欒俊家，張尚悅 ，李昂達(dá)，李學(xué)鵬, ，勵(lì)建榮，林 洪，王明麗，郭曉華，于建洋，周小敏

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧錦州 121013；2.海軍大連艦艇學(xué)院航海系，遼寧大連 116018；3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266100；4.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東煙臺 265600；5.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東日照 276815；6.榮成泰祥食品股份有限公司，山東威海 264300；7.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江舟山 316120）

秋刀魚（Cololabis saira）隸屬于頜針魚目（Beloniformes）、竹刀魚科（Scomberesocidae）、秋刀魚屬（Cololabis Gill），是中上層魚類，主要分布于北太平洋海域[1?2]，中國則主要分布在山東東岸和黃海兩個(gè)海域。近年來我國秋刀魚年漁獲量達(dá)到9萬噸左右[3]。隨著捕獲量的增加，秋刀魚的加工利用逐漸引起人們的關(guān)注。MORI等[4]首次從秋刀魚魚鱗中純化鑒定出Ⅰ型膠原蛋白。陳建文等[5]發(fā)現(xiàn)秋刀魚酶解產(chǎn)物中含有大量具有較高營養(yǎng)價(jià)值的氨基酸，具有良好的營養(yǎng)保健功能。趙謀明等[6]應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化分析了酶解秋刀魚制備黃嘌呤氧化酶抑制肽的工藝條件。

海洋魚蛋白源抗氧化活性肽可以通過不同的途徑清除外源性和內(nèi)源性自由基，且具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類多、活性強(qiáng)和副作用少等優(yōu)勢。目前，抗氧化活性肽有多種制備方法[7?10]。蛋白酶水解法與其它方法相比，條件溫和、成本較低、過程可控且副產(chǎn)物較少，目前被廣泛應(yīng)用[11?12]。從魚皮明膠酶解液中分離純化出的Gly-Pro-Y型和X-Hyp-Gly型肽段具有較高的抗氧化活性，且能夠顯著改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的臨床癥狀[13]。從藍(lán)鰭金槍魚頭酶解液中分離純化出的三種肽段（Trp-Glu-Gly-Pro-Lys、Gly-Pro-Pro和Gly-Val-Pro-Leu-Thr），經(jīng)測定具有較高的抗氧化活性[14]。

鑒于此，本文以秋刀魚肌肉為原料，采用酶解法制備抗氧化活性肽。首先從六種商用蛋白酶中篩選出合適的蛋白酶，在此基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)方法對秋刀魚酶解制備抗氧化活性肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對最優(yōu)條件下制得的酶解液進(jìn)行分子量分布的測定和游離氨基酸含量的測定。以期為秋刀魚高值化利用和多肽類功能性食品的開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍秋刀魚 購于山東青島果蔬馨旗艦店，去頭、去尾、去內(nèi)臟、去骨，清洗干凈后，絞成肉糜，備用；中性蛋白酶（20萬 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g）

合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；風(fēng)味蛋白酶（3萬 U/g）、胰蛋白酶（25萬 U/g）、木瓜蛋白酶（80萬 U/g）、菠蘿蛋白酶（60萬 U/g）、維生素C（抗壞血酸）、1,10-菲羅啉 Solarbio（索萊寶）公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 福州飛凈生物科技有限公司；七水合硫酸亞鐵、焦性沒食子酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫（30%） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；鐵氰化鉀 福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、FeCl3上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

TH2-82A雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器 上海梅香儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)、LC-20A型高效液相色譜儀 日本島津公司；SORVALL Stratos型冷凍高速離心機(jī) 美國Thermo公司；MSl05DU型分析天平、PL602-L型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FE-20FiveEasy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；JB-1A磁力攪拌器 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FreeZone 2.5型真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 HITACHI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秋刀魚基本成分的測定 水分的測定：參考GB5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》。

灰分的測定：參考GB5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》。

蛋白質(zhì)的測定：參考GB5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》。

脂肪的測定：參考GB5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》。

1.2.2 蛋白酶的篩選 秋刀魚酶解液工藝制作流程：秋刀魚肉糜→加去離子水→調(diào)節(jié)至最適pH→酶解→滅酶→離心→抽濾→酶解液→冷凍干燥→凍干粉。選擇六種酶制劑對秋刀魚肉糜進(jìn)行酶解，酶解條件見表1。酶解結(jié)束后，于100 ℃水浴加熱20 min滅酶，然后在4 ℃，8000 r/min條件下離心10 min，取上清液抽濾去除懸浮物及殘?jiān)?，得到酶解液。綜合考察水解度（DH）、TCA-可溶性肽含量以及抗氧化活性等指標(biāo)，篩選出合適的蛋白酶。

表1 蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of proteases

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 固定因素水平為料液比為1:3 g/mL，酶添加量為0.4%，酶解時(shí)間為4 h，溫度為50 ℃，pH7.0。通過測定酶解液的DH、DPPH自由基清除率和Fe3+還原力來研究料液比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL）、酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、溫度（40、45、50、55、60 ℃）和pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對秋刀魚酶解工藝的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、酶添加量、酶解時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以DPPH自由基清除率和Fe3+還原力為指標(biāo)，優(yōu)化秋刀魚制備抗氧化活性肽的最佳酶解工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 DH的測定 秋刀魚酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的測定參考GB5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，總氮含量的測定參考GB5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》，根據(jù)式（1）計(jì)算DH。

1.2.6 TCA-可溶性肽含量的測定 參考朱均旺等[15]的研究方法并稍作修改，吸取5 mL秋刀魚酶解液，加入等體積15% TCA，混合均勻，于室溫靜置30 min后離心（4 ℃，5000 r/min，15 min），吸取1 mL上清液，加入3 mL雙縮脲，室溫下靜置10 min后，在540 nm下測量樣品吸光值，按照回歸方程y=0.052x+0.023（R2=0.9924）計(jì)算TCA-可溶性肽含量。

1.2.7 DPPH自由基清除率的測定 參考XIE等[16]的研究方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取7.92 mg DPPH，使用95%乙醇定容至100 mL；取2 mL秋刀魚酶解液（20 mg/mL），加入2 mL DPPH，在517 nm下測量吸光值A(chǔ)1；對照組1取2 mL秋刀魚酶解液，加入2 mL 95%乙醇，在517 nm下測量吸光值A(chǔ)2；對照組2取2 mL DPPH，加入2 mL蒸餾水，在517 nm下測量吸光值A(chǔ)3；調(diào)零組取2 mL蒸餾水，加入2 mL 95%乙醇；室溫下避光靜置30 min，按式（2）計(jì)算樣品的清除率。

1.2.8 Fe3+還原力的測定 參考LI等[17]的研究方法并稍作修改，將2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L pH6.6）、2 mL 1%鐵氰化鉀以及2 mL秋刀魚酶解液（20 mg/mL）混合均勻，置于50 ℃水浴中平衡20 min，加入2 mL 10% TCA，4 ℃、3000 r/min，離心10 min，取2 mL上清液，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵，10 min后在700 nm下測量吸光值。

1.2.9 ·OH清除率的測定 參考陳秋娟等[18]的研究方法并稍作修改，將1 mL 1,10-菲羅啉溶液（2.5 mmol/L）、1 mL PBS（20 mmol/L，pH7.4）與1 mL蒸餾水，混合均勻，加入1 mL FeSO4（2.5 mmol/L）與1 mL H2O2（20 mmol/L），37 ℃水浴平衡90 min，在536 nm下測量吸光值，記為A1；空白組使用1 mL蒸餾水代替H2O2，記為A0；樣品組使用1 mL樣品溶液（20 mg/mL）代替蒸餾水，記為A2；按式（3）計(jì)算樣品的清除率。

1.2.10 O2?·清除率的測定 參考宋春艷等[19]的研究方法并稍作修改，取2 mL Tris-HCl（150 mmol/L，pH8.0）與0.6 mL樣品溶液（20 mg/mL）混合均勻，25 ℃預(yù)熱20 min，加入0.4 mL焦性沒食子酸（1.2 mmol/L），25 ℃水浴平衡20 min，在325 nm下測量吸光值，記為A11；對照組1使用等量蒸餾水代替焦性沒食子酸，記為A10；對照組2使用等量蒸餾水代替樣品，記為A01；空白組分別使用等量蒸餾水代替樣品和焦性沒食子酸，記為A00；按式4計(jì)算樣品的清除率。

1.2.11 秋刀魚酶解液分子量分布的測定 參考GB31645-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》。準(zhǔn)確稱取1.00 g酶解液凍干粉，用1 mL流動(dòng)相溶解，高速離心，取上清液進(jìn)樣檢測。檢測條件為色譜柱型號：Shodex Asahi pak GS-320 HQ No.R2870036，流動(dòng)相：乙腈:水:三氟乙酸（40:60:0.05），流速：0.5 mL/min，柱溫箱：30 ℃，檢測波長：220 nm，各標(biāo)準(zhǔn)品分子量：MW12500、MW6500、MW1450、MW451、MW189。

1.2.12 秋刀魚酶解液游離氨基酸含量的測定 參考陳劍嵐[20]的研究方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取2.00 g秋刀魚酶解液凍干粉，加入15 mL 15%的TCA，混合均勻，靜置2 h，在4 ℃、10000 r/min條件下離心15 min，取上清液5 mL，用3 mol/L NaOH將pH調(diào)為2.0，定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后上機(jī)檢測。

氨基酸自動(dòng)分析儀條件：色譜柱（4.6 mm I.D.×60 mm）；分離樹脂：陽離子交換樹脂；柱溫：57 ℃；檢測波長：570 nm；管路一緩沖液流速：0.4 mL/min；管路二緩沖液流速：0.35 mL/min；反應(yīng)液：茚三酮；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測定3次，采用Excel 2016和IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行處理，結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式，均值比較采用ANOVA中的Duncan法進(jìn)行比較，取95%置信度（P<0.05）。采用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面方差分析采用軟件Design-Expert 8.0.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋刀魚的基本組成成分

由表3可知，秋刀魚肌肉中水分含量約為60.32%，灰分含量約為1.02%，蛋白質(zhì)含量約為18.12%，脂肪含量約為20.48%。由此可見，秋刀魚是一種高蛋白質(zhì)、高脂肪含量的魚類。這與葉旭昌等[21]的研究結(jié)果相似但稍有差異，可能是由于秋刀魚的生長環(huán)境和年齡的差異所致。

表3 秋刀魚的基本組成成分Table 3 The basic components of Pacific saury

2.2 蛋白酶的篩選

酶解可以將蛋白質(zhì)水解成小分子物質(zhì)，DH是衡量酶解效果的重要指標(biāo)之一[22]。由圖1（A）可知，中性蛋白酶處理組DH達(dá)22.4%，顯著高于其它處理組（P<0.05），而胰蛋白酶處理組DH最低，為15.8%。這是因?yàn)橹行缘鞍酌该盖形稽c(diǎn)較為廣泛，能夠酶解R1為Ala、Leu、Val、Tyr、Phe和Trp殘基的肽鍵[23]，而胰蛋白酶是一種Ser內(nèi)切酶，只能酶解R1為Arg或Lys殘基的肽鍵[24]。

三氯乙酸（TCA）能夠溶解小分子蛋白質(zhì)或肽段，大分子蛋白質(zhì)或肽段會在TCA的作用下變成白色沉淀，TCA-可溶性肽含量是表征酶解效果的重要指標(biāo)[25]。由圖1（A）可知，中性蛋白酶處理組TCA-可溶性肽含量達(dá)14.22 mg/mL，顯著高于其它處理組（P<0.05），風(fēng)味蛋白酶處理組TCA-可溶性肽含量最低，為13.3 mg/mL。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后，以小分子肽或者游離氨基酸的形式存在，因此，DH較高的組分，蛋白質(zhì)水解較為充分，其TCA-可溶性肽含量也較高[26]。

DPPH自由基清除率是一種常用的測定化合物和食品抗氧化能力的方法。由圖1（B）可知，中性蛋白酶處理組DPPH自由基清除率顯著高于其它處理組（P<0.05），約為89.2%，堿性蛋白酶處理組DPPH自由基清除率最低，約為74.7%。這與夏吉安等[27]的研究結(jié)果相似。

還原力與抗氧化活性之間存在一定的聯(lián)系，抗氧化劑通過還原作用清除自由基，因此，還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)[28]。由圖1（B）可知，中性蛋白酶處理組的Fe3+還原力顯著高于其它處理組（P<0.05），為0.68。胰蛋白酶處理組的Fe3+還原力最低，為0.52。這與寧詩文等[29]的研究結(jié)果相似。

過量的·OH會對人體產(chǎn)生巨大的危害，它通過電子的轉(zhuǎn)移、奪取氫原子等方式對蛋白質(zhì)及脂質(zhì)進(jìn)行氧化，因此，·OH清除率是評價(jià)樣品抗氧化強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一[30]。由圖1（C）可知，中性蛋白酶處理組的·OH清除率顯著高于其它處理組（P<0.05），為66.5%。胰蛋白酶處理組·OH清除率最低，為41.7%。這與王志等[31]的研究結(jié)果相似。

圖1 不同種類蛋白酶處理組酶解液的水解度、TCA-可溶性肽含量和抗氧化能力Fig.1 The degree of hydrolysis, the content of TCA-soluble peptide and the antioxidant capacity of the hydrolysate treated by different kinds of protease

O2?·可導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，從而引起一系列的有害反應(yīng)。但在人體中，O2?·在超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的催化作用下會生成氧氣和水，從而降低其對生物體的損害[32]。由圖1（C）可知，中性蛋白酶處理組O2?·清除率為81.7%，顯著高于其它處理組（P<0.05）。這與黃典等[33]的研究結(jié)果相似。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 料液比對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著料液比的增大，秋刀魚酶解液DH、DPPH自由基清除率和Fe3+還原力呈先升高后下降的趨勢，這是因?yàn)殡S著料液比的增大，底物與酶能夠充分接觸，從而提高酶解效率。但當(dāng)反應(yīng)體系中溶劑含量過高時(shí)，底物會被稀釋，增大了酶與底物的接觸難度，導(dǎo)致體系酶解不完全。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取料液比為1:3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 料液比對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of solid to liquid ratio on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.3.2 酶添加量對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 酶添加量對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著酶添加量的增加，秋刀魚酶解液DH呈逐漸上升趨勢。酶解液抗氧化能力隨著酶添加量的增加先升高后下降。這是因?yàn)殡S著酶添加量的增加，酶與底物接觸更加充分，但酶添加量過多時(shí)，會使底物發(fā)生過度水解，導(dǎo)致酶解液中抗氧化活性肽的降解。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取酶添加量為0.6%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶添加量對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of quantity of enzyme on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.3.3 酶解時(shí)間對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 酶解時(shí)間對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的增加，秋刀魚酶解液DH逐漸升高，DPPH自由基清除率和Fe3+還原力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。這是因?yàn)?，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解程度逐漸加深，但酶解時(shí)間過長，會導(dǎo)致底物過度水解，造成抗氧化活性肽的過度降解和低活性氨基酸的生成[34]。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取酶解時(shí)間為

圖4 酶解時(shí)間對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of hydrolysis time on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

4 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.4 溫度對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響 溫度對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨著溫度的升高，秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著溫度的升高，酶活力開始提高，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，但溫度過高會降低蛋白酶活力。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取溫度為50 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 溫度對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of temperature on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.3.5 pH對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響

pH對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，隨著pH的增加，秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，這是因?yàn)閜H過高或過低都會破壞蛋白酶活性中心或空間結(jié)構(gòu)[35]。綜合酶解液的DH和抗氧化能力，選取pH7.0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 pH對秋刀魚酶解液DH和抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of pH on the DH and antioxidant capacity of Pacific saury hydrolysates

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

選取料液比（A）、酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）3個(gè)因素，以DPPH自由基清除率（R1）和Fe3+還原力（R2）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，分析酶解秋刀魚制備抗氧化活性肽的最佳工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Program and experimental results of response surface methodology

運(yùn)用 Design-Expert.V8.0.6軟件，對響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合，得到DPPH自由基清除率（R1）和Fe3+還原力（R2）的回歸方程：

由表5可知，模型F值分別為18.35和29.43，“Prob>F”值均小于0.05，表明該二次方程模型顯著。失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著。決定系數(shù)R2分別為0.9593和0.9743，說明預(yù)測值與實(shí)測值之間具有較高的相關(guān)性。RAdj2=0.9071和0.9411，說明所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?。因此可用該回歸方程對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測分析。從表5可以看出，各個(gè)因素對DPPH自由基清除率和Fe3+還原力的影響不是簡單的線性關(guān)系。由F值可知，三個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大小依次為料液比>酶添加量>酶解時(shí)間。響應(yīng)面可以直觀地反映出各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，曲面的坡度則表示兩因素之間交互影響的大小[36]。為了更加直觀的表現(xiàn)2個(gè)因素同時(shí)對DPPH自由基清除率和Fe3+還原力的影響，繪制響應(yīng)面圖（如圖7）。由圖7可以看出，料液比和酶添加量、料液比和酶解時(shí)間、酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用不顯著。經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件分析該模型得到的最佳酶解條件為料液比1:2.67、酶添加量0.60%、酶解時(shí)間4.04 h、溫度50 ℃、pH7.0。在此條件下，計(jì)算出酶解液DPPH自由基清除率為92.57%、Fe3+還原力為0.716。

圖7 各因素之間交互作用的曲面圖Fig.7 Surface diagrams for interaction of two different factors

表5 DPPH自由基清除率和Fe3+還原力的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the response surface quadratic model for DPPH free radical scavenging rates and Fe3+reducing powers

使用由Design Expert 8.0.6軟件計(jì)算得到的最優(yōu)酶解條件對秋刀魚進(jìn)行酶解，從而驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性。工藝參數(shù)為：料液比1:2.67、酶添加量0.6%、酶解時(shí)間4.04 h、溫度50 ℃、pH7.0。在該條件下得到的酶解液的DPPH自由基清除率為（92.33%±0.68%），F(xiàn)e3+還原力為0.711±0.012，與預(yù)測值無顯著性差異（P>0.05）。

2.5 秋刀魚酶解液分子量的分布情況

圖8為最佳酶解工藝條件下制得的秋刀魚酶解液分子量的分布情況。由圖8可知，酶解液的分子量在<3000 Da范圍內(nèi)的組分占97.87%，這一組分的肽段對酶解液的營養(yǎng)價(jià)值和生物活性起著重要的作用[37]。

圖8 秋刀魚酶解液分子量分布Fig.8 Molecular weight distributions profile of Pacific saury hydrolysate

2.6 秋刀魚酶解液中游離氨基酸的含量

表6為秋刀魚酶解液中游離氨基酸的含量。由表6可知，酶解液中共檢測到16種游離氨基酸，其中，必需氨基酸含量占39.79%，支鏈氨基酸占17.21%，抗氧化活性氨基酸占37.01%。組氨酸含量最高，為322.63 mg/100 mL。組氨酸對于嬰兒來說屬于必需氨基酸，對嬰兒的生長發(fā)育至關(guān)重要。此外，組氨酸能夠促進(jìn)氨基酸與血紅蛋白的結(jié)合，使腎原性貧血減輕，所以組氨酸也是尿毒癥患者的必需氨基酸?？梢?，秋刀魚酶解液具有較高的營養(yǎng)保健功能。

表6 秋刀魚酶解液中游離氨基酸含量Table 6 Free amino acid contents of Pacific saury hydrolysate

3 結(jié)論

綜合DH、TCA-可溶性肽含量和抗氧化活性等指標(biāo)，從六種商用蛋白酶中篩選出中性蛋白酶作為秋刀魚酶解用酶。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面分析方法對酶解秋刀魚制備抗氧化活性肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)：料液比為1:2.67、酶添加量為0.60%、酶解時(shí)間為4.04 h、溫度為50 ℃、pH7.0。在此條件下，酶解液的DPPH自由基清除率為92.33%，F(xiàn)e3+還原力為0.711（20 mg/mL）各因素對酶解液的抗氧化活性影響大小為料液比>酶添加量>酶解時(shí)間。通過測定分子量分布和游離氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)條件下酶解液分子量<3000 Da的組分占97.87%，是酶解液的主要成分。共檢測出16種游離氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸含量的39.79%，抗氧化活性氨基酸占總氨基酸含量的37.01%。本研究為秋刀魚的高值化利用和多肽類功能性食品的研發(fā)提供了參考依據(jù)。下一步將會對秋刀魚酶解液進(jìn)行分離純化，并對抗氧化活性較強(qiáng)的組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，以期得到全新的抗氧化活性肽段，豐富抗氧化活性肽的種類。