見流動相在分離中能發(fā)揮重要作用[5]。

2 HPLC技術(shù)在藥品檢驗中的應(yīng)用

HPLC技術(shù)最初在化學(xué)藥物成分分析中的應(yīng)用僅作為分離手段，其通過對混合物各類成分流動相以及固定相分配系數(shù)的分析，以色譜圖的形式將化學(xué)藥物成分呈現(xiàn)出來，在化學(xué)藥物分離及藥物成分分析中有著較高的應(yīng)用價值。

2.1 藥品含量檢驗

HPLC技術(shù)分辨率高、分析速度快且能夠?qū)崿F(xiàn)重復(fù)分析，在進行藥品檢驗時所需樣品少，在藥品含量測定中有著較高的適用性。學(xué)者陳立柱等[6]認為藥品質(zhì)量合理性不僅與藥品中各類物質(zhì)治療效用有關(guān)，而且與藥物成分含量有關(guān)，因此需要明確藥品是否具有足夠的效果或是否由于藥品含量不當對人體造成損害。利用HPLC技術(shù)能夠?qū)λ幤分兴幬锍煞钟枰苑蛛x，獲得相應(yīng)成分傳輸?shù)綑z驗機，實現(xiàn)對樣本成分的精準測量，確保藥品中有關(guān)成分能夠滿足臨床治療需求。目前，藥品含量測定方法主要包括吸附色譜法、離子交換色譜法，其中反相色譜應(yīng)用最為普遍。如在檢測馬來酸曲美布丁原料雜質(zhì)及制劑含量時，其中含有ATMB、TMBM及A800，采用HPLC技術(shù)進行檢驗不僅操作簡單、準確率高，而且能夠?qū)崿F(xiàn)對各制劑中組分含量的檢驗。學(xué)者呂瓊芳等[7]在研究中檢驗吡羅昔康藥品含量，該藥物屬于非甾體抗炎藥物，主要功效為解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎，通常按照《中華人民共和國藥典》標準進行含量檢測。但該藥物在水溶液中化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，氧化水解會生成2-氨基吡啶，吡羅昔康無法生成溶液，而采用HPLC檢驗，容積選擇鹽酸甲醇溶液，劑量為0.01 mol/L，不僅能夠促進藥物溶解性增加，而且能夠提高吡羅昔康溶液穩(wěn)定性，有利于實現(xiàn)對吡羅昔康藥品含量的準確檢測。學(xué)者余曉霞等[8]在研究中采用HPLC對復(fù)方萘甲唑林滴眼液中鹽酸萘甲唑林和馬來酸氯苯那敏含量予以檢測，將0.05 mol/L磷酸二氫鉀作為流動相，設(shè)置流速及進樣量分別為0.8 ml/min、5 μl，柱溫以40 ℃為宜，結(jié)果顯示，鹽酸萘甲唑啉流出時間為4.758 min，馬來酸氯苯那敏為7.364 min，且回收率均在97%以上，最終得出結(jié)論：HPLC操作簡單、準確率高，能夠?qū)崿F(xiàn)對藥品含量的準確檢測。美國藥典首次將HPLC作為法定分析方法僅有6個項目，隨著不斷改進及升級，逐漸增加至418項，截至23版美國藥典已經(jīng)收載項目達到2 000項以上[9]。我國藥典中關(guān)于HPLC的收集品種也在不斷增加，HPLC在檢驗抗生素及激素類化學(xué)藥品中的應(yīng)用范圍不斷擴大。HPLC指標已經(jīng)成為反映世界藥典水平的先進指標。

2.2 有關(guān)物質(zhì)檢驗

近年來，臨床對藥品質(zhì)量以及相關(guān)物質(zhì)檢驗有著越來越高的要求。通常，藥物應(yīng)用經(jīng)過了原料合成、制劑制備、貯備、運輸以及臨床應(yīng)用等多個環(huán)節(jié)，是一個漫長的、復(fù)雜的過程，任何一個環(huán)節(jié)都可能產(chǎn)生相關(guān)的物質(zhì)。藥品生產(chǎn)過程中會導(dǎo)致原料、試劑以及副產(chǎn)物等的帶入。藥品貯備及運輸期間會產(chǎn)生聚合物、降解產(chǎn)物，因此，藥品的生產(chǎn)及應(yīng)用不僅要考慮其安全性，而且要結(jié)合生產(chǎn)實際。臨床在藥物安全方面有一定的要求，允許有一定的無害有關(guān)物質(zhì)或低毒性物質(zhì)。但藥品毒性必須控制在一定的范圍內(nèi)，對于危害人體健康或影響藥物穩(wěn)定性的物質(zhì)要加以嚴格控制。由于藥品相關(guān)物質(zhì)含量微小，因此選擇一種科學(xué)、精準、敏感性高的檢驗方法尤為重要。

國外學(xué)者根據(jù)性質(zhì)及來源的不同，將藥品中化學(xué)雜質(zhì)分為有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)以及殘留溶液，檢查項目多包括原料、副產(chǎn)物、異構(gòu)體以及降解產(chǎn)物等[10]。以卡托普利片及甲硝唑片藥品檢驗為例，除對相關(guān)物質(zhì)進行檢驗外，還存在部分未知雜質(zhì)，難以確定其性質(zhì)，可采用HPLC檢驗，其不僅能夠避免高含量雜質(zhì)的影響，而且能夠避免紫外線吸收問題，檢測準確性高。何天碧[11]在研究中采用反相HPLC測定甲硝唑口腔粘貼片的有關(guān)物質(zhì)，選擇流動相為甲醇-水（20∶80），流速設(shè)置為1.0 ml/min，檢測波長為325 nm，結(jié)果顯示甲硝唑原料及甲硝唑口腔粘貼片雜質(zhì)含量均為0.018%，提示制劑過程中未發(fā)生明顯的變化，符合藥品質(zhì)量要求。在2002年《中華人民共和國藥典》中，采用薄層色譜法（TLC）檢測鹽酸雷尼丁不僅操作復(fù)雜，而且重復(fù)性差。國外學(xué)者在研究中采用HPLC檢測鹽酸雷尼丁，選擇C18柱作為色譜柱，將0.05 mol/L乙腈以及檸檬酸溶液作為流動相，設(shè)置檢測波長為315 nm，結(jié)果顯示該藥物在82～320 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，該檢測方法避免了傳統(tǒng)薄層色譜檢驗的不足[12]。

2.3 中藥成分檢驗

HPLC應(yīng)用于中藥成分檢驗主要是通過化學(xué)手段對復(fù)雜成方制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分進行分析的過程。作為一個多成分復(fù)雜體系，中藥呈現(xiàn)出多效性與平衡調(diào)節(jié)性。有學(xué)者認為中藥采用多種化學(xué)成分進行配伍，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物療效的最大化，可用于對疑難雜癥的治療[13]。但中藥成分的復(fù)雜性與多樣性也增加了其檢驗及成分分析的復(fù)雜性與難度。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，HPLC在中藥成分檢驗中得以應(yīng)用，其不僅能夠有效測定出中藥材及中成藥中的有效成分，而且推動了中藥的發(fā)展，提升了中藥質(zhì)量規(guī)范化。目前，HPLC已經(jīng)逐漸取代了傳統(tǒng)薄層色譜法，在中藥成分檢驗中應(yīng)用廣泛。許曉嘉等[14]在研究中采用HPLC對中藥菟絲子中黃酮類成分含量進行檢驗，選擇C18色譜柱，將甲醇-0.4%磷酸作為流動相，設(shè)置檢測波長為360 nm，結(jié)果顯示菟絲子中藥中5種化學(xué)成分在對應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率達到98%以上，體現(xiàn)了HPLC檢驗方法較好的重現(xiàn)性、準確性，該方法能夠廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價中。

2.4 抗生素類藥品檢驗

隨著抗生素在臨床上應(yīng)用的增多，抗生素藥品的安全檢驗工作也受到了醫(yī)學(xué)界的高度重視。抗生素類藥物所引起的不良反應(yīng)很大程度上是由于原料中間體、聚合產(chǎn)物、降解產(chǎn)物引起的，因此必須加強對抗生素類藥品的雜質(zhì)檢測與控制。學(xué)者王啟光[15]在研究中采用HPLC對注射用鹽酸頭孢吡肟中精氨酸含量予以檢測，設(shè)置磷酸二氫鈉-甲醇（96∶4）作為流動相，流速設(shè)置為1.0 ml，波長為206 nm，結(jié)果顯示精氨酸在0.3～1.4 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，回收率達99.17%，體現(xiàn)了該檢驗方法的準確性與良好的可重復(fù)性。

3 HPLC技術(shù)在藥品檢驗中的應(yīng)用進展

隨著現(xiàn)代醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)的進步，HPLC技術(shù)不斷優(yōu)化、提升，尤其是有關(guān)先進檢測儀器的應(yīng)用，更是擴大了HPLC的適用范圍，其與質(zhì)譜技術(shù)、柱切換技術(shù)等聯(lián)合應(yīng)用；在現(xiàn)代分子藥理學(xué)、生物學(xué)的支持下，應(yīng)用范圍越來越廣，未來HPLC技術(shù)將會在藥品質(zhì)量管理中發(fā)揮巨大的作用。不僅如此，超高效液相色譜將會成為HPLC的重要發(fā)展方向，融入快速檢測技術(shù)及其他先進技術(shù)，HPLC靈敏度以及分析通量會得到顯著提升。

綜上所述，HPLC技術(shù)在藥品檢驗領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)成為不可阻擋的趨勢，在藥品含量檢測、有關(guān)物質(zhì)檢驗中將發(fā)揮極為重要的作用，并促進藥品質(zhì)量的提升。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，HPLC在藥品檢驗中應(yīng)用前景廣闊，應(yīng)加強有關(guān)新技術(shù)開發(fā)與探索，充分利用HPLC技術(shù)發(fā)揮其作用，提高藥品檢驗規(guī)范化，為醫(yī)學(xué)界做出貢獻。